IL-2受体复合物及其制备方法与应用

文献发布时间：2023-06-19 10:25:58

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及IL-2受体复合物及其制备方法与应用。

背景技术

Interleukin-2（IL-2）是最早发现的细胞因子之一，又称为T细胞生长因子（Tcell growth factor,TCGF）。1976年NCI肿瘤细胞生物学实验室的RobertGallo，使用PHA刺激淋巴细胞产生条件培养基培养骨髓细胞，发现其中90%的T细胞长达9个月的生存维持。而在此之前，原代T细胞无法进行体外培养，是免疫学发展中的瓶颈性技术问题。该支持T细胞长期生长的物质被称为T细胞生长因子（TCGF），也就是IL-2。IL-2对T细胞的增殖、发育、分化和凋亡具有重要的作用。

IL-2的受体interleukin-2 receptor(IL-2R)包含α、β和γ三个亚单位。三个亚单位可以组成不同亲和力的受体，其中，单独的α为低亲和力受体，单独存在不参与信号传导，β和γ组成中等亲和力的受体，下游可以通过JAK传导信号，在α参与的情况下，亲和力增强为高亲和力受体。IL-2与其受体特异性结合后，启动Jak-STAT、MAPK及P13K等多种途径，抑制凋亡，诱导细胞增殖、分化，产生多种生物学效应。从20世纪90年代起，科研人员开始通过突变IL-2和不同受体亚单位的亲和力，或制备针对IL-2受体的抗体，以达到抗肿瘤或治疗自身免疫疾病的临床治疗效果。

尽管IL-2Rα、β和γ可形成对IL-2高亲和力的受体复合物，但α亚单位与β、γ亚单位形成受体复合物时并没有直接接触。根据结构报道，α位于IL-2的一侧，而β和 γ形成”Y”形，位于IL-2的另一侧（Xinquan Wang et al.,2005, Science. 310(5751):1159-63.）。因此在没有IL-2存在时，α、β和γ无法直接形成高亲和力的IL-2受体复合物。这也限制了针对IL-2R αβγ异源三聚体的抗体制备等应用。

发明内容

本发明的目的是提供IL-2受体复合物（IL-2受体αβγ异源三聚体复合物）及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种IL-2受体复合物，其是将编码融合蛋白I、融合蛋白II的核酸序列构建到同一真核表达载体或分别构建到不同真核表达载体上，用所得重组表达载体转染哺乳动物细胞，并从细胞培养上清中分离纯化得到的。

其中，所述融合蛋白I是由IL-2R β亚单位或其变体与异源二聚元件1之间通过柔性linker连接而成；

所述融合蛋白II是先将IL-2R α亚单位或其变体与IL-2R γ亚单位或其变体之间先通过柔性linker连接，再与异源二聚元件2之间通过柔性linker连接而成；

任选地，所述融合蛋白I、融合蛋白II的C端含有纯化标签（如抗体Fc标签或其他亲和标签）；

其中，所述异源二聚元件1为Fc-Knob，异源二聚元件2为Fc-Hole；或者，

所述异源二聚元件1为Fc-Hhole，异源二聚元件2为Fc-Knob；或者，

所述异源二聚元件1为序列如SEQ ID NO:5所示的亮氨酸拉链，异源二聚元件2为序列如SEQ ID NO:6所示的亮氨酸拉链；或者，

所述异源二聚元件1为序列如SEQ ID NO:6所示的亮氨酸拉链，异源二聚元件2为序列如SEQ ID NO:5所示的亮氨酸拉链。

所述柔性linker为(G

优选地，所述融合蛋白I是由IL-2R β亚单位或其变体与异源二聚元件1之间先通过(G

优选地，所述融合蛋白II是先将IL-2R α亚单位或其变体与IL-2R γ亚单位或其变体之间先通过(GS)

更优选地，所述融合蛋白I包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i）如SEQ ID NO:1或7所示的氨基酸序列；或

ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii）i）或ii）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

更优选地，所述融合蛋白II包含如下的氨基酸序列或由其组成：

iv）如SEQ ID NO:3或9所示的氨基酸序列；或

v）在iv）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

vi）iv）或v）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

第二方面，本发明提供编码所述IL-2受体复合物的核酸分子。

第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供IL-2受体复合物的制备方法，包括以下步骤：

1）分别构建融合蛋白I、融合蛋白II的重组表达载体；

2）将两个重组表达载体共同转染哺乳动物细胞；

3）从细胞培养上清中分离纯化得到IL-2受体复合物。

本发明中，所述重组表达载体的启动子可选自EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、hCMV（human cytomegalovirus）启动子、SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为pcDNA3.1(+)。

本发明中，所述哺乳动物细胞可选自中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamsterovary，CHO），小鼠浆细胞瘤细胞（A non-Ig secreting, non-light chain-synthesizingsubclone of NS-1, NSO），幼年仓鼠肾细胞（baby hamster kidney，BHK），人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293）等，优选HEK293细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，使用PEI转染试剂将构建好的融合蛋白I重组表达载体和融合蛋白II重组表达载体按照1:1的质量比转染HEK293细胞，进行异源三聚体的重组表达。

本发明利用基因工程方法设计和制备稳定的IL-2受体αβγ异源三聚体蛋白。如图1所示：先将β亚单位与异源二聚元件Fc-Knob通过基因工程的方法设计为一条串联的多肽链，为融合蛋白Ⅰ，将α亚单位、γ亚单位以及异源二聚元件Fc-Hole通过基因工程的方法设计为一条串联的多肽链，为融合蛋白Ⅱ，然后再将包含两个融合蛋白的质粒共同转染HEK293细胞，利用Fc-Knob和Fc-Hole异源二聚化的能力，从而获得IL-2受体αβγ异源三聚体复合物。

第五方面，本发明提供所述IL-2受体复合物或或按照上述方法制备的IL-2受体复合物在抗IL-2R抗体筛选中的应用（含非疾病诊断和治疗目的）。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明利用基因工程技术，通过重组表达直接获得IL-2受体αβγ异源三聚体蛋白，无需体外组装。

（二）使用HEK293真核表达系统可在短时间内获得大量SDS-PAGE电泳纯度高达98%以上、HPLC纯度高达90%的异源三聚体蛋白，且与IL-2有高亲和活性。

（三）目的蛋白表达和纯化过程操作简单，可重复性高，可实现大规模生产制备。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白设计示意图。

图2为表达载体pcDNA3.1图谱。

图3为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白SDS-PAGE图，其中，泳道1为IL-2R αβγ异源三聚体蛋白，泳道2为蛋白Marker。

图4为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白HPLC检测结果图。

图5为本发明较佳实施例中利用ELISA方法检测IL-2R αβγ异源三聚体蛋白与interleukin-2结合活性的检测结果图。

图6为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测原理示意图。

图7A为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2的结合亲和力结果图。

图7B为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2Rβγ与IL-2的结合亲和力结果图。

图7C为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2Rα与IL-2的结合亲和力结果图。

图7D为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2Rβ与IL-2的结合亲和力结果图。

图7E为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2Rγ与IL-2的结合亲和力结果图。

图8为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白设计示意图。

图9为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白SDS-PAGE图，其中，泳道1为IL-2R αβγ异源三聚体蛋白，泳道2为蛋白Marker。

图10为本发明较佳实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白HPLC检测结果图。

图11为本发明较佳实施例中利用SPR技术检测IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2的结合亲和力结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 重组表达载体的构建

融合蛋白I重组表达载体pHEK-B1的构建：由上海生物工程有限公司合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的多核苷酸（编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示），并在5’末端添加限制性内切酶BamH Ⅰ酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶Xho Ⅰ酶切位点。合成产物用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1(+) (Invitrogen公司，货号：V790-20)（图2）连接，构建重组真核表达载体pHEK-B1，转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。

融合蛋白II重组表达载体pHEK-AG1的构建：由上海生物工程有限公司合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3的多核苷酸（编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示），并在5’末端添加限制性内切酶BamH Ⅰ酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶Xho Ⅰ酶切位点。合成产物用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1(+) (Invitrogen公司，货号：V790-20)（图2）连接，构建重组真核表达载体pHEK-B1，转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。

实施例2 重组表达载体转染HEK293细胞并表达IL-2R αβγ异源三聚体蛋白

使用PEI转染试剂将构建好的重组质粒pHEK-B1和pHEK-AG1按照1:1的质量比转染HEK293细胞，进行异源三聚体的重组表达。转染前一天将HEK293细胞按照1×10

根据细胞密度计算转染复合物中各组分的用量：质粒剂量与细胞的数量对应关系为1×10

根据上述计算得到的组分用量配制转染复合物：将25ug浓度为200 ug/mL的重组质粒pHEK-B1和25ug浓度为200 ug/mL的重组质粒pHEK-AG1加入CD 293 TGE培养基至0.5mL（A液），150 ug浓度为1 mg/mL的PEI转染试剂加入CD 293 TGE培养基至0.5ml（B液），分别混匀后，将B液缓慢加入至A液中，混匀室温静置10-15 min后，将转染混合液缓慢滴加入10mL HEK293细胞中。37℃，5%CO

实施例3 IL-2R αβγ异源三聚体蛋白的分离纯化

使用Protein A亲和层析的方法对实施例2制备的异源三聚体重组蛋白进行分离纯化：4℃，1000g离心30 min收集细胞培养上清，将上清过滤后结合预先用结合缓冲液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl, pH 8.0）平衡的Protein A层析柱（思拓凡生物工程科技(广州)有限公司，货号：17543803），然后用洗脱缓冲液（100 mM甘氨酸，150 mM NaCl，pH3.5）洗脱目标蛋白，收集蛋白洗脱液后加入1/40体积的中和缓冲液（2M Tris-HCl，pH8.0）进行中和，并进行SDS-PAGE（图3）和HPLC分析（图4）。根据SDS-PAGE结果，纯化后的两条带分别位于66KDa和116KDa附近，符合蛋白（Ⅰ）和蛋白（Ⅱ）的理论分子量大小，且纯度高达98%以上。根据HPLC分析结果，异源三聚体复合物纯度高达90%以上。

实施例4 IL-2R αβγ异源三聚体蛋白与IL-2的结合活性检测

本实施例中采用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法检测本发明IL-2R αβγ异源三聚体复合物与IL-2的结合活性。

1、包被：用0.1μg/孔（1μg/ml，100μl/孔）的IL-2（AcroBiosystems公司，货号：IL2-H4113）包被96孔板（Corning公司，货号：42592），在4℃包被过夜（或16 h）。IL-2稀释所用包被缓冲液为15 mM Na

2、洗涤：用每孔300μl的洗涤缓冲液（TBS，0.05%Tween-20，pH7.4）洗涤孔4次。注：彻底清除洗涤缓冲液很关键。洗完之后通过抽吸除去残留的溶液，并确保其完全干燥。

3、封闭：在37℃条件下，每孔用300μl封闭缓冲液（TBS，0.05％Tween-20，2%BSA，pH7.4）封闭1.5 h。

4、洗涤：重复步骤2。

5、添加样品：每孔加入100μl 0.0976563-100 ng/ml实施例3制备的IL-2R αβγ异源三聚体复合物，37℃孵育1h。样品提前用稀释缓冲液（含有0.05% Tween-20和0.5% BSA的TBS缓冲液，pH7.4）进行稀释。

6、洗涤：重复步骤2。

7、添加检测抗体：向每个孔中加入100μl anti-human IgG抗体（Jackson，货号：109-035-098），37℃孵育1 h。抗体提前用稀释缓冲液（含有0.05% Tween-20和0.5% BSA 的TBS缓冲液，pH7.4）以1:20000比例进行稀释；

8、洗涤：重复步骤2。

9、添加底物：向各孔中加入200μl底物溶液，37℃孵育20 min。避光。底物溶液配置：在10 ml底物溶液（50 mM Na

10、终止反应：向各孔中加入1M硫酸50μl。

11、读取OD值：在450 nm处读取OD值，然后OD

ELISA检测结果如图5所示，本发明IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2结合的EC50值为6.68ng/ml，表明本发明的IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2具有很好的结合活性。

实施例5 IL-2R αβγ异源三聚体蛋白与IL-2的结合亲和力检测

本实施例中采用SPR (Surface plasmon resonance，表面等离子共振)技术比较本发明IL-2R αβγ异源三聚体蛋白及IL-2R其他亚单位与IL-2的结合亲和力。其中，IL-2R其他亚单位包括IL-2Rα（ACRObiosystems，货号：ILA-H5251）、IL-2Rβ（ACRObiosystems，货号：ILB-H5253）、IL-2Rγ（ACRObiosystems，货号：ILG-H5256）、IL-2Rβγ（ACRObiosystems，货号：ILG-H5254）。检测原理如图6所示：

1、固定：用CM5芯片（GE公司，货号：BR100530）依照Human Antibody Capture Kit（GE公司，货号：BR-1008-39）说明书操作，固定上anti-human IgG Fc抗体，约9000-14000RU。

2、配体捕获：用运行缓冲液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，0.005%Tween-20，pH7.4）将配体（本发明IL-2R αβγ或上述IL-2R其他亚单位）稀释至10μg/ mL，然后注射至样品通道以10μl/ min的流速达到约800RU的捕获水平，参考通道不需要配体捕获步骤。

3、结合：用相同的运行缓冲液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，0.005％Tween-20，pH7.4）将分析物IL-2蛋白（AcroBiosystems公司，货号：IL2-H4113）稀释至9种浓度（200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0 nM）。设置IL-2蛋白以30μl/ min的流速注入参考通道和样品通道中，持续60 s或120 s的结合阶段，然后解离90 s或200 s。结合与解离过程全部在运行缓冲液中进行。根据分析物IL-2的浓度按升序重复8个循环。依照HumanAntibody Capture Kit（GE公司，货号：BR-1008-39）说明书，每个循环后，应使用3 M氯化镁完全再生传感器芯片表面。

4、芯片再生：依照Human Antibody Capture Kit（GE公司，货号：BR-1008-39）说明书，在运行缓冲液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，0.005% Tween-20，pH7.4）中以20μL/ min的流速注入3 M氯化镁，持续30 s来再生CM5芯片。

本发明IL-2R αβγ或上述IL-2R其他亚单位与IL-2结合亲和力的结果如图7所示。

根据SPR检测结果显示，本发明IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2的结合亲和力为0.041 nM（图7A），IL-2Rβγ、IL-2Rα及IL-2Rβ与IL-2的结合亲和力分别为0.123nM （图7B）、10.1 nM （图7C）、337 nM（图7D），IL-2Rγ与IL-2 结合<5RU，线性较差，同等条件下可认为几乎不结合（图7E）。

以上结果表明本发明的IL-2R αβγ蛋白为稳定的IL-2异源三聚体受体蛋白，与IL-2R其他亚单位相比，IL-2R αβγ蛋白与IL-2的结合亲和力最高。

实施例6 IL-2R αβγ异源三聚体蛋白的制备

本实施例中，异源二聚体元件1为亮氨酸拉链1（SEQ ID NO:5），异源二聚元件2为亮氨酸拉链2（SEQ ID NO:6）。其中，亮氨酸拉链1与异亮氨酸拉链2配对使用。IL-2R β亚单位或其变体与亮氨酸拉链1或亮氨酸拉链2之间通过柔性linker连接而成，并在C末端添加抗体Fc标签或其他亲和标签用于蛋白纯化；IL-2R α亚单位或其变体与IL-2R γ亚单位或其变体之间通过柔性linker连接，再与亮氨酸拉链2或亮氨酸拉链1之间通过柔性linker连接而成，并在C末端添加抗体Fc标签或其他标签用于蛋白纯化。本实施例选择抗体Fc标签。

重组表达载体的构建、细胞转染、表达纯化及结合亲和力检测的具体方法同实施例1、2、3和5，仅蛋白序列不同。

本实施例中，所用蛋白序列为SEQ ID NO:7（对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:8）和SEQ ID NO:9（对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:10），分别进行质粒构建（pHEK-B2和pHEK-AG2），然后进行蛋白的表达纯化。

该实施例获得的IL-2R αβγ异源三聚体蛋白，根据SDS-PAGE结果，两条带分别位于68KDa和120KDa附近，符合蛋白（Ⅰ）和蛋白（Ⅱ）的理论分子量大小，且纯度高达98%以上。根据HPLC分析结果，异源三聚体复合物纯度高达90%以上，与IL-2的结合亲和力为0.024nM，与实施例3中制备的异源三聚体蛋白结果相似。

图8为本实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白设计示意图。

图9为本实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白SDS-PAGE图，其中，泳道1为IL-2R αβγ异源三聚体蛋白，泳道2为蛋白Marker。

图10为本实施例中IL-2R αβγ异源三聚体蛋白HPLC检测结果图。

图11为本实施例中利用SPR技术检测IL-2R αβγ异源三聚体复合物蛋白与IL-2的结合亲和力结果图。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司

<120> IL-2受体复合物及其制备方法与应用

<130> KHP211110815.0YS

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser

20 25 30

Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp

35 40 45

Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp

50 55 60

Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser

65 70 75 80

Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln

85 90 95

Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu

100 105 110

Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu

115 120 125

Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu

130 135 140

Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr

145 150 155 160

Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His

165 170 175

Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp

180 185 190

Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val

195 200 205

Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser

210 215 220

Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

245 250 255

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctgcac ctgcattgtc ttggagactg cccctgctga tattgctgct cccactggct 60

accagttggg ccagtgcagc agtgaacggc acaagccagt tcacctgttt ctacaacagt 120

agggcaaata tctcttgcgt atggtctcag gatggcgctc tgcaggatac ttcctgccag 180

gtgcacgcat ggccagaccg aaggagatgg aaccagacct gcgagttgct tcccgtttca 240

caagctagtt gggcttgtaa tctgatcctg ggggctcctg actcacaaaa actcaccaca 300

gttgatatcg taactctgag ggtcttgtgt agggagggag tgcgctggcg agtgatggct 360

atccaagact tcaagccatt cgaaaatctg cgcctgatgg cgccaatttc tctccaggtg 420

gtgcatgtag aaacccaccg gtgcaacatt tcctgggaga tctcccaggc aagccactat 480

tttgaaagac atcttgagtt tgaagctcga acgctgagtc cagggcacac ctgggaagag 540

gcaccacttc tgaccctgaa gcagaaacaa gagtggattt gtctggagac tttgacccca 600

gacactcagt acgagtttca ggtacgggtc aaaccccttc agggagagtt cactacatgg 660

agcccctgga gtcagcccct tgcctttcgc actaaacctg cagcgctggg gaaggatggc 720

ggatcaggag gaagcggagg aagtcctaaa tcctctgata agactcacac tagcccgcca 780

tctccagctc ctgaacttct gggcggacca agcgtatttc tgttcccccc aaaacctaag 840

gatactctga tgattagccg gactccagaa gtaacctgcg tcgtggtcga cgtgagccac 900

gaggaccctg aggttaaatt caattggtac gtcgatggcg tcgaagtcca taatgctaaa 960

acaaagccca gagaggaaca gtataattct acctatcggg ttgtatctgt cttgaccgta 1020

ctccatcagg actggctcaa tggaaaggag tataagtgca aggttagcaa caaggctctg 1080

cccgccccca ttgagaaaac catttccaag gccaagggac agcctaggga gccccaggta 1140

tatacactgc caccctgcag ggacgaattg accaagaacc aggtcagtct gtggtgcctg 1200

gtgaagggat tttaccccag cgatatagcc gttgaatggg agtcaaatgg ccagccggaa 1260

aataactata aaaccacccc tcccgttttg gactccgacg ggagcttctt cctttatagc 1320

aaactgactg tggacaaaag tcggtggcag cagggcaacg tgtttagctg ttccgtaatg 1380

cacgaagcat tgcacaatca ctacacccag aagtctctga gcttgagccc cggtaaa 1437

<210> 3

<211> 686

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val

1 5 10 15

Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro

20 25 30

His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn

35 40 45

Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr

50 55 60

Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys

65 70 75 80

Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro

85 90 95

Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro

100 105 110

Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro

115 120 125

Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val

130 135 140

Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His

145 150 155 160

Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg

165 170 175

Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln

180 185 190

Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu

195 200 205

Ser Glu Thr Ser Gly Ser Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly

210 215 220

Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp

225 230 235 240

Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val

245 250 255

Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro

260 265 270

Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn

275 280 285

Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr

290 295 300

Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe

305 310 315 320

Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln

325 330 335

Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu

340 345 350

Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn

355 360 365

Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp

370 375 380

Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe

385 390 395 400

Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg

405 410 415

Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp

420 425 430

Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Gly Gly

435 440 445

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

450 455 460

Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

465 470 475 480

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

485 490 495

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

500 505 510

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

515 520 525

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

530 535 540

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

545 550 555 560

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

565 570 575

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

580 585 590

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

595 600 605

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

610 615 620

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

625 630 635 640

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

645 650 655

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

660 665 670

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

675 680 685

<210> 4

<211> 2058

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacagct acttgctgat gtggggcctc ttgaccttca ttatggtacc cggatgtcag 60

gcagagctgt gtgacgatga cccaccagag atcccgcacg ccacattcaa agccatggcc 120

tataaagaag ggaccatgtt gaattgcgag tgtaagagag ggtttcggag aataaaaagt 180

ggaagcttgt acatgctgtg cactggcaac agctctcata gttcctggga taaccagtgt 240

cagtgcacga gtagcgctac cagaaacacg actaaacagg tgacacccca gcctgaggaa 300

cagaaggagc gcaagaccac ggaaatgcag agccccatgc agcctgtaga ccaggcctca 360

cttcctggac actgtaggga gcctcctcct tgggaaaacg aggctaccga gagaatctac 420

cactttgttg ttggccagat ggtgtactac cagtgcgtcc agggatacag agccttgcac 480

agagggcctg ccgaatccgt ttgtaagatg actcacggca agacgagatg gacccagcca 540

cagctgatct gcactggcga gatggagacc tcccagtttc cgggagagga aaaaccacag 600

gcctctcctg agggtcggcc tgaatccgaa acgtccggct cactcaatac cactatactg 660

actcctaacg gaaacgagga cactactgcc gattttttcc tgaccacaat gccaacagat 720

tctctctcag tgtctactct ccccctcccc gaggtgcagt gctttgtatt taacgtggaa 780

tacatgaatt gcacatggaa cagctcttcc gaaccccaac ctaccaacct gacattgcac 840

tactggtaca agaactccga caacgacaaa gtccagaagt gctcccatta cctctttagc 900

gaagaaatca cgtctggttg tcagctgcag aaaaaggaga tccatctgta tcagaccttc 960

gtggtccaac tccaggaccc aagagagcca agacgccagg ccacacaaat gctgaaattg 1020

cagaatctcg tgattccatg ggccccagaa aacctgaccc tccataagtt gagcgagagt 1080

cagctggagc ttaactggaa caaccggttt ctgaaccact gcttggagca cctcgtgcaa 1140

tacaggacag attgggacca cagttggaca gagcagagcg ttgattaccg gcacaagttt 1200

agccttccga gcgtggacgg gcagaagaga tatacattcc gcgtgcgctc cagattcaac 1260

ccattgtgcg ggagcgccca acattggtcc gagtggtccc accccattca ctggggcagc 1320

aacacatcta aagaaaatgg gggaagcgga ggttcaggag gatctcccaa aagtagcgat 1380

aaaactcata cttccccccc aagtcctgct cctgagctgc tcggaggacc ctctgtattc 1440

ctgtttccac caaagccgaa agacaccctg atgattagta gaacacccga ggtgacctgc 1500

gtggtcgtgg atgtgtcaca tgaagacccg gaggtgaaat tcaactggta tgtagacggg 1560

gtcgaagtac ataacgctaa aaccaagccg cgcgaggaac agtataatag cacgtatcgc 1620

gtggttagcg ttctgactgt actccatcag gattggctga atggaaagga atataagtgc 1680

aaggtgtcta ataaggctct gcccgctcca atcgagaaga ccatcagcaa agccaagggt 1740

caacccagag agccccaggt atgcactctg ccaccaagtc gagatgagct cactaagaac 1800

caggtttcac tgtcctgcgc cgtgaagggc ttttatccct ctgacatcgc cgttgagtgg 1860

gaatccaatg gacaacccga gaacaattat aagacgaccc cccctgtcct ggacagcgat 1920

ggttccttct ttctcgtttc caaactgacc gtggacaagt caagatggca gcagggaaac 1980

gtattctcat gcagtgtgat gcatgaagcc ttgcacaacc actacaccca gaagagtctg 2040

agcctttccc caggcaag 2058

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys

20 25 30

Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His

35 40

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn

1 5 10 15

Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln

20 25 30

Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His

35 40

<210> 7

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser

20 25 30

Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp

35 40 45

Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp

50 55 60

Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser

65 70 75 80

Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln

85 90 95

Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu

100 105 110

Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu

115 120 125

Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu

130 135 140

Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr

145 150 155 160

Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His

165 170 175

Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp

180 185 190

Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val

195 200 205

Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser

210 215 220

Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu

245 250 255

Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala

260 265 270

Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His

275 280 285

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

290 295 300

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

305 310 315 320

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

325 330 335

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

340 345 350

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

355 360 365

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

370 375 380

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

385 390 395 400

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

405 410 415

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

420 425 430

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

435 440 445

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

450 455 460

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

465 470 475 480

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

485 490 495

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

500 505 510

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515

<210> 8

<211> 1537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8