一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法。

背景技术

白芸豆属豆科，蝶形花亚科，菜豆属，生物学名多花菜豆。白芸豆富含各种营养元素，并且蛋白质含量极高，含量约为干重的18-25％，是植物蛋白的重要来源之一，在国内外都有着广泛种植。

芸豆中蛋白质种类很多，其中含有多种对机体有益的生物活性物质，α-淀粉酶抑制剂就是其中的一种。α-淀粉酶抑制剂是一种特异性糖苷水解酶抑制剂，它可以通过特异性抑制人体唾液淀粉酶及胰淀粉酶活性，从而达到阻碍或者延缓餐后血糖升高的目的，因此，α-淀粉酶抑制剂可以很好的控制和延缓糖尿病的发生和发展。现有的研究表明，白芸豆含有较高含量的α-淀粉酶抑制剂，其含量可占种子总蛋白含量的9～11％；白芸豆α-淀粉酶抑制剂具有良好的生物安全性，对小鼠进行各种急性慢性毒理学试验均未观察到不良反应。当今社会，人们对于体重控制与体形管理日益重视，而人体在日常生活中最重要的能量摄入来源为淀粉等碳水化合物，因此，α-淀粉酶抑制剂作为一种“能够特异性抑制碳水化合物水解酶——淀粉酶”产品，可以延缓或阻碍淀粉水解，进而减少人体中能量的摄入，达到控制体重增长的效果，具有良好的市场前景。

白芸豆含有多种不同性质的蛋白质，其中一些对人体具有不利影响的生物活性物质也大量存在，如植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂等。植物凝集素是一种可以可逆的结合到特定的单糖、低聚糖的非免疫来源的碳水化合物结合蛋白；由于高等动物细胞表面是由各种糖蛋白所覆盖的，因此，植物凝集素可以与这些糖蛋白的多糖组分产生相互作用，进而引起细胞凝集等，例如引起红细胞凝集或白细胞凝集，从而对人体产生不良影响；此外，有报道也将植物凝集素列为引起芸豆过敏反应的过敏原之一。胰蛋白酶抑制剂，可以在体内阻碍胰蛋白酶对摄入蛋白质的水解，导致机体摄入的蛋白质无法被进一步吸收，从而造成机体营养不良与腹泻，；同时胰蛋白酶抑制剂还会刺激肠道分泌淀粉酶，降低α-淀粉酶抑制剂的作用效果。因此，从白芸豆中提取制备α-淀粉酶抑制剂，应特别注意去除性质相近的植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂等蛋白类成分。

发明内容

本发明旨在提供一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法，包括下列步骤：

步骤1：将白芸豆破碎成颗粒，然后将白芸豆颗粒与纯化水按质量比1:1.5-2.5混合，浸泡2.5-5.0h；

步骤2：将浸泡后的白芸豆颗粒与纯化水的混合物一起研磨处理得到白云豆浆；

步骤3：将白芸豆浆、PBS缓冲液按质量比1:5-10混合，搅拌提取0.5-12h；然后将提取后的混合物离心收集上清液；

步骤4：将上清液放入热水浴中，在水浴温度65-75℃条件下处理10-20min；然后冷却至室温；

步骤5：向步骤4得到的溶液中滴加浓度0.5-5.0mol/L的盐酸溶液，调节溶液pH值为2.5-4.0，静置0.5-1.5h；将静置后的溶液离心收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中滴加浓度0.5-5.0mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液pH值为6.5-7.5；将调节pH值后的溶液，放入温度4±1℃环境中静置0.5-1.0h；

步骤7：将步骤6得到的溶液，采用孔径0.22-1.20μm微滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤8：将滤出液采用过滤分子量80-120kDa超滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤9：将步骤8得到的滤出液采用过滤分子量30-50kDa超滤膜过滤处理，收集截留液；

步骤10：对截留液进行喷雾干燥，得到粉状物料即为白芸豆α-淀粉酶抑制剂。

优选的技术方案为：步骤2中，采用胶体磨以转速10000-15000r/min进行研磨处理。

优选的技术方案为：所述PBS缓冲液的制备方法为：称取磷酸氢二钠71.63g，磷酸二氢钠31.20g，分别溶于1000mL去离子水中分别得到第一磷酸氢二钠溶液和第二磷酸氢二钠溶液，随后取第一磷酸氢二钠溶液45ml，第二磷酸氢二钠溶液55mL，混合均匀，加入0.39g的NaCl，用NaOH溶液调节pH值至6.9，定容至1L后即得。

优选的技术方案为：步骤3中，将白芸豆浆和PBS缓冲液组成的混合液置于温度为20-25℃条件下，采用转速8000-10000r/min搅拌提取2.5h。

优选的技术方案为：步骤3中，离心的速度为7500-8500r/min。

优选的技术方案为：步骤5中，离心的速度为7500-8500r/min。

优选的技术方案为：喷雾干燥的工艺参数为：进风温度120-150℃、入料流量50-100ml/min、喷头转速15000-25000r/min。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、本发明利用白芸豆α-淀粉酶抑制具有良好的耐热性及抵抗酸碱的能力，采用热应激及酸沉的方式除去芸豆浸提液中大部分杂蛋白。

2、本发明利用白芸豆α-淀粉酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、植物凝集素等分子量的差异，采用两次超滤处理，有效的实现了白芸豆α-淀粉酶抑制剂与植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂的分离。

3、本发明提取条件温和，对白芸豆α-淀粉酶抑制剂的活性影响较低。

附图说明

图1为白芸豆α-淀粉酶抑制剂纯化结果电泳图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法

一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法，包括以下技术步骤。

(1)白芸豆预处理

白芸豆原料为成熟度适中、无虫害、无霉变、无机械损伤的干燥白芸豆果实颗粒。

将白芸豆破碎成60目的均匀颗粒；将颗粒放入风选设备中，采用风速7-8m/s风选，去除轻质的白云豆皮颗粒，留下较重的白芸豆果实颗粒。

将白芸豆果实颗粒、食品级纯化水按质量比1:2混合，充分浸泡2.5h，备用。

(2)细化处理

将(1)中浸泡后的白芸豆果实颗粒与食品级纯化水混合物，放入胶体磨中，采用转速10000r/min胶体磨研磨处理，得到细化的白芸豆浆，备用。

(3)搅拌提取

将(2)中细化的白芸豆浆、PBS按照质量比1:5混合，室温下搅拌提取10h。在室温下，采用转速8000r/min离心25min，收集上清液，对上清液中α-淀粉酶抑制剂活力及蛋白含量进行检测，检测结果如表1浸提所示，蛋白浓度为10.02±0.253mg/mL，α-淀粉酶抑制剂活力为3272.66±91.19U/mL。浸提液SDS-PAGE凝胶电泳图如图1.a所示，蛋白种类丰富，含量较高。

(4)快速热应激处理

将(3)中的上清液放入具有超声波发射功能的热水浴中，保持水浴温度70℃、超声波频率28kHz、功率密度0.20W/cm2，超声波热水浴处理15min；然后，立即冷却至室温，备用。采用转速8000r/min离心25min，收集上清液，对上清液中α-淀粉酶抑制剂活力及蛋白含量进行检测。快速热应激处理对蛋白浓度与α-淀粉酶抑制剂活力影响如表1所示。快速热应激处理后，蛋白浓度由10.02±0.253mg/mL降低至6.67±0.979mg/mL，α-淀粉酶抑制剂活力由3272.66±91.19U/mL降低至3068.37±128.49U/mL，纯化倍数为1.41倍。快速热应激处理后上清液SDS-PAGE凝胶电泳图如图1.b所示，快速热应激使得浸提液中除31kDa条带蛋白外，其他蛋白含量显著降低，提高了浸提液中α-淀粉酶抑制剂纯度。此外，研究表明70℃热处理凝集素30min对其凝血活力没有影响，而芸豆凝集素的凝血活力受其四聚体-二聚体转变的影响，因此，浸提液经70℃热处理之后，其仍为四聚体状态，为后续超滤步骤分离纯化奠定基础。

(5)酸沉纯化

向(4)中热应激处理后的上清液中，滴加1.0mol/L的盐酸溶液，调节溶液pH至3.6，静置1.0h；将静置后的溶液，在室温下，采用转速8000r/min离心25min，收集上清液。

(6)回调

向(5)中上清液，滴加1.0mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液pH至6.9；将调节pH值后的溶液，放入温度4±1℃环境中，低温静置1.0h，备用。对低温静置后的溶液中α-淀粉酶抑制剂活力及蛋白含量进行检测，如表1所示，蛋白浓度为4.15±0.598mg/mL，α-淀粉酶抑制剂活力为2549.50±235.59U/mL，纯化倍数1.88倍。回调后溶液SDS-PAGE凝胶电泳结果如图1.c所示，酸沉纯化除去大部分浸提液中杂蛋白，并且α-淀粉酶活力保存较好，31kDa处条带为白芸豆α-淀粉酶抑制剂蛋白。图1.d为不进行快速热应激处理，直接将浸提液酸沉纯化，随后回调上清液pH至中性样品，未进行快速热应激处理样品在30kDa处蛋白未能被有效沉淀，此外，白芸豆凝集素单亚基相对分子质量约为32kDa，与热应激处理后接酸沉处理结果相比较，未经热应激处理而直接采用酸沉纯化处理上清液在32kDa处蛋白条带较深，表明快速热应激结合酸沉可除去部分凝集素。

(7)微滤

将(6)中调节pH并低温静置后的溶液，采用孔径0.22μm微滤膜过滤处理，收集滤出液，备用。

(8)第一次超滤

将(7)中滤出液采用过滤分子量100kDa超滤膜过滤处理，收集滤出液，备用。

(9)第二次超滤

将(8)中滤出液采用过滤分子量30kDa超滤膜过滤处理，收集截留液，备用。二次超滤所获溶液中蛋白浓度降低至0.85±0.019mg/mL，α-淀粉酶抑制剂活力为22.98±1.56U/mL。图1.e,f为第一次，第二次超滤后滤出液与截留液SDS-PAGE凝胶电泳图。结果表明，二次超滤后，大部分杂蛋白被除去，α-淀粉酶抑制剂被有效纯化。白芸豆胰蛋白酶抑制剂的相对分子质量约为8kDa，白芸豆凝集素在pH值为2.0之前保持其四聚体状态，因此膜过滤可对白芸豆α-淀粉酶抑制剂有效分离纯化。

(10)干燥

将(9)中截留液进行喷雾干燥处理，采用进风温度130℃、入料流量60mL/min、喷头转速20000r/min的喷雾干燥，得到粉状物料。

对照产品的性质：

按照上述方法制备的得到的白芸豆α-淀粉酶抑制剂中，提取率为1.10％，α-淀粉酶抑制剂比活为434.77U/mg，在1mg/mL提取α-淀粉酶抑制样品中，植物凝集素的含量为81ng/mL，胰蛋白酶抑制剂未检测到。

图中，a-g分别为芸豆浸提液(对应实施例步骤(3))，快速热应激上清液(对应实施例步骤(4))，酸沉纯化后回调pH样品溶液(对应实施例步骤5-6)，对照样品(将浸提液(3)直接进行酸沉纯化，随后回调pH)，100kDa超滤膜处理滤出液(对应实施例步骤(8)),30kDa超滤膜处理截留液(对应实施例步骤(9)),干燥后复溶α-淀粉酶抑制剂样品(对应实施例步骤(10)，10mg/mL)。与浸提液相比，快速热应激使得除31kDa条带外其余部分蛋白条带变浅；与未进行快速热应激处理而直接采用酸沉处理浸提液相比，快速热处理结合酸沉可除去大部分杂蛋白，除去结果更加彻底。二次超滤可有效对白芸豆α-淀粉酶抑制剂进行纯化。

表1白芸豆α-淀粉酶抑制剂各步骤纯化倍数明细表

α-淀粉酶抑制剂活力的测定方法：

将0.1mLα-淀粉酶溶液(0.5U/mL)和0.1mLα-淀粉酶抑制剂样品(适当稀释)于37℃水浴10min，加入0.8mL 1mg/mL可溶性淀粉溶液，精确反应10min后，沸水浴灭酶并立即冷却，加入10mL碘液，于556nm处测定吸光度值。背景对照管不加淀粉溶液，空白对照管中不加α-淀粉酶溶液，以相同体积PBS补足，其反应体系如表1所示。

表2α-淀粉酶抑制剂抑制率测定

α-淀粉酶抑制剂抑制率的计算公式：

式中A1、A2、A3、A4分别为556nm下背景对照、空白对照、酶对照和抑制管的吸光度值。通过稀释倍数即可将样品的抑制率转换为α-淀粉酶抑制剂活力。

α-淀粉酶抑制剂的活力单位定义为，37℃，pH6.9，在1min内抑制1.0mgα-淀粉酶水解淀粉的量。α-淀粉酶抑制剂的比活定义为每mgα-淀粉酶抑制剂所含的酶抑制剂的活力单位数。

SDS-PAGE凝胶电泳

分别配置12％与4％的分离胶与浓缩胶，将样品与上样缓冲溶液(含SDS和β-巯基乙醇)混合，沸水浴7min，冷却后进行电泳分析。选择上样量15μL，电泳起始电压选择80V，待样品进入分离胶后，调节电压至120V。电泳结束后，取下凝胶，使用考马斯亮蓝R-250染色，随后脱色，采用Tanon 1600全自动凝胶图像仪拍照分析。

实施例2：一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法

一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法，包括下列步骤：

步骤1：将白芸豆破碎成颗粒，然后将白芸豆颗粒与纯化水按质量比1:1.5混合，浸泡2.5h；

步骤2：将浸泡后的白芸豆颗粒与纯化水的混合物一起研磨处理得到白云豆浆；

步骤3：将白芸豆浆、PBS缓冲液按质量比1:5混合，搅拌提取0.5h；然后将提取后的混合物离心收集上清液；

步骤4：将上清液放入热水浴中，在水浴温度65℃条件下处理10min；然后冷却至室温；

步骤5：向步骤4得到的溶液中滴加浓度0.5mol/L的盐酸溶液，调节溶液pH值为2.5，静置0.5h；将静置后的溶液离心收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中滴加浓度0.5mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液pH值为6.5；将调节pH值后的溶液，放入温度3℃环境中静置0.5h；

步骤7：将步骤6得到的溶液，采用孔径0.22μm微滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤8：将滤出液采用过滤分子量80kDa超滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤9：将步骤8得到的滤出液采用过滤分子量30kDa超滤膜过滤处理，收集截留液；

步骤10：对截留液进行喷雾干燥，得到粉状物料即为白芸豆α-淀粉酶抑制剂。

优选的实施方式为：步骤2中，采用胶体磨以转速10000-r/min进行研磨处理。

优选的实施方式为：所述PBS缓冲液的制备方法为：称取磷酸氢二钠71.63g，磷酸二氢钠31.20g，分别溶于1000mL去离子水中分别得到第一磷酸氢二钠溶液和第二磷酸氢二钠溶液，随后取第一磷酸氢二钠溶液45ml，第二磷酸氢二钠溶液55mL，混合均匀，加入0.39g的NaCl，用NaOH溶液调节pH值至6.9，定容至1L后即得。

优选的实施方式为：步骤3中，将白芸豆浆和PBS缓冲液组成的混合液置于温度为20℃条件下，采用转速8000r/min搅拌提取2.5h。

优选的实施方式为：步骤3中，离心的速度为7500r/min。

优选的实施方式为：步骤5中，离心的速度为7500r/min。

优选的实施方式为：喷雾干燥的工艺参数为：进风温度120℃、入料流量50ml/min、喷头转速15000r/min。

实施例3：一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法

一种低温膜过滤制备高安全性白芸豆α-淀粉酶抑制剂的方法，包括下列步骤：

步骤1：将白芸豆破碎成颗粒，然后将白芸豆颗粒与纯化水按质量比1:2.5混合，浸泡2.5-5.0h；

步骤2：将浸泡后的白芸豆颗粒与纯化水的混合物一起研磨处理得到白云豆浆；

步骤3：将白芸豆浆、PBS缓冲液按质量比1:10混合，搅拌提取12h；然后将提取后的混合物离心收集上清液；

步骤4：将上清液放入热水浴中，在水浴温度75℃条件下处理20min；然后冷却至室温；

步骤5：向步骤4得到的溶液中滴加浓度5.0mol/L的盐酸溶液，调节溶液pH值为4.0，静置1.5h；将静置后的溶液离心收集上清液；

步骤6：向步骤5得到的上清液中滴加浓度5.0mol/L的氢氧化钠溶液，调节溶液pH值为7.5；将调节pH值后的溶液，放入温度5℃环境中静置1.0h；

步骤7：将步骤6得到的溶液，采用孔径1.20μm微滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤8：将滤出液采用过滤分子量120kDa超滤膜过滤处理，收集滤出液；

步骤9：将步骤8得到的滤出液采用过滤分子量50kDa超滤膜过滤处理，收集截留液；

步骤10：对截留液进行喷雾干燥，得到粉状物料即为白芸豆α-淀粉酶抑制剂。

优选的实施方式为：步骤2中，采用胶体磨以转速15000r/min进行研磨处理。

优选的实施方式为：所述PBS缓冲液的制备方法为：称取磷酸氢二钠71.63g，磷酸二氢钠31.20g，分别溶于1000mL去离子水中分别得到第一磷酸氢二钠溶液和第二磷酸氢二钠溶液，随后取第一磷酸氢二钠溶液45ml，第二磷酸氢二钠溶液55mL，混合均匀，加入0.39g的NaCl，用NaOH溶液调节pH值至6.9，定容至1L后即得。

优选的实施方式为：步骤3中，将白芸豆浆和PBS缓冲液组成的混合液置于温度为25℃条件下，采用转速10000r/min搅拌提取2.5h。

优选的实施方式为：步骤3中，离心的速度为8500r/min。

优选的实施方式为：步骤5中，离心的速度为8500r/min。

优选的实施方式为：喷雾干燥的工艺参数为：进风温度150℃、入料流量100ml/min、喷头转速25000r/min。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。