一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法及其应用

技术领域

本发明涉及凝胶电泳技术领域，尤其涉及一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法及其应用。

背景技术

近几年，小麦种子贮藏蛋白在分子水平方向上的研究快速发展。这主要归因于出现了一些先进的分离手段，从而促进人们从分子水平来研究小麦种子蛋白质的结构，为小麦品质遗传改良、品种品质鉴定等服务。小麦是人类重要的主粮作物，基于其面团的特殊粘弹性等特性，其面粉可用于制作面包、蛋糕、饺子和面条等多种食品，这些特性主要取决于谷蛋白和醇溶蛋白组成的种子贮藏蛋白。小麦醇溶蛋白是种子胚乳中的重要贮藏蛋白，约占小麦面粉总量的4～5％，是小麦面筋的主要组成成分之一，它赋予面筋延展性，是影响小麦面包烘烤品质的重要因素。

由于醇溶蛋白组成是由遗传物质决定的，编码小麦醇溶蛋白的基因主要位于第1和第6部分同源群的染色体短臂上，有Gli-1、Gli-2和Gli-3个位点群。上个世纪九十年代，许多科学家陆续提出并改进了适用于小麦醇溶蛋白分析的A-PAGE电泳方法。在单向A-PAGE电泳的条件下，一个品种能分离出15～30个组分，而在双向电泳下可分离出多达50个左右的组分。根据其在电泳图谱上的迁移率可分为α、β、γ、ω共4种醇溶蛋白。它们分别占醇溶蛋白总量的25％、30％、30％、15％。迄今，已鉴定出111个小麦醇溶蛋白的等位基因，并已按新的命名方法给予命名。同时，醇溶蛋白在电泳图谱上表现出丰富的多态性，使得小麦品种间存在着明显差异，具有高度的异质性和复杂性。小麦醇溶蛋白的蛋白图谱呈显性遗传，它的遗传不受环境因素的影响。因此，常被用于小麦品种真实性鉴定、种子纯度检测、亲缘关系分析、品质预测和遗传多样性等方面的研究，建立核心种质库，研究物种的起源和进化等，因而对于小麦醇溶蛋白图谱鉴别方法的研究便成为一个活跃的研究领域。

目前，关于醇溶蛋白的分离方法有酸性聚丙烯酰胺凝胶(A-PAGE)电泳、反相高效液相色谱法和毛细管电泳3种方法。A-PAGE电泳是国际种子检验学会颁布的利用种子醇溶蛋白鉴定小麦品种的标准方法。这些方法在国际种子检验学会颁布的A-PAGE电泳的基础上进行了凝胶浓度、强度方面的调整，降低了图谱误差，系统提高了胶的质量和分辨率，是适合中国实验器材和试剂等实验条件的麦醇溶蛋白分离方法之一。然而在实际操作中，这些改进后的方法虽然比国际种子检验协会公布的标准方法更适合中国仪器和药品的实际情况，但仍然存在很多的缺点，比如聚丙烯酰胺凝胶的韧性不够、粘板导致剥离困难等。结合该试验的实际情况，有必要对小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法进行优化改进，以提高实验效率和准确性。

许多学者已将醇溶蛋白凝胶电泳分析技术应用于小麦品质遗传育种和种子检测中，如品种鉴定、种子纯度检验、品质预测等方面。大量试验证明，对于某特定小麦品种而言，其醇溶蛋白谱带数目一般可达20～30条。所以醇溶蛋白可作为品种“指纹”，为小麦品种纯度鉴定、品种间遗传变异提供研究依据。A-PAGE方法所具有的简便、快速、低成本的特点，是目前其他方法所无法替代的。但其分辨率和重现性受电泳体系的影响较大。影响电泳分辨率的因素主要有凝胶的凝胶孔大小、缓冲体系的pH和离子强度等。因此，对A-PAGE电泳方法进行优化改进来提高检测效率和清晰准确度具有重要的意义。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法及其应用，以便能简单、快速、准确地对醇溶蛋白含量不同的小麦品种进行鉴定分析，本发明同时分析了8个小麦近等基因系品种的醇溶蛋白相对迁移率作为比较，为小麦醇溶蛋白图谱分析技术的发展和标准化提供一定的参考依据。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法，包括如下步骤：

(1)配制凝胶：尿素1～2g，丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液8～12mL，凝胶buffer10～20mL，FeSO

(2)将1.5mm的玻璃板与1mm的玻璃板拼合，1mm的玻璃片朝外固定到制胶架上；

(3)将步骤(1)中的凝胶加入到上述玻璃板中，加满后插入梳子，得凝胶板；

(4)配制1×电极buffer：将20×电极buffer与去离子水混合，得1×电极buffer；

(5)凝胶1.5～2.5h后，将所述凝胶板取下置于电泳槽内并倒入所述1×电极buffer，拔出梳子；

(6)上样，进行电泳；

(7)电泳完成后，卸胶，对带胶进行染色；

(8)染色结束后，对带胶进行脱色，至条带清晰时拍照。

优选的，步骤(1)中所述丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液的浓度为38～42wt％，所述丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液中丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的质量比为28～30:1，所述H

优选的，步骤(3)中所述的梳子为10齿或15齿梳子。

优选的，步骤(4)中所述20×电极buffer与去离子水的混合体积比为40～60:940～960。

优选的，步骤(6)中所述上样的方式为从左到右上样，所述上样的量为10～15μL，所述电泳过程中，样品端接电极线方式为红接红，黑接黑，电源端接电极线方式为红接黑，黑接红。

优选的，步骤(6)所述电泳过程中的电压为恒压80～120v，所述电泳的时间为0.8～1.2h。

优选的，步骤(7)中所述染色的组分为考马斯亮蓝染液，所述染色的时间为25～35min。

优选的，步骤(8)中所述脱色为用水清洗脱色，所述脱色过程中每隔20～30min换一次水。

本发明还提供了上述小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法在小麦品种鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、节约成本：凝胶配置体系变小；

2、操作方便：大板胶换成小板胶，操作简单快速；

3、温度不受限：电泳时不需要接入冷凝装置设置19℃，室温条件即可；

4、方便卸胶：电泳后可将凝胶从玻璃板上卸下来；

5、缩短电泳时间：由原来500V电泳2h缩短至100V电泳1h；

6、凝胶：凝胶分辨率高；

7、醇溶蛋白条带：能跑出难以检测的条带。

8、本发明方法可操作性强，程序简单快速，而且分辨率也得到大大提高。采用本发明电泳方法的蛋白质谱带界限更明显，特征带和共有带更清晰稳定。从制备样品到出具检测数据，仅用一天的时间，比传统方法大大节省了时间，提高了效率，不仅形成了一套适合一般实验室进行快速简捷鉴定小麦醇溶蛋白的方法，同时也为小麦的品质鉴定和优质育种材料筛选等方面提供了参考依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为对比例1的8个小麦品种的醇溶蛋白电泳谱带；

图2为本发明实施例1的8个小麦品种的醇溶蛋白电泳谱带。

具体实施方式

本发明提供了一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法，包括如下步骤：

(1)配制凝胶：尿素1～2g，丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液8～12mL，凝胶buffer10～20mL，FeSO

(2)将1.5mm的玻璃板与1mm的玻璃板拼合，1mm的玻璃片朝外固定到制胶架上；

(3)将步骤(1)中的凝胶加入到上述玻璃板中，加满后插入梳子，得凝胶板；

(4)配制1×电极buffer：将20×电极buffer与去离子水混合，得1×电极buffer；

(5)凝胶1.5～2.5h后，将所述凝胶板取下置于电泳槽内并倒入所述1×电极buffer，拔出梳子；

(6)上样，进行电泳；

(7)电泳完成后，卸胶，对带胶进行染色；

(8)染色结束后，对带胶进行脱色，至条带清晰时拍照。

在本发明中，步骤(1)中所述配制凝胶：尿素1～2g，丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液8～12mL，凝胶buffer 10～20mL，FeSO

在本发明中，步骤(1)中所述丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液的浓度优选为38～42wt％，进一步优选为39～41wt％，更进一步优选为40wt％；所述丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液中丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的质量比优选为28～30:1，进一步优选为29:1；所述H

在本发明中，步骤(3)中所述的梳子优选为10齿或15齿梳子，进一步优选为15齿梳子。

在本发明中，步骤(4)中所述20×电极buffer与去离子水的混合体积比优选为40～60:940～960，进一步优选为50:950。

在本发明中，步骤(5)中所述凝胶1.5～2.5h后，将所述凝胶板取下置于电泳槽内并倒入所述1×电极buffer，拔出梳子，进一步优选为凝胶2h后，将所述凝胶板取下置于电泳槽内并倒入所述1×电极buffer，拔出梳子。

在本发明中，步骤(6)中所述上样的方式优选为从左到右上样，所述上样的量优选为10～15μL，进一步优选为12～14μL，更进一步优选为13μL；所述电泳过程中，样品端接电极线方式优选为红接红，黑接黑，电源端接电极线方式优选为红接黑，黑接红。

在本发明中，步骤(6)所述电泳过程中的电压优选为恒压80～120v，进一步优选为恒压100v；所述电泳的时间优选为0.8～1.2h，进一步优选为0.9～1.1h，更进一步优选为1h。

在本发明中，步骤(7)中所述染色的组分优选为考马斯亮蓝染液，所述染色的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，更进一步优选为30min。

在本发明中，步骤(8)中所述脱色优选为用水清洗脱色，所述脱色过程中优选每隔20～30min换一次水，进一步优选为每隔25min换一次水。

本发明还提供了上述小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法在小麦品种鉴定中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例和对比例中用到的实验材料为：小麦材料编号CK、382、917、824、573、1154、393、654(注：CK为华麦1223；382、917、824、573、1154、393、654为华麦1223的高分子量麦谷蛋白亚基突变体近等基因系，醇溶蛋白有些许变化)。

实施例1

一种小麦醇溶蛋白A-PAGE电泳方法，步骤如下：

(1)将1.5mm玻璃板清洗干净(不能有胶粒残留)；

(2)配置25mL体系凝胶，如表1所示。

表1 25mL体系凝胶

注：40wt％Acr:Bis(29:1)即为丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液。

(3)将1.5mm高玻璃板与对应1.0mm矮玻璃板拼合，矮板朝外固定到制胶架上(注意：检查是否固定好，是否容易漏胶)。

(4)配好的25mL凝胶充分混匀后迅速加入步骤3的玻璃板中，加满后插入15齿梳子(将烧杯中剩余的胶液倒入废液桶中，禁止倒入水池)。

(5)配制1×电极buffer：量取50mL 20×电极buffer加入1L烧杯中，加入950mL去离子水，充分混匀。

(6)凝胶2小时后将凝胶板取下固定在电泳仪下槽上，放到电泳槽内并倒入1×电极buffer缓冲液，缓慢拔出梳子。

(7)从左到右上样13μL，接电极线，红接红，黑接黑；电源端，红接黑，黑接红。恒压100v，电泳1h。

(8)完成电泳后关掉电泳仪电源，进行卸胶(注意：在水中缓慢卸胶)，记好顺序，将带胶放入盒中，倒入考马斯亮蓝染液(0.1g考马斯亮蓝R-250溶解于100mL甲醇和冰醋酸混合水溶液中，混合液比例为水:甲醇:冰醋酸＝53:40:7)，静置染色30min。

(9)染色结束后倒出染色液(可循环使用3次)，小心加入清水，静置脱色25min后换水，待脱色完成，条带清晰时拍照。

对比例1

(1)将玻璃板清洗干净(不能有胶粒残留)；

(2)配制凝胶(提前配制好FeSO

表2 100mL体系凝胶

(3)将玻璃板耳板与方板拼合，耳板朝外固定到制胶架上，封底。

(4)配制H

(5)在步骤(2)配好的200mL凝胶中加入170μL H

(6)配制1×电极buffer：量取50mL 20×电极buffer加入1L三角瓶中，加入950mL去离子水，充分混匀。

(7)凝胶后拔出梳子，将玻璃板(耳板朝内)固定到电泳仪上，放到电泳槽内。

(8)取步骤6配制的1×电极buffer倒入电泳仪上槽中，检查是否漏液，如不漏液则在下槽中加入1×电极buffer，确保液面介于最低和最高线之间。

(9)接入冷凝装置，开启冷凝系统，设定温度19℃。

(10)从左到右上样13μL，接电极线，红接红，黑接黑；电源端，红接黑，黑接红。恒压500v，电泳2h。

(11)完成电泳后关掉电泳仪电源，关掉冷凝系统。卸玻璃板(tips:将玻璃板放入盛水的盒子中浸没，从一角慢慢撬开，让水慢慢浸入耳板和方板之间，然后两板分开，胶更不易碎)，记好顺序，将带胶的玻璃板放入盒中，倒入考马斯亮蓝染液(1g考马斯亮蓝R-250，100mL冰醋酸，250mL异丙醇，650mL去离子水溶解)，静置染色18min。

(12)染色结束后倒出染色液(可循环使用3次)，小心加入清水，静置脱色25min后换水，待脱色完成，条带清晰时拍照。

上述实施例1与对比例1的电泳结果分别如图2和图1所示。将图1和图2进行比较可知，与对比例1相比，采用本发明方法可以清晰的跑出分辨率高的醇溶蛋白条带，通过改变体系之后的小板胶点样，可以快速观察到所研究材料的醇溶蛋白变化，有利于初步判断研究材料的醇溶蛋白增缺情况。

综上所述，本发明方法可操作性强，程序简单快速，而且分辨率也得到大大提高。采用本发明电泳方法的蛋白质谱带界限更明显，特征带和共有带更清晰稳定。从制备样品到出具检测数据，仅用一天的时间，比传统方法大大节省了时间，提高了效率，不仅形成了一套适合一般实验室进行快速简捷鉴定小麦醇溶蛋白的方法，同时也为小麦的品质鉴定和优质育种材料筛选等方面提供了参考依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。