一种组织粘附性水凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及的是一种组织粘附性水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

在日常生活中，皮肤总会受到不同程度的损伤（比如烧伤、割伤、手术伤口等），为了使伤口快速愈合，各种各样的敷料被开发出来。传统的纱布贴、创可贴在面对关节处的伤口时显得很无力，因为这些敷料不能很好地与伤口贴合，当关节移动时，很容易脱落。

水凝胶由于其独特可调控的理化性质近年来受到了科学家们的广泛关注，被广泛研究应用到伤口修复领域。具有组织粘附性的水凝胶可以牢固地贴合在伤口处，并且具有一定的柔韧性。当伤口处的关节移动时，这种水凝胶也不会脱落，从而有效保护伤口，避免外部环境感染伤口。近年来，科学家们开发出来各种各样的策略制备组织粘附性水凝胶，比如：

（1）、在水凝胶体系中引入能产生粘附性的聚合物：以多酚化合物、接枝N-羟基琥珀酰亚胺的聚合物、富含氢键供体或受体的聚合物等物质制备的水凝胶，其表面基团可以和组织表面的活性基团发生相互作用，产生粘连；

（2）、制备仿生结构：受自然界各种粘附现象的启发，研究人员模拟壁虎足毛上的纳米结构、甲壳虫结构等来制备水凝胶，使其具有很好的粘附性；

（3）、制备仿生矿化过渡层来实现强大的界面粘附、超声介导的粘附、溶剂交换策略等。

尽管目前具有组织粘附性的水凝胶被不断研究出来，但是通常都面临以下问题：生物相容性较差、制备工艺复杂、保存困难等。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，解决组织粘附性的水凝胶生物相容性较差、制备工艺复杂、保存困难等技术问题，本发明提供一种壳聚糖介导的纯天然组织粘附性水凝胶的制备方法及其应用。

本发明的设计构思为：通过谷氨酰胺转移酶交联明胶和酪蛋白，形成水凝胶；通过在猪皮上涂一层壳聚糖溶液，再将水凝胶覆盖上去，最终使得水凝胶和离体猪皮粘在一起。该水凝胶作为伤口敷料使用时，可以很好的覆盖住伤口，避免外界环境感染伤口，从而促进伤口愈合。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种组织粘附性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、原料准备：

制备混合溶液A：将明胶颗粒溶于去离子水，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液A留待后步使用；

制备混合溶液B：先将碳酸钠粉末溶于去离子水中，再加入酪蛋白粉末，碳酸钠粉末与酪蛋白粉末的重量比为1:4，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液B留待后步使用；

制备混合溶液C：谷氨酰胺转移酶粉末溶于去离子水中，室温下搅拌均匀，制得混合溶液C留待后步使用；

S2、首先，将步骤S1制备的混合溶液A和混合溶液B按体积比2:1混合，制得混合溶液D；其次，向混合溶液D中加入甘油，甘油与混合溶液D的体积比为1:10，并在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得混合溶液E；再次，将步骤S1制备的混合溶液C加入混合溶液E中，混合溶液C与混合溶液D的体积比为1:5，室温搅拌至均匀；最后，将混合溶液超声除泡后置于塑料模具中，在40℃温度条件下静置3小时，制得明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶。

进一步地，在所述步骤S1中，制得的混合溶液A中明胶的浓度为0.25g/mL。

进一步地，在所述步骤S1中，制得的混合溶液C中谷氨酰胺转移酶的浓度为6%-15%。

进一步地，在所述步骤S1中，制得的混合溶液C中谷氨酰胺转移酶的浓度为12%。

一种采用如上所述方法制得的组织粘附性水凝胶的应用，其中：所述明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶用于制备皮肤敷料、组织工程支架或者生物传感器。

如上所述的应用包括以下步骤：

首先，制备混合溶液F：吗啉乙磺酸、壳聚糖、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺粉末按顺序依次溶于去离子水中，室温下搅拌12小时，制得混合溶液F；混合溶液F中：吗啉乙磺酸的浓度为1%，壳聚糖的浓度为1%~4%，1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的浓度为0-20mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺粉末的的浓度为0-20mg/mL；

然后，将混合溶液F均匀涂抹于离体皮肤组织表面并静置2分钟，在离体皮肤组织表面形成半凝固态或者凝固态溶液F涂层；然后，将明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶涂覆于溶液F涂层上，明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶通过溶液F涂层与离体皮肤组织粘接。

进一步地，制得的混合溶液F中，壳聚糖的浓度为2%，1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的浓度为10mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为20mg/mL。

本发明的有益效果在于：经过本发明提供的工艺步骤制备得到的明胶/酪蛋白水凝胶，具有优异的生物相容性和降解性，且具有保水、抗冻、载药、与组织局部粘附等性能。这种性能优异的天然水凝胶更具有实用意义，可以应用于组织工程支架、皮肤敷料、生物传感器等方面。

附图说明

图1为水凝胶剪切试验测试示意图；

图2为实施例1制得的G3C0水凝胶、G2C1水凝胶、G1C1水凝胶、G1C2水凝胶剪切强度对比图；

图3为实施例2不同EDC/NHS浓度的壳聚糖溶液粘连水凝胶和猪皮后测得的剪切强度对比图；

图4为实施例3中含不同甘油浓度水凝胶与离体猪皮的粘结的剪切强度对比图；

图5为实施例3制得的水凝胶的保水率对比图；

图6为实施例3制得的水凝胶的弹性模量对比图；

图7为实施例3制得的水凝胶的断裂伸长率对比图；

图8为实施例3制得的G2C1-10%水凝胶与猪皮粘附性能的实物照片；

图9为实施例4制得的水凝胶的药物释放图；

图10为实施例4制得的水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

以下描述中提到的专业术语用其对应的简写表示：

明胶（G），酪蛋白（C），谷氨酰胺转移酶（mTG），碳酸钠（Na

实施例1

一种组织粘附性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、原料准备：

制备混合溶液A：将25g明胶颗粒溶于100mL去离子水中，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液A留待后步使用；

制备混合溶液B：先将2.5g碳酸钠粉末溶于100mL去离子水中，再加入10g酪蛋白粉末，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液B留待后步使用；

制备混合溶液C：称取6.25g谷氨酰胺转移酶粉末溶于100mL去离子水中，室温下搅拌均匀，制得混合溶液C留待后步使用；

S2、首先，将步骤S1制备的混合溶液A和混合溶液B分别按体积比3:0、2:1、1:1、1:2混合，各比例混合溶液在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得四组混合溶液D，每组混合溶液D的总体积均为24mL；其次，向四组混合溶液D中分别加入2.4mL甘油，并在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得四组混合溶液E；再次，将4.8mL步骤S1制备的混合溶液C分别加入四组混合溶液E中，室温搅拌至均匀；最后，将四组混合溶液超声除泡后置于塑料模具中，在40℃温度条件下静置3小时，制得明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶。按照明胶（G）与酪蛋白（C）比例的不同，将制得的明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶分别命名为G3C0水凝胶、G2C1水凝胶、G1C1水凝胶、G1C2水凝胶。

一种采用本实施例1所述方法制得的组织粘附性水凝胶的应用，其中：所述明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶用于制备皮肤敷料、组织工程支架或者生物传感器。

如上所述的应用包括以下步骤：

首先，制备混合溶液F：0.976g MES、0.2g CS、700μL浓度为1mol/L的NaOH溶液、100mg EDC、100mg NHS粉末按顺序依次溶于10mL去离子水中，室温下搅拌12小时，制得混合溶液F；制得的混合溶液F中，CS的浓度为2%，；

然后，将混合溶液F均匀涂抹于离体猪皮表面并静置2分钟，在离体猪皮表面形成半凝固态或者凝固态溶液F涂层；然后，将明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶涂覆于溶液F涂层上，明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶通过溶液F涂层与离体猪皮粘接。

如图1所示，对实施例1制得的水凝胶进行剪切试验测试。剪切试验的测试结果如图2所示，不同明胶酪蛋白比例水凝胶的剪切强度不同，明胶和酪蛋白比例为2:1时剪切强度最大，为15.37±1.63kPa。这也反映了明胶和酪蛋白比例为2:1时，明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶与离体猪皮的粘结力最大，粘附性最好。

实施例2

一种组织粘附性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、原料准备：

制备混合溶液A：将25g明胶颗粒溶于100mL去离子水中，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液A留待后步使用；

制备混合溶液B：先将2.5g碳酸钠粉末溶于100mL去离子水中，再加入10g酪蛋白粉末，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液B留待后步使用；

制备混合溶液C：称取6.25g谷氨酰胺转移酶粉末溶于100mL去离子水中，室温下搅拌均匀，制得混合溶液C留待后步使用；

S2、首先，将步骤S1制备的16mL混合溶液A和8mL混合溶液B混合，在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得混合溶液D，混合溶液D的总体积为24mL；其次，向混合溶液D中加入2.4mL甘油，并在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得混合溶液E；再次，向混合溶液E中加入4.8mL步骤S1制备的混合溶液C，室温搅拌至均匀；最后，将混合溶液超声除泡后置于塑料模具中，在40℃温度条件下静置3小时，制得明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶。

一种采用本实施例2所述方法制得的组织粘附性水凝胶的应用，其中：所述明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶用于制备皮肤敷料、组织工程支架或者生物传感器。

如上所述的应用包括以下步骤：

首先，制备混合溶液F：0.976g MES、0.2g CS、700μL浓度为1mol/L的NaOH溶液、EDC粉末、 NHS粉末按顺序依次溶于10mL去离子水中，本实施例2中根据EDC和NHS的质量体积比设置四组试验，EDC和NHS的浓度分别为：0和0mg/mL、10和10mg/mL、10和20mg/mL、20和20mg/mL，室温下搅拌12小时，制得混合溶液F；制得的混合溶液F中，CS的浓度为2%，；

然后，将混合溶液F均匀涂抹于离体猪皮表面并静置2分钟，在离体猪皮表面形成半凝固态或者凝固态溶液F涂层；然后，将明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶涂覆于溶液F涂层上，明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶通过溶液F涂层与离体猪皮粘接。本实施例2中，根据EDC和NHS的浓度分别命名为0/0、10/10、10/20、20/20四组。

图3是用不同EDC/NHS浓度（0/0、10/10、10/20、20/20）的壳聚糖溶液粘连水凝胶和离体猪皮后测得的剪切强度。当EDC和NHS的浓度为10和20mg/mL时，水凝胶与离体猪皮之间的剪切力最大，为37.88±1.56kPa，粘结的最紧。

实施例3

一种组织粘附性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1、原料准备：

制备混合溶液A：将25g明胶颗粒溶于100mL去离子水中，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液A留待后步使用；

制备混合溶液B：先将2.5g碳酸钠粉末溶于100mL去离子水中，再加入10g酪蛋白粉末，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液B留待后步使用；

制备混合溶液C：称取6.25g谷氨酰胺转移酶粉末溶于100mL去离子水中，室温下搅拌均匀，制得混合溶液C留待后步使用；

S2、首先，将步骤S1制备的16mL混合溶液A和8mL混合溶液B混合，在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得混合溶液D，混合溶液D的总体积为24mL；其次，设置三组对比试验，对比试验中分别加入0mL、2.4mL、4.8mL甘油，在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，制得三组混合溶液E；再次，向各组混合溶液E中分别加入4.8mL步骤S1制备的混合溶液C，室温搅拌至均匀；最后，将混合溶液超声除泡后置于塑料模具中，在40℃温度条件下静置3小时，制得三组明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶。按明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶体系中甘油的添加量不同，将明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶体分为G2C1、G2C1-10%、G2C1-20%三组。

一种采用本实施例3所述方法制得的组织粘附性水凝胶的应用，其中：所述明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶用于制备皮肤敷料、组织工程支架或者生物传感器。

如上所述的应用包括以下步骤：

首先，制备混合溶液F：0.976g MES、0.2g CS、700μL浓度为1mol/L的NaOH溶液、100mg EDC、200mg NHS粉末按顺序依次溶于10mL去离子水中，室温下搅拌12小时，制得混合溶液F；制得的混合溶液F中，CS的浓度为2%，；

然后，将混合溶液F均匀涂抹于离体猪皮表面并静置2分钟，在离体猪皮表面形成半凝固态或者凝固态溶液F涂层；然后，将明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶涂覆于溶液F涂层上，明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶通过溶液F涂层与离体猪皮粘接。

图4是含不同甘油浓度水凝胶与猪皮的粘结的剪切强度，甘油的加入降低了水凝胶的粘附性能，但是却大大提高了水凝胶的保水性能。如图5所示，随着甘油浓度的提升，水凝胶的保水性能提高。对放置在-20℃或37℃环境中72h后水凝胶的拉伸性能进行测试，结果如图6、图7所示，甘油的加入可以很好的保护水凝胶的力学性能，其弹性模量和断裂伸长率均变化较小，避免其在实际应用时因为失水或低温环境变得坚硬。

图8是实施例3制得的G2C1-10%水凝胶的粘附性能的直观展示，图a, b显示该水凝胶可以和猪皮紧密地粘附在一起，弯折、扭转、水流冲击都不会使两者分离。由于是通过壳聚糖溶液使水凝胶和猪皮进一步粘附，因此可以实现局部粘附（图c），作为伤口敷料使用时可以避免与伤口直接粘结，造成伤口破损。

实施例4

在上述实施例1至实施例3的基础上，本实施例4进一步对明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶的可载药性进行验证试验，具体为：盐酸四环素作为一种广谱抗生素可以被载入明胶/酪蛋白水组织粘附性水凝胶中进而发挥抗菌功能，包括以下步骤：

首先，准备四个烧杯，每个烧杯中分别量取100mL去离子水，并称取0g、0.01g、0.03g、0.05g盐酸四环素作为四组对比例分别溶解于对应的烧杯中；

其次，制备混合溶液A’：向每个烧杯中分别添加25g明胶颗粒，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液A’留待后步使用；

制备混合溶液B：先将2.5g碳酸钠粉末溶于100mL去离子水中，再加入10g酪蛋白粉末，在50℃温度条件下搅拌均匀，制得混合溶液B留待后步使用；

制备混合溶液C：称取6.25g谷氨酰胺转移酶粉末溶于100mL去离子水中，室温下搅拌均匀，制得混合溶液C留待后步使用；

再次，将前步制备的8mL混合溶液B分别与四组16mL混合溶液A’混合，然后向四组对比例中分别加入2.4mL甘油，在50℃温度条件下搅拌至溶液混合均匀，最后向四组对比例中加入4.8mL溶液C，室温搅拌至均匀；

最后，将四组对比例中的混合溶液超声除泡后分别置于塑料模具中，在40℃温度条件下静置3小时，按水凝胶体系中盐酸四环素（TH）浓度的不同，将水凝胶分为0 TH、0.01%TH、0.03% TH、0.05% TH四组。

对本实施例4制得的四组水凝胶进行药物释放测试，结果如图9所示。药物在第一天内释放速度快，释放量大，之后药物开始缓慢释放。随着载药量的增大，水凝胶的药物释放量也增大。之后，对水凝胶的抗菌效果进行了抑菌圈实验，实验结果如图10所示，盐酸四环素的载入使水凝胶具有良好的细菌效果，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有抑制效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。