暹罗芽孢杆菌L5在苯酚降解中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及暹罗芽孢杆菌在苯酚降解中应用。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是模拟天然除虫菊素合成的一类含有多个苯环结构的广谱性杀虫剂，因其高效低毒、广谱和安全等优点，已作为有机氯和有机磷类农药的替代品被广泛应用于农业害虫和卫生害虫的防治。根据文献报道，一些拟除虫菊酯类农药在微生物降解的过程中会伴随着中间产物苯酚的产生。苯酚是炼油、焦化、造纸等工业废水中的主要污染物，已被美国环境保护署列入65种优先控制污染物(Priority Pollutants)名单，对生态环境的潜在危害比拟除虫菊酯农药更甚。1g苯酚就足以致命，短期接触酚类化合物通常会立即导致皮肤水疱、呼吸问题和眼睛灼伤等，长期接触可能导致肺部问题、免疫系统损害和癌症。许多国际环境监管机构都对苯酚及其衍生物设定了严格的排放限制，美国毒物和疾病登记署规定地表水中苯酚的检出限值是1ppb。

在专利文献ZL201911175618.0中公开了一株能高效降解高效氯氰菊酯的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)L5，该菌已于2019年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC M 2019885)，但其并未涉及对苯酚等酚类化合物的降解作用。

发明内容

本发明的目的在于提供暹罗芽孢杆菌L5在酚类化合物降解中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供暹罗芽孢杆菌L5在降解酚类化合物中的应用，所述暹罗芽孢杆菌L5(Bacillus siamensis)于2019年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019885。

在本发明的一些实施方式中，所述酚类化合物包含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述酚类化合物为苯酚。

本发明的第二方面，提供暹罗芽孢杆菌L5在制备降解苯酚酚类化合物的产品中的应用，所述暹罗芽孢杆菌L5(Bacillus siamensis)于2019年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019885。

在本发明的一些实施方式中，所述酚类化合物包含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述酚类化合物为苯酚。

本发明的第三方面，提供一种菌剂，包含本发明第一方面所述的暹罗芽孢杆菌L5和载体和/或辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为多孔玻璃。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的质量浓度为5～15％。

本发明的第四方面，提供本发明第三方面所述的菌剂的制备方法，包括以下步骤：将本发明第一方面所述的暹罗芽孢杆菌L5接种于以酚类化合物为唯一碳源的培养基中活化后，扩大培养，将获得的发酵菌液与载体混合均匀，即得苯酚降解菌剂。

在本发明的一些实施方式中，所述活化的条件为：29～33℃、100～200rpm条件下震荡培养20～28h以活化。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为多孔玻璃。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的质量浓度为5～15％。

在本发明的一些实施方式中，所述酚类化合物包含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述酚类化合物为苯酚。

本发明的第五方面，提供一种降解酚类化合物的方法，使用本发明第一方面所述的暹罗芽孢杆菌L5或本发明第三方面所述的菌剂降解酚类化合物。

在本发明的一些实施方式中，可用于降解水体、土壤环境中的酚类化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述降解的条件为：15-45℃、pH 4.0-10.0。

在本发明的一些实施方式中，所述降解的条件为：20-45℃、pH 5-9。

在本发明的一些实施方式中，所述降解的条件为：25-40℃、pH 6-8。

在本发明的一些实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌L5的接种量为0.5-10％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌L5的接种量为1-8％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌L5的接种量为2-6％。

在本发明的一些实施方式中，所述酚类化合物包含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚中的至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明发现暹罗芽孢杆菌L5对酚类化合物有很好的降解作用，可以用于苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚等酚类化合物的降解或降解菌剂的制备；而且菌株可通过直接投加的方式应用于环境中酚类化合物的降解，该菌剂的制备方法简单，使用方便高效，能安全、快速地降解水体、土壤中残留的苯酚，在苯酚等酚类化合物的污染治理中具有很好的应用前景。

附图说明

图1菌株L5生长和苯酚降解的关系曲线图。

图2接种量对菌株L5降解苯酚的影响。

图3温度对菌株L5降解苯酚的影响。

图4pH菌株L5降解苯酚的影响。

图5菌株L5对酚类化合物的降解。

图6降解菌剂对苯酚的降解动力学。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

培养基的配制

基础盐培养基：(NH

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水定容至1L，pH7.0，配制固体培养基时加入15g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌后备用。

实施例1菌株L5生长和降解苯酚的关系

挑取菌株L5单菌落入LB液体培养基中预培养12h，所得菌液于4000r/min离心2min后，弃去上清液，菌体用50mL 0.9％的灭菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液。降解测定时，取上述菌液2mL接种到装有50mL灭菌MSM培养基的250mL三角瓶中，并添加苯酚母液，使其最终质量浓度为100mg/L，于在30℃、pH 7.0条件下，150r/min振荡培养7d，每天取样，用气相色谱法测定苯酚残留量，绘制苯酚降解曲线和菌体生长曲线。菌体生长以600nm下的吸光值OD

取上述50mL培养液倒入250mL分液漏斗中，加入3g氯化钠，振荡溶解后，加入30mL体积比为1:1的二氯甲烷/乙酸乙酯混合溶剂，振摇，放出气体，再振摇萃取5-10min，静置10min以上，至有机相与水相充分分离，收集有机相。重复萃取1-2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠脱水，并用适量二氯甲烷/乙酸乙酯混合溶剂洗涤无水硫酸钠，收集有机相萃取液，45℃以下旋蒸浓缩近干，加入二氯甲烷/乙酸乙酯混合溶剂2.0mL，再浓缩定容至1.0mL待测。气相色谱程序升温：100℃保持3min后，以15℃/min升至250℃并保持1min；进样口温度：260℃；FID检测器温度：280℃；载气流速：1.5mL/min；氢气流量：30.0mL/min；空气流量：300.0mL/min；尾吹气流量：35.0mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1.0μL。

结果如图1所示，菌株L5可以利用苯酚作为生长物质，能快速降解苯酚，且苯酚的降解与菌株生长呈正相关。在含有苯酚的基础盐培养液中，菌株L5迅速进入对数生长期，2-3d为菌株的对数生长期，期间菌株L5对苯酚的降解速率最快，；第4-5d时菌株L5生长达到稳定期时，苯酚的降解曲线也趋于平缓；培养6d后，菌株进入衰亡期，到第7d时，苯酚降解率达到91.2％，而在不接菌的对照组中，苯酚7d的降解率为8.5％。

实施例2菌株L5接种量对苯酚降解的影响

在苯酚浓度为100mg/L的基础盐培养基中分别加入体积比为0.5％、1％、2％、4％、6％、8％、10％的菌悬液，于30℃、pH 7.0条件下150r/min振荡培养，气相检测第7天的苯酚浓度。

结果如图2所示，接种量在0.5-10％范围内时，菌株L5均表现出较好的苯酚降解效果，其中2％为最优接种量，在此条件下苯酚降解率为90.5％。当接种量为0.5-2％时，苯酚降解率随着接种量的增大而显著升高，分别为58.3％、75.7％和90.5％；在2-6％范围内，苯酚降解率随着接种量的增大而略有降低；当接种量继续增大到10％时，苯酚降解率显著降低为61.6％。

实施例3温度对苯酚降解的影响

选取菌株最优接种量后，将菌株加入苯酚浓度为100mg/L的基础盐培养基中，分别于15、20、25、30、35、40和45℃，pH 7.0、150r/min振荡培养，气相检测第7天的苯酚浓度。

菌株L5在15-45℃范围内对苯酚的降解效果见图3，最适温度为30℃。培养温度为15和20℃时，苯酚降解率为37.4％和49.7％；当温度升高，为25-35℃时，苯酚降解率显著升高，均在85％以上，30℃时降解率最高达到92.5％；当温度继续升至40和45℃，苯酚降解率显著降低，为68.2％和53.8％。

实施例4pH对苯酚降解的影响

选取菌株最优接种量和培养温度后，调节基础盐培养基的pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，将菌株分别加入苯酚浓度为100mg/L的上述基础盐培养基中，于30℃、150r/min振荡培养，气相检测第7天的苯酚浓度。

pH能影响微生物降解酶分子活性部位上相关基团和底物解离，过酸和过碱都能使酶变性失活。菌株L5在不同pH条件下对苯酚的降解效果见图4，最适pH为7.0，苯酚降解率为91.2％。当pH为4.0-6.0时，苯酚降解率随着pH值的增大而升高，分别为47.4％、59.5％和88.7％；在pH 6.0-8.0时，苯酚降解率均在88％以上；当pH继续升至9.0和10.0时，苯酚降解率显著降低，为62.1％和44.6％。菌株L5耐受的pH范围较宽，在5.0-9.0内的苯酚降解率均在50％以上。

实施例5菌株L5对酚类化合物的降解

将菌株L5按2％的接种量分别接种到终浓度为100mg/L的邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚的pH为7.0的基础盐培养基中，于30℃，150rpm振荡培养7天，气相检测菌株L5对酚类化合物的降解率。

如图5所示，菌株L5具有较宽的降解谱，培养7d后，其对供试的邻苯二酚、间苯二酚、3,5-二甲基苯酚、2-甲氧基苯酚和2,6-二甲氧基苯酚均表现出较好的降解效果，降解率分别为88.2％、84.9％、73.4％、69.5％和50.3％。

实施例6降解菌剂的制备及其对苯酚的降解动力学

(1)载体多孔玻璃的制备：将贝壳粉和玻璃粉(经XRF测试得到贝壳粉和玻璃粉的化学成分如表1所示)分别过200目筛后放入真空干燥箱中80℃干燥5小时后备用。称取适量的贝壳粉和玻璃粉(质量百分比为15：85)，加适量水，混合均匀，用金属膜具手工压制成型，置于马弗炉中煅烧，升温程序为：600℃保持5min后，以25℃/min升至850℃，保持5min，最后20℃/min升到950℃并保持10min，将制成的样品放入10℃冷水中，获得多孔玻璃。

表1贝壳粉和玻璃粉的化学成分组成

(2)降解菌剂的制备：取适量菌株L5接种于含100mg/L苯酚为唯一碳源的液体基础盐培养基，按照优化条件，150rpm震荡培养24h，按体积比10％接种于PH 7.0的LB液体培养基中在30℃、150rpm条件下震荡培养24h以活化。将所得的50mL菌液与5g灭菌多孔玻璃混合，在摇床中震荡2h，得到菌剂。

(3)降解菌剂对苯酚的降解动力学

设置MSM液体培养基中苯酚的初始浓度分别为100mg/L，30℃，150r/min培养7d，每天取样。共设4个处理，分别为不接菌、菌液、发泡玻璃和菌剂，每个处理3个重复。采用一级降解动力学模型，对1、2、3、4、5、6和7d的苯酚残留量(C)和时间(t)进行拟合。

其中一级降解动力学模型为：

C

半衰期为：

式中，C

降解菌剂对苯酚的降解动力学如图6所示，随着降解时间的延长，菌液和菌剂对苯酚的降解率增大，但菌剂的降解效果优于菌液，说明所制备的发泡玻璃利于微生物固定和生长，能提高菌株L5对苯酚的降解效果；而不加菌和发泡玻璃的处理中降解率仅在10％左右。该降解过程符合一级动力学方程，不加菌、发泡玻璃、菌液和菌剂四个处理拟合方程的相关系数R

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。