一种昆虫衰老的基因检测方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种昆虫衰老的基因检测方法及应用。

背景技术

衰老是一种生物体自然衰退的过程，常常伴随着代谢、运动、免疫、生殖、神经等器官或者系统的渐行性退化，最终会导致生物体的死亡。果蝇(Drosophila melanogaster)作为模式生物具有个体小、繁殖快、生活周期短、遗传材料丰富等优点，又因其基因组与人类高度保守，为衰老和疾病发生机制的研究提供了一个理想的模型。而寿命是衡量衰老过程中最直观、最重要的指标，因此通常通过检测果蝇的寿命来衡量果蝇的衰老过程。

核纤层蛋白(Lamin)是一种位于细胞内层核膜的V型中间纤维(intermediatefilament,IF)蛋白，是构成细胞内层核膜的主要骨架蛋白。Lamin除了能够维持核膜、核基质及染色质结构的稳定性之外，还在DNA复制和转录、RNA剪接、核孔复合物定位、信号转导等方面都发挥着重要的调控作用。

研究表明可以通过检测衰老的生物学标志来判断个体是否衰老，如端粒长度，DNA甲基化水平，DNA损伤修复能力，β-半乳糖苷酶活性，线粒DNA片段缺失等，但对其检测的步骤比较困难，且整个过程较耗时耗力耗材。而是否可以通过检测lamin基因的表达水平来判断昆虫的衰老程度，此种基因检测方法并未有过报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种昆虫衰老的基因检测方法及应用，以便于判断昆虫的衰老程度，且操作相对简单。

基于上述目的，本发明提供了一种昆虫衰老的基因检测方法，包括如下步骤：

步骤一、检测年轻和衰老的野生型昆虫体内lamin基因的表达水平；

步骤二、检测突变体昆虫体内lamin基因的表达水平，并统计lamin突变体昆虫的寿命，得出lamin基因的表达水平下降会使昆虫的衰老提前；

步骤三、检测过表达昆虫体内lamin基因的表达水平，以得出lamin基因的过表达使lamin基因mRNA水平升高，延缓昆虫的衰老。

步骤一中通过荧光定量PCR检测年轻和衰老的野生型昆虫体内lamin基因的mRNA水平，以判定lamin基因和衰老相关。优选的，通过荧光定量PCR(qPCR)检测年轻(5天)和衰老(50天)的野生型果蝇体内lamin基因的mRNA水平，与年轻组果蝇相比，衰老组果蝇体内lamin基因的表达量发生了下降。说明lamin基因与果蝇的衰老相关。

所述荧光定量PCR检测的方法包括如下步骤：

S1、提取昆虫的总RNA；

S2、将提取的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别扩增lamin基因和内参基因rp49；

S3、在荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR反应。

优选的，所述昆虫包括果蝇。

所述果蝇的寿命统计及数据处理方法为：将两到三天内羽化的果蝇视为同一批，于显微镜下将雌雄分开分组，把分好组的果蝇于25℃恒温培养箱进行培养，每2天更换一次培养基，并记录每组每管的死亡只数和死亡日期；待所有果蝇死亡后，将所得数据输入到Graph prism8软件中制作生存曲线。

步骤二中通过荧光定量PCR检测突变体果蝇体内lamin基因的mRNA水平，通过果蝇的寿命统计及数据处理方法统计突变体果蝇的寿命。lamin基因表达水平下调会使果蝇的寿命缩短，而且lamin基因的表达量越低，果蝇寿命就越短。

步骤三中通过先构建lamin基因的5k启动子片段、CDS片段及3'UTR片段的重组载体，之后通过显微注射的转基因技术制备转基因果蝇，以使lamin基因的拷贝数增加，然后检测lamin基因过表达对果蝇衰老的影响。结果发现过表达lamin基因使其mRNA水平上升，同时果蝇的寿命也得到了延长。

本发明还提供一种lamin基因在检测和/或调控昆虫衰老中的应用。

本发明通过检测果蝇的lamin基因mRNA水平就可以知道果蝇的衰老程度，当lamin基因mRNA水平如果处于一个低水平的话，果蝇会处于衰老状态，面临死亡；与此相反，当lamin基因mRNA水平处于一个高水平的话，果蝇处于年轻状态。

通过调控lamin基因的表达水平来实现调控果蝇的衰老，即通过过表达lamin基因提高lamin基因的表达水平，来延缓果蝇的衰老，从而延长果蝇的寿命。通过使lamin基因突变使lamin基因mRNA水平降低，来加速果蝇的衰老，缩短果蝇的寿命。

本发明的有益效果：本发明通过检测lamin基因的表达量来判断果蝇个体的衰老程度，同时通过调控lamin基因可以实现对果蝇衰老的调控，操作相对简单且能够节约成本。本发明从基因层面检测果蝇的衰老的方法，为衰老和疾病的研究提供了新的参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明通过荧光定量PCR(qPCR)检测年轻(5天)和衰老(50天)的野生型果蝇体内lamin基因的mRNA水平；

图2为本发明通过荧光定量PCR(qPCR)检测5天的突变体果蝇体内lamin基因的mRNA水平；

图3为野生型果蝇及三种lamin突变体果蝇的寿命统计；

图4为本发明构建的载体图谱；

图5为本发明检测5天的lamP-lam果蝇的体内的lamin的表达水平；

图6为野生型果蝇及lamP-lam果蝇的寿命统计图；

图7为果蝇lamin基因的CDS片段扩增后的检测示意图；

图8为果蝇lamin基因的3'UTR片段扩增后的检测示意图；

图9为重叠PCR扩增lam-CDS-3'UTR片段后的检测示意图；

图10为PCR鉴定连接的载体attB-lam-3'UTR是否转化成功的示意图；

图11为AscI和XbaI对质粒进行酶切鉴定结果示意图；

图12为lamin基因5k启动子片段扩增后的检测示意图；

图13为PCR鉴定连接的载体attB--lamP-lam-3'UTR是否转化成功的示意图；

图14为AscI和XbaI对重组质粒进行酶切鉴定结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明采用的实验方法如下：

1.果蝇寿命的统计及数据处理

将两到三天内羽化的果蝇视为同一批，于显微镜下将雌雄分开分组，每组分若干管，每管约25只果蝇。把分好组的果蝇于25℃恒温培养箱进行培养，每2天更换一次培养基，并记录每组每管的死亡只数和死亡日期。待所有果蝇死亡后，将所得数据输入到Graphprism8软件中制作生存曲线。

2.实时荧光定量PCR技术

采用Trizol法提取果蝇的的总RNA。之后使用MonScript RTIII Super Mix withdsDNase反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。以反转录的cDNA为模板，lamin基因的qPCR引物扩增lamin基因，rp49基因的qPCR引物扩增内参基因rp49，在BIO RAD梯度荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR(qPCR)反应。反应程序：第一阶段95℃3min，第二阶段95℃5s，60℃30s，共35个循环，第三阶段72℃5min。qPCR实验数据用2

目的基因lamin：

Forward：5'-CAGTGCAGTCCTTTAGCCAG-3'

Reverse：5'-ACGCTGTGATCCTCCGACTC-3'。

内参基因rp49：

Forward：5'-CACTTCATCCGCCACCAGTC-3'

Reverse：5'-CGCTTGTTCGATCCGTAACC-3'。

3.转基因果蝇的制备

(1)果蝇lamin基因的CDS片段的扩增

以果蝇的cDNA为模板，lam-CDS-Kpn1/F和lam-CDS/R为上下游引物扩增果蝇lamin基因的蛋白编码区(Coding sequesce，CDS)序列，长度共为1880bp，结果如图7。PCR反应程序为：95℃预变性3mim，进入循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后，72℃继续延伸5min。所用到的引物序列如下：

lam-CDS-AscI/F：5'-AAAggcgcgccATGTCGAGCAAATCCCGACGTG-3'；

其中，下划线部分为AscI酶切位点；

lam-CDS/R:5'-TTACATAATGGCGCACTTCTCGTTTG-3'

(2)果蝇lamin基因的3'UTR片段的扩增

以果蝇的基因组DNA为模板，lam-CDS-DT-3'UTR/F和lam-3'UTR-Xba1/R为上下游引物扩增果蝇lamin基因的3'非翻译区(3'untranslational region，3'UTR)序列，长度共为1263bp，结果如图8。PCR反应程序为：95℃预变性3mim，进入循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃继续延伸5min。所用到的引物序列如下：

lam-CDS-DT-3'UTR/F：5'-

CAACACAACTC-3'其中，下划线部分为与lam-CDS/R的互补序列；

lam-3UTR-Xba1/R：5'-TTT

其中，下划线部分为Xba1酶切位点；

(3)重叠pcr扩增lam-CDS-3'UTR片段

该步骤的目的是为了将lamin基因的CDS序列和3'UTR序列连接起来，原理是：lamin基因CDS的下游引物和3'UTR的上游引物有一段互补序列，这样在扩增时就能将两个片段连接起来。操作为以上述扩增出的lamin基因的CDS序列和3'UTR序列为模板，lam-CDS-Kpn1/F和lam-3UTR-Xba1/R为上下游引物扩增lam-CDS-3'UTR融合片段，共为3123bp，结果如图9。

(4)attB-lam-3'UTR过渡载体的构建

将上述的pcr扩增的lam-CDS-3'UTR片段纯化后和attB骨架载体在37℃中用限制性内切酶AscI和XbaI酶切40min后，在attB载体中加入1ul的CIAP防止之后的载体自连，37℃反应30min。将片段和载体胶回收后用T4连接酶将片段连接到载体中，25℃反应3小时。将连接产物转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，将大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中。第二天挑单菌落，用菌液PCR鉴定连接的载体是否转化成功，结果如图10。引物选择插入lam-CDS-3'UTR片段一段序列作为上游特异性引物和载体的一段序列作为下游特异性引物。之后将菌液扩大培养后提取大肠杆菌中的重组质粒，使用AscI和XbaI对质粒进行酶切鉴定，结果如图11。

(5)lamin基因5k启动子片段的扩增

以果蝇的基因组DNA为模板，lam-5kP-SbfI/F和lam-5kP-AscI/R为上下游引物扩增果蝇lamin基因的启动子序列，长度共为5012bp，结果如图12。PCR反应程序如下：95℃预变性3mim，进入循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃继续延伸5min。所用到的引物序列如下：

lam-5kP-SbfI/F:AAAcctgcaggCACACTGAGCTCAAAGGTAACGCTAAGATT；

其中，下划线部分为SbfI酶切位点；

lam-5kP-AscI/R:TTTggcgcgccGTTCACGCTGCAAGACAAATGAAATGTGCAG；

其中，下划线部分为AscI酶切位点。

(6)attB--lamP-lam-3'UTR载体的构建

将上述的PCR扩增的5k启动子片段纯化后和之前构建好的attB-lam-3'UTR过渡载体在37℃中用限制性内切酶SbfII和AscI酶切40min后，在attB载体中加入1ul的CIAP防止之后的载体自连，37℃反应30min。将片段和载体胶回收后用T4连接酶将片段连接到载体中，25℃反应3小时。将连接产物转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，将大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素的固体LB培养基中。第二天挑单菌落，用菌液PCR鉴定连接的载体是否转化成功，结果如图13。引物选择载体中的一段序列作为上游引物，插入5k启动子片段的一段序列作为下游引物。之后将菌液扩大培养后提取大肠杆菌中的重组质粒，使用AscI和XbaI对质粒进行酶切鉴定，结果如图14。

鉴定成功后将提取的重组质粒送到生物公司测序，确保测序结果和目标序列一致。

(7)转基因果蝇的制备

按照文献中的方法(孙福玲.lamin基因调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的研究[D].安徽师范大学,2019.)将构建好的重组质粒显微注射到果蝇卵中，之后挑选转基因红眼果蝇并建系。

以编码果蝇B型核纤层蛋白lamin基因为例，通过本发明的步骤，可以判断该基因是否为调控衰老的基因。以编码果蝇B型核纤层蛋白lamin基因的表达水平(mRNA水平)来衡量果蝇个体的衰老程度。首先，通过实验发现lamin基因的表达水平会随着果蝇的衰老发生下降。其次，lamin基因突变使其表达水平降低，使果蝇的寿命缩短，从而加速果蝇的衰老。最后，lamin基因过表达会使lamin基因表达水平升高，延长果蝇的寿命，进而延缓果蝇的衰老。果蝇衰老的基因检测方法，具体包括如下步骤：

一、检测年轻和衰老的野生型W

按照实验方法1统计野生型果蝇W

二、检测lamin突变体果蝇体内lamin基因的表达水平并统计lamin突变体果蝇的寿命

由步骤1说明随着果蝇的不断衰老，lamin基因的表达水平在不断降低。那么是否是lamin基因的表达水平变低导致的果蝇衰老？为了验证这个实验，从美国BloomingtonDrosophila Stock Center买来了三种lamin突变体果蝇lam

表1

三、检测过表达lamin体内lamin基因的表达水平及其果蝇寿命的统计

通过载体构建和显微注射的转基因技术制备了转基因果蝇attB-lamP5k-lam-3’UTR(其中重组载体插入了lamin基因的5kb启动子、1869bp CDS序列和1234bp 3’UTR序列，载体图谱如图4)，接下来用lamP-lam表示该转基因果蝇，从而使lamin基因的拷贝数增加，探究lamin基因过表达对果蝇衰老的影响，具体步骤见实验方法3。按照步骤2和步骤1的方法分别检测5天的lamP-lam果蝇的体内的lamin的表达水平和统计其果蝇的寿命，结果如图5，图6和表2。

表2

结果发现，与5天的野生型果蝇w

通过以上几个步骤可以说明，lamin基因是一种与果蝇衰老相关的基因，lamin的表达水平的高低可以衡量果蝇的衰老程度。同时可以通过调控lamin基因来对果蝇的衰老进行调控，即通过过表达lamin基因使lamin基因mRNA水平升高，来延缓果蝇的衰老，延长果蝇的寿命。反之，通过使lamin基因突变使lamin基因mRNA水平降低会加速果蝇的衰老，缩短果蝇的寿命。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。