PLK4基因在急性髓系白血病治疗方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及PLK4基因在急性髓系白血病治疗方面的应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类以髓系原始细胞过度增殖和分化阻滞为特点的血液系统恶性肿瘤，是成人急性白血病中最常见的类型。目前，急性髓系白血病主要的治疗方法为化疗。标准化疗为“7+3”方案，即采用7天阿糖胞苷联合3天柔红霉素等蒽环类药物进行化疗，但仍有40％的患者无法达到完全缓解。因此，进一步寻找用于治疗AML的特异性靶点有重要意义。

肿瘤细胞的一个特点是过度增殖。随着研究的不断深入，人们发现肿瘤细胞的细胞周期比正常细胞短，因而始终处于活跃的增殖状态。近年来，调控细胞周期的激酶成为研究一大热点。其中，一种Polo样蛋白激酶(Polo-like kinase 4，PLK4)参与调控细胞周期，且在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中表达异常，进一步的研究证明PLK4通过PI3K或ATR/CHEK1通路参与调控肿瘤细胞的转移、增殖、凋亡等生物学行为。但是，PLK4在急性髓系白血病细胞中的表达水平和作用机制尚未得到证实。

发明内容

本发明意在提供PLK4基因在急性髓系白血病治疗、诊断和药物筛选中的应用，以解决现有技术中的治疗急性髓系白血病的药物需要进一步开发的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

PLK4基因在制备诊断急性髓系白血病的系统中的应用。

本方案还提供了PLK4基因在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用。

本方案还提供了PLK4基因在筛选治疗急性髓系白血病的药物中的应用。

进一步，PLK4基因在制备诊断急性髓系白血病的系统中的应用，所述系统包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

进一步，PLK4基因在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，所述药物用于抑制PLK4基因的转录水平、或者抑制PLK4蛋白的表达水平、或者抑制PLK4蛋白的活性。

进一步，所述药物为PLK4基因抑制剂；所述PLK4基因抑制剂以PLK4基因为靶标制备，且对PLK4基因的转录水平具有抑制作用。

进一步，所述PLK4基因抑制剂为核酸分子；所述核酸分子包括双链RNA、短发夹RNA、反义寡核苷酸和小干扰RNA。

进一步，所述PLK4基因抑制剂为短发夹RNA；所述短发夹RNA的序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步，PLK4基因在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，所述药物为Wnt/β-catenin信号通路调控物质。

进一步，所述的PLK4基因抑制剂的载体包括逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、脂质体和囊泡中的任意一种。

综上所述，本技术方案的有益效果在于：

本发明通过公开数据库分析，发现并验证PLK4在急性髓系白血病中高表达，通过构建PLK4 shRNA来抑制细胞中PLK4的表达，通过PLK4靶向抑制剂抑制急性髓系白血病的增殖，进一步地抑制Wnt/β-catenin信号通路。

与现有技术比，本发明有益效果如下。

本发明首次发现PLK4在急性髓系白血病中高表达，通过本发明提供的抑制剂能够明显抑制急性髓系白血病细胞的增殖，同时能够下调Wnt/β-catenin信号通路。为进一步研究急性髓系白血病的发病机制以及PLK4基因的功能提供了新的思路。

附图说明

图1为实施例1的Bloodspot数据库中患者造血祖细胞(HSC)和急性髓系白血病细胞中PLK4的表达情况。

图2为实施例1的PLK4在正常人单个核细胞(PBMC)和急性髓系白血病细胞系(U937、NB4、HL-60、THP1、KG1a)mRNA表达情况。

图3为实施例1的PLK4在正常人单个核细胞(PBMC)和急性髓系白血病细胞系(U937、NB4、HL-60、THP1、KG1a)蛋白表达情况。

图4为实施例2的PLK4抑制剂在急性髓系白血病细胞系(THP1、KG1a)中对PLK4的mRNA和蛋白抑制效果。

图5为实施例3的在急性髓系白血病细胞系(THP1、KG1a)中抑制PLK4水平后对细胞增殖方面的影响。

图6为实施例4的抑制PLK4后Wnt/β-catenin通路有关蛋白的表达情况。

图7为实施例5的PLK4与Wnt/β-catenin通路有关蛋白的相互作用关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：检测PLK4在急性髓系白血病中的表达情况

1实验方法

1.1Bloodspot数据库相关数据下载及分析

急性髓系白血病样本的基因表达数据来源于Bloodspot(http://servers.binf.ku.dk/bloodspot/)数据库。从数据库获取急性髓系白血病样本的基因表达数据，然后采用t检验方法来比较急性髓系白血病细胞和造血干细胞(Hematopoietic stemcells,HSC)之间PLK4基因表达水平的差异。

1.2健康人外周血单个核细胞的提取

采用密度梯度离心从健康人外周血中分离单个核细胞。首先，将用EDTA抗凝的外周血添加到Ficoll分离液表面，然后离心，650g×30min。离心后外周血被分成四层，收集乳糜层的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次。

1.3白血病细胞的培养

KG1a,THP-1,NB4，HL60和U937细胞购买自中国科学院细胞库(Cell Bank of theChinese Academy of Sciences)，并使用含10％南美胎牛血清、1％青霉素-链霉素溶液(100U/mL)的RPMI-1640培养基培养于含5％ CO

1.4检测基因表达水平

(1)RNA提取：首先，收集对数生长期的细胞，用PBS洗涤2次，3，000rpm×2min离心；然后，弃上清，在细胞沉淀中加入1mL RNA提取试剂TRIzol，充分震荡混匀，冰上静置10min；随后，加入TRIzol 1/5体积的氯仿，上下颠倒混匀，冰上静置后以12，000g×15min的条件4℃离心；吸取上清液至干净无酶的EP管中，加入与氯仿等体积的异丙醇，上下混匀，冰上静置后以12，000g×10min的条件4℃离心；弃上清，加入1ml新配制的75％乙醇溶液，清洗沉淀，以12，000g×15min的条件4℃离心；弃上清，待乙醇完全挥发后，根据沉淀量加入适量RNase free双蒸水溶解；最后，测定RNA浓度及纯度。

(2)逆转录：按表1配制逆转录体系，并进行逆转录。反应条件：37℃×15min，85℃×5s，4℃冷却。cDNA短期保存于-20℃。

表1：逆转录反应体系(20μL体系)

(3)qRT-PCR：实时荧光定量PCR反应体系见表2。

表2：qRT-PCR反应体系(10μL体系)

反应条件：首先，95℃预变性30s；其次，95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸20s，采集荧光，循环39次。融解曲线条件：(65℃-95℃)每上升0.5℃采集1次荧光。以β-actin为内参，相对定量值结果采用2

表3：qRT-PCR的引物序列

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1.5蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

(1)蛋白质提取：收集细胞，用PBS洗涤3次，4，000rpm×3min；加入沉淀量2到3倍体积的含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，充分震荡混匀；冰上裂解细胞30min，每10min涡旋振荡一次，重复3次，然后12，000rpm×30min，4℃离心；吸取上清液至预冷的新EP管中，BCA法检测蛋白浓度，剩余蛋白样品加入上清液1/4体积的5×loading buffer，煮沸变性后于-40℃保存。

(2)SDS-PAGE凝胶电泳：配制10％的分离胶并缓慢灌胶，在凝胶上层边缘加1mL无水乙醇，37℃静置20min；弃去无水乙醇，在凝固的分离胶上层缓慢灌入配好的5％的浓缩胶，同时插上齿梳，37℃静置20min；待浓缩胶凝固后，拔出齿梳，加入1×SDS电泳缓冲液；向加样孔中加入50μg蛋白样品，同时在样本两侧孔中加入蛋白marker作为分子量参照；在玻璃板内灌满电泳缓冲液后，按照两步法电泳分离蛋白：第一步，电压80V，电流150mA，30min；第二步，电压120V，电流200mA，60-70min。10％分离胶与5％浓缩胶的配方见表4。

表4：10％分离胶与5％浓缩胶配方

(3)转膜：先根据待测蛋白分子量大小，切取适当宽度凝胶并浸泡在预冷的湿转液中。然后根据凝胶大小裁剪聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，甲醇中浸泡30s，蒸馏水洗涤1min让膜活化。最后由正极向负极方向依次放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。以230mA的恒流电泳转膜，转膜时间由蛋白分子量大小决定。

(4)封闭：转膜结束后，将PVDF膜放入脱脂奶粉中，室温封闭3h。

(5)抗体孵育：先用TBST清洗3次PVDF膜，然后用定性滤纸吸干膜上的液体，将膜置于蜡板上，加入按一定比例预先稀释好的一抗工作液，均匀覆盖PVDF膜，4℃孵育过夜；第二天回收一抗工作液后将PVDF膜放入TBST中洗涤3次，10min/次；最后，加入按一定比例预先稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗于PVDF膜上，室温孵育1h，TBST洗涤3次，10min/次。

(6)显色及成像：暗室内，将PVDF膜放置于蜡板上，然后加入配置好的化学发光试剂(A液和B液等体积混合)覆盖PVDF膜，于成像系统中显示成像。

1.6统计分析

所有数据来自3次独立的实验，定量资料以均数±标准差(x±SD)表示。采用

GraphPad Prism(Version 7.00)软件进行统计处理。两样本均数比较采用非配对学生t检验。检验水准为α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

2实验结果

为了检测PLK4在白血病中的表达情况，我们分析Bloodspot中PLK4在白血病患者中的表达情况。如图1所示，与造血干细胞相比，PLK4在白血病细胞组表达显著增高。然后，利用qRT-PCR，Western Blotting检测白血病细胞和健康人单个核细胞中PLK4的表达水平，如图2和图3所示，PLK4在白血病细胞中高表达。以上结果提示，PLK4在白血病细胞中表达升高。

实施例2：PLK4抑制剂的制备

1实验方法

；构建稳定表达sh PLK4的白血病细胞株

(1)慢病毒包装、测序鉴定及滴度测定：靶向PLK4基因的shRNA慢病毒载体(shPLK4)由上海吉凯基因化学技术有限公司合成包装、测序鉴定并进行病毒滴度的测定。shRNA序列为：5'-GGGAAGTCTTACACTTTAA-3'(SEQ ID NO.5)。

(2)慢病毒感染细胞并筛选稳转细胞株：首先，收集细胞接种于新的24孔板中，保证密度为每孔1×10

2实验结果

如图4所示，利用qRT-PCR，Western Blotting检测细胞内PLK的表达情况，可以确定PLK4的表达被成功抑制了。

实施例3：抑制PLK4的表达对急性髓系白血病细胞增殖的影响

1实验方法

1.1CCK-8实验检测细胞增殖

以每孔5.0×10

1.2蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平

实验方法同实施例1。

2实验结果

如图5(A和B)所示，敲低PLK4之后细胞增殖速度受到了抑制；利用WesternBlotting检测凋亡相关蛋白后，如图5(C和D)所示，细胞凋亡水平增加了。以上结果证明敲低PLK4抑制了急性髓系白血病细胞的增殖。

实施例4：PLK4对Wnt/β-catenin通路的影响

实验方法：蛋白印迹法检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达情况，实验方法同实施例1。

实验结果：如图6(A和B)所示，敲低PLK4可以抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。

实施例5：PLK4对Wnt/β-catenin通路的作用方式

1实验方法

Co-IP实验检测蛋白相互作用

首先将蛋白A/G磁珠放入2个EP管中，用PBST洗涤两次，然后用200μl PBST重悬，在倒置混合器上孵育2小时后，吸附磁珠并洗涤两次。然后，将提取的蛋白质放入每个试管中，在倒置混合器上与预偶联抗体珠一起4℃孵育过夜。第二天，用蛋白质印迹法进行实验。

2实验结果

如图7(A和B)所示，PLK4通过与C-myc相互作用的方式影响Wnt/β-catenin通路。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。