一种NAMPT基因修饰间充质干细胞外泌体的制备方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是一类直径在30-150nm之间的纳米级囊泡，可由许多类型的细胞分泌产生，其内容物包含蛋白质、DNA、miRNA、mRNA等，参与细胞间的物质交换和信息交流。外泌体可用于新型理想的无细胞疗法，可以作为天然载体来运输药物，还可以携带细胞释放的信息和物质来调控远端细胞的生物作用，也可以凭借作为细胞微环境中的重要成员成为疾病的预测、诊断、治疗的标志物。

抗衰老领域是当今生命科学领域和社会领域的研究热点。2018年，美国北卡罗莱纳州立大学科学家研究表明，人真皮成纤维细胞分泌的外泌体可以更好地修复光老化引起的皮肤损伤。2019年6月，华盛顿大学医学院的研究人员发现了一种存在于人和小鼠等动物细胞内的烟酰胺磷酸核糖转移酶(eNAMPT)，当把年轻小鼠的eNAMPT注入老年小鼠时，可有效防止衰老相关的功能下降和疾病，甚至延长寿命。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，通过NAMPT的慢病毒载体在人脐带间充质干细胞中高表达进而使MSC来源的外泌体NAMPT高表达，从而使其具有有效的抗衰老作用，可以有效替代间充质干细胞成为具有抗衰老作用的新型药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

a、构建NAMPT高表达慢病毒载体；

b、将NAMPT高表达慢病毒质粒与vsvg包膜质粒、PCMV-delta R8.2包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集上清；

c、用收集的病毒上清感染间充质干细胞，药筛后得到稳定高表达NAMPT 基因间充质干细胞株；

d、收集高表达NAMPT细胞株培养基，利用外泌体试剂盒提取，获得高表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体。

本发明为解决其技术问题所采用的进一步技术方案是：

进一步地说，所述NAMPT基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

进一步地说，所述步骤b中所述NAMPT高表达慢病毒质粒中慢病毒的元件顺序为CMV-MCS-3XFLAG-6xHis-IRES-puro。

进一步地说，所述步骤b中质粒共转染的各质粒浓度比为 PLVX-IRES-NAMPT-puro:PCMV-delta R8.2:vsvg＝3:2:1。

进一步地说，所述步骤b中收集上清后500g离心5min，0.45μm滤器过滤。

进一步地说，所述步骤c中感染间充质干细胞时病毒上清与MEM培养基两者的体积之比为1:3。

进一步地说，所述步骤c中感染间充质干细胞加入100mg/ml鲑精蛋白。

进一步地说，所述步骤c中嘌呤霉素药物筛选浓度为0.4μg/ml。

进一步地说，所述间充质干细胞为永生化人脐带间充质干细胞。

本发明的有益效果至少具有以下几点：

1、本发明通过对人脐带间充质干细胞NAMPT转基因，获得高表达NAMPT 的脐带间充质干细胞，进而获得源于间充质干细胞的、具有高水平NAMPT的外泌体，我们的技术终产品是具有高水平NAMPT的外泌体，使这种外泌体具有明显抗衰老作用；

2、本发明选择的修饰基因是与烟酰胺单核苷酸(NMN)合成有关酶NAMPT 的基因，由于烟酰胺单核苷酸是众所皆知的抗衰老因子，NAMPT的高水平表达，可以引起NMN的高水平合成，进而具有抗衰老作用。

附图说明

图1是本发明荧光定量PCR法检测细胞内NAMPT mRNA的相对水平的结果图；

图2是本发明免疫印迹法检测细胞内NAMPT蛋白的相对水平的结果图；

图3是本发明免疫印迹法检测间充质干细胞外泌体的NAMPT蛋白的表达量的结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：NAMPT基因过表达间充质干细胞细胞系的建立

1.构建含NAMPT基因的重组慢病毒载体

根据人的NAMPT基因序列，设计如下表1所示引物，NAMPT基因前端加上KOZAK序列和3XFLAG标签，后端加上6xHis标签并且在引物序列分别加上EcoR1和BamH1酶切位点及保护碱基：

表1

KOZAK的序列为GCCACCATGG(SEQ ID No:6)；

6xHis的序列为GTGGTGGTGGTGGTGGTG(SEQ ID No:7)。

2.慢病毒包装

用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养HEK293T细胞至70％-80％融合时，按照xfect说明书将含有NAMPT基因片段的高表达慢病毒载体、包装质粒Δ R8.2、包膜质粒vsvg以3:2:1浓度比共转染293T细胞，48h后收取上清，500g 离心5min，经0.45μm滤器过滤得到含NAMPT基因的高表达慢病毒原液，-80℃保存。

3.用NAMPT基因高表达慢病毒感染间充质干细胞并评价其高表达效果

取对数生长期的间充质干细胞，以2×10

实施例2外泌体获取及NAMPT基因修饰外泌体的鉴定

1.获取外泌体

取对数生长期的NAMPT稳定高表达的间充质干细胞铺于100mm皿中，待其贴壁后，换成MT无血清培养基培养72h，收集细胞上清。细胞上清用0.22μm 滤器过滤，随后16000g离心30min，将上清转移到新的离心管内，加入1/2体积的EXO-SpinTM Buffer(EXO-SpinTMkit，CELL guidance systems)，颠倒混匀后4℃过夜孵育，次日，16000g离心1h，弃上清，用500μl PBS重悬沉淀，得到NAMPT高表达的间充质干细胞外泌体。

2.NAMPT基因修饰外泌体的鉴定

用蛋白质裂解液(RIPA)裂解外泌体，采用BCA试剂盒测蛋白含量。蛋白质免疫印迹检测NAMPT高表达间充质干细胞外泌体的表面标记及NAMPT高表达间充质干细胞外泌体内NAMPT的表达量(如图3结果所示，免疫印迹检测结果表明NAMPT转基因也使MSC细胞外泌体NAMPT蛋白水平明显提高)。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 江苏易诺维生物医学研究院有限公司

<120> 一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)

<400> 1

atgaatcctg cggcagaagc cgagttcaac atcctcctgg ccaccgactc ctacaaggtt 60

actcactata aacaatatcc acccaacaca agcaaagttt attcctactt tgaatgccgt 120

gaaaagaaga cagaaaactc caaattaagg aaggtgaaat atgaggaaac agtattttat 180

gggttgcagt acattcttaa taagtactta aaaggtaaag tagtaaccaa agagaaaatc 240

caggaagcca aagatgtcta caaagaacat ttccaagatg atgtctttaa tgaaaaggga 300

tggaactaca ttcttgagaa gtatgatggg catcttccaa tagaaataaa agctgttcct 360

gagggctttg tcattcccag aggaaatgtt ctcttcacgg tggaaaacac agatccagag 420

tgttactggc ttacaaattg gattgagact attcttgttc agtcctggta tccaatcaca 480

gtggccacaa attctagaga gcagaagaaa atattggcca aatatttgtt agaaacttct 540

ggtaacttag atggtctgga atacaagtta catgattttg gctacagagg agtctcttcc 600

caagagactg ctggcatagg agcatctgct cacttggtta acttcaaagg aacagataca 660

gtagcaggac ttgctctaat taaaaaatat tatggaacga aagatcctgt tccaggctat 720

tctgttccag cagcagaaca cagtaccata acagcttggg ggaaagacca tgaaaaagat 780

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tatgacattt ataatgcgtg tgagaaaata tggggtgaag atctaagaca tttaatagta 900

tcaagaagta cacaggcacc actaataatc agacctgatt ctggaaaccc tcttgacact 960

gtgttaaagg ttttggagat tttaggtaag aagtttcctg ttactgagaa ctcaaagggt 1020

tacaagttgc tgccacctta tcttagagtt attcaagggg atggagtaga tattaatacc 1080

ttacaagaga ttgtagaagg catgaaacaa aaaatgtgga gtattgaaaa tattgccttc 1140

ggttctggtg gaggtttgct acagaagttg acaagagatc tcttgaattg ttccttcaag 1200

tgtagctatg ttgtaactaa tggccttggg attaacgtct tcaaggaccc agttgctgat 1260

cccaacaaaa ggtccaaaaa gggccgatta tctttacata ggacgccagc agggaatttt 1320

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gtcttcaaga atggcaaggt gacaaaaagc tattcatttg atgaaataag aaaaaatgca 1440

cagctgaata ttgaactgga agcagcacat cat 1473

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 扩增FLAG的上游引物(人工序列)

<400> 2

tggggaattc gccaccatgg actacaaaga ccatgacggt gattataaag atcatgaca 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 扩增FLAG的下游引物(人工序列)

<400> 3

attataaaga tcatgacatc gattacaagg atgacgatga caagcttgcg gccgcgaat 59

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 扩增NAMPT的引物(人工序列)

<400> 4

aagcttgcgg ccgcgaatat gaatcctgcg gcagaagc 38

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 扩增NAMPT的下游引物(人工序列)

<400> 5

tcaggatccc tagtggtggt ggtggtggtg cgcggcggca tgatgtgctg cttccagttc 60

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> KOZAK序列(人工序列)

<400> 6

gccaccatgg 10

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 6xHis的序列(人工序列)

<400> 7

gtggtggtgg tggtggtg 18