一种氟咯草酮异构体的检测方法

技术领域

本发明涉及手性农药检测技术领域，具体涉及一种氟咯草酮异构体的检测方法。

背景技术

手性农药的不同对映异构体之间存在活性或毒性的差异，进入环境后在吸收、分布、降解和代谢方面存在立体选择性，其中一种异构体可能存在高活性、低毒性。而使用高活性的异构体会对生态环境更友好。目前获取单一异构体的主要方法有天然提取法和外消旋体分离法，其中天然提取法主要用于获得生物体内特有的单一异构体，如糖类、氨基酸、生物碱等；外消旋体分离法主要用于化学合成的手性农药，而色谱技术则是对外消旋体进行快速拆分的理想方式。

氟略草酮属于吡咯烷酮类除草剂，化学结构上具有两个手性中心，4个异构体，属于手性除草剂，4个异构体的结构见图1，关于氟咯草酮异构体方面的研究，C.K.Tseng等首先通过X射线衍射的方法报道了氟咯草酮的trans和cis两种结构，但关于4个异构体的构型研究未见报道，申请人对国内生产的氟咯草酮原药进行分析发现其存在RS、SS、SR、RR4个旋光异构体，其分离方法见本申请人专利申请号为CN201911067210.1的中国专利申请。

目前，含一个手性中心的手性农药的分离、分析方法构建已有较多研究，但含两个手性中心的手性农药，因具有4个对映异构体，分离检测难度大，分离效果不理想，纯对映体的获得和检测方法受到限制，导致其对映体毒性、环境行为差异性研究还不充分，有待进一步深入研究。

发明内容

本发明针对上述问题提供一种氟咯草酮异构体检测方法，包括以下步骤：

S1：对待检测样品进行处理；

S2：采用液相色谱质谱联用仪对处理后的待检测样品进行分析，其中，流动相A为甲醇溶液，流动相B为5 Mmol 乙酸铵+0 .02％乙酸水溶液，采用恒度洗脱，水占流动相B的比例≥15%，流速为0.5mL/min，柱温箱温度为36～40℃。

进一步地，液相色谱柱为淀粉型手性柱Super-chiral

更进一步地，所述柱温箱温度为40℃。

更进一步地，所述待测氟咯草酮样品为含氟咯草酮的土壤、水体或植物。所述植物包括根、茎、叶、花、果实等任意部分。

更进一步地，所述土壤样品处理过程为：将土壤用乙晴浸提、涡旋后加入无水MgSO

更进一步地，所述植株样品的处理过程为：将植株粉碎研磨后用乙腈浸提，涡旋后加入无水MgSO

更进一步地，所述MgSO

更进一步地，所述无水MgSO

更进一步地，所述液相色谱质谱联用仪的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描，MRM模式检测，定性离子对质荷比为311.95和291.85，碰撞电压为-22.0V；定量离子对质荷比为311.95和144.95，碰撞电压为-55.0V；质谱离子源位置为-2～-4，离子源温度为450℃，雾化气3mL/min，干燥气15mL/min。

更进一步地，所述质谱离子源位置为-3。

本发明的优点：

本发明基于液相色谱质谱联用仪配备淀粉型手性柱Super-chiral

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例的氟咯草酮4个异构体的化学构型；

图2是本发明实施例的流动相B中水占比为12%时四种异构体的色谱图；

图3是本发明实施例的流动相B中水占比为15%时四种异构体的色谱图；

图4是本发明实施例的流动相B中水占比为16%时四种异构体的色谱图；

图5是本发明实施例的流动相B中水占比为17%时四种异构体的色谱图；

图6是本发明实施例的离子源位置对检测结果的影响；

图7是本发明实施例的四种氟咯草酮异构体单体的色谱图；

图8是本发明实施例的喷施氟咯草酮的土壤基质中4种异构体的标线性方程；

图9是本发明实施例的喷施氟咯草酮的马铃薯根基质中4种异构体的标线性方程；

图10是本发明实施例的喷施氟咯草酮的马铃薯块茎基质中4种异构体的标线性方程；

图11本发明实施例的喷施氟咯草酮的马铃薯叶基质中4种异构体的标线性方程。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请的实施例所用仪器和试剂如下：

主要仪器设备

岛津液相色谱-质谱检测系统Shimadzhu LC-MSMS，配ESI离子源

，离心机（sigma）、涡旋仪（vortex genie-2）

主要试剂

氟咯草酮标准品（纯度99.8%）购自德国Dr公司；25%氟咯草酮乳油购自上海泰禾化工有限公司；色谱级甲醇、乙腈、乙酸和乙酸铵购自德国默克公司；水为屈臣氏纯净水；MgSO

实施例1

为获取最佳质谱条件，进行前体离子和产物离子最优条件筛选，将色谱柱拆掉换成淀粉型手性柱Super-chiral

表1氟咯草酮异构体的LC-MS分析条件

实施例2

为验证不同流动相对检测结果的影响，流速为0.5mL/min，流动相A泵为甲醇溶液；B泵为0.02％（v / v）乙酸+5 Mmol乙酸铵水，调整流动相B中水的比例为：12%、15%、16%、17%和18%，以分离度和峰型等为指标对其进行考察。结果见表2和图2-5，结果表明：流动相中水的比例设置对于异构体的分离具有较大影响，流动相B为5 Mmol 乙酸铵+0 .02％乙酸水溶液，采用恒度洗脱，水占流动相B的比例≥15%，4个异构体可完成基线分离，即分离度达到1.5以上，综合分析时间和具体实验操作，水相占比为16%为最佳分析条件。

表2 氟咯草酮4个异构体流动相比例不同的分离效果

实施例3

为考察色谱柱温度对氟咯草酮4个异构体分离的影响，设置色谱柱温度为：30℃、35℃、36℃、38℃、40℃ 5个温度条件，进样量2Vl，进样浓度为1.00 mg/kg，以分离度为主要指标，进行条件优化，结果见表3，从表中可以看出，温度低于35℃时，氟咯草酮4个异构体不能达到基线分离，且温度越高异构体ISO B和ISO C的分离效果越好，综合考量各种仪器指标及流动相，选择色谱柱温度为40℃。

表3 不同柱温度对氟咯草酮异构体的分离影响

实施例4

为了验证本发明的检测方法能否对氟咯草酮4个异构体进行测定，将分离获得4个异构体单体采用本申请的方法进行测定，结果见图7。

实施例5

标准溶液配制

采用色谱纯乙腈制备氟咯草酮的标准溶液，分别配置0.01mg L

将不喷施氟咯草酮的马铃薯田的土壤、马铃薯块茎、根和叶经过下述处理后作为空白：

土壤样品的处理过程：取10g土壤样品置于50mL离心管中，加10mL乙腈提取，涡旋3min后加入4g无水MgSO

马铃薯块茎、根和叶的处理过程：取10g马铃薯块茎、根或叶样品粉碎研磨后置于50mL离心管中，加入10mL乙腈提取，涡旋3min后加入4g 无水MgSO

四个空白的基质标线性方程如图8-11所示。

采用本发明的方法验证氟咯草酮4个异构体的日内和日间添加回收率，结果见表4。

从表中可以看出，4个异构体ISOA、ISOB、ISOC和ISOD在马铃薯生态环境中的土壤、叶片植株、根和块茎中的回收率在73.98%～93.56%之间，符合农药残留检测的添加回收来标准，最低检测限LOQ为0.010 mg/kg，最低检出限为0.001 mg/kg，满足4个异构体在马铃薯生态系统中的环境行为研究。

表4 氟咯草酮4个异构体的日内和日间添加回收率

实施例7

为验证不同异构体在土壤以及马铃薯中的代谢速度，在马铃薯播种15天后，喷施25％氟咯草酮EC，剂量为1125g/公顷，其中活性成分为推荐剂量的1.5倍，在喷洒后0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45和48天随机收集土壤。从样地的9个采样位置（土壤深度从0到10厘米）收集土壤样品，将不同位置收集的土壤充分混匀后取200g，一式两份，-20℃保存。

在同一实验田上采集马铃薯植株样品。为了确保不影响马铃薯的正常生长，在马铃薯植株高度超过15厘米后，第1、5、10、15、20、25、30、35、45、60天均从不同位置的9个马铃薯植株上采集样品，将9个植株样品充分混匀后-20℃保存。

采用上述方法对采集的土壤样品和马铃薯根、块茎、叶样品进行处理，然后采用本发明的方法测定样品中氟咯草酮4个异构体的含量，结果见表3和表4

从表中可以看出，氟咯草酮4个立体异构体进入马铃薯生态植株内后，其代谢降解及马铃薯对其的吸收作用存在较大差异。其中trans构型的对映异构体ISO A和ISO C降解较慢，其中ISO A具有明显的内吸性，实验后在马铃薯的植株和叶片中均检测出。而cris构型对映异构体ISO B和ISO D相对降解快，4个异构间存在明显的选择性环境行为。首先，对于4个异构体在植株中的选择性环境行为进行研究，为保证不影响后期马铃薯的生长，在马铃薯植株高度为15cm左右时，采集马铃薯植株，结果表明：ISO A和ISO C可通过根吸收传导到马铃薯植株中，但含量极少，而ISO B和ISO D的内吸性较差，在此检测限下未发现ISO D。

氟咯草酮4个异构体的在土壤中的选择性降解规律符合一级降解动力学方程，其降解一级动力学方程分别为：y = 0.5651e-0.044x，R² = 0.9246；y = 0.3084e-0.038x，R²= 0.9781；y = 0.1469e-0.051x，R² = 0.9284；y = 0.0135e-0.049x，R² = 0.9954，说明4个异构体在土壤中降解存在明显差异性，其中ISO A和ISO C由于初始浓度高，降解较慢，结果见表5和表6。

表5 氟咯草酮4个异构体在土壤上的选择性环境行为

表6 氟咯草酮4个异构体在植株上的选择性环境行为

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。