一种增强抗炎抗氧化活性功效的发酵液的制备方法及所得产品

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种增强抗炎抗氧化活性功效的发酵液的制备方法及所得产品。

技术背景

刺梨又名山王果、木梨子，属于蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木，主要分布在我国云贵川高原地区，以贵州省资源最为丰富，年产量最高。刺梨为药食同源类植物，其果实富含维生素C、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚、黄酮、多糖、三萜、氨基酸以及微量元素等多种活性成分。其中，多酚含量高达15.93 mg·g

羊肚菌（

厚朴，其木质朴而皮厚，故名厚朴，多在山区栽培且生长期较长，为国家二级珍稀保护植物，主要分布在湖北省、四川省、浙江省、江西省等地，其中以“川朴”为优。现代研究发现，厚朴中存在木脂素类、生物碱类、挥发油类等多种类型的化学成分，其主要有效成分具有抗肿瘤、抗炎、调节肠胃、保护肝脏等药理作用。其中，厚朴抗肿瘤作用明显，对肝脏、结肠、胰腺、肺等恶性肿瘤具有抑制作用。然而，厚朴作为一味传统中药，入方剂多以水煎为主，近几年来对厚朴水溶性成分的相关研究逐渐兴起，新的苷类、生物碱类等成分被发现。

现有技术中，刺梨汁本身的口感酸、涩，制备成相关饮品，口感较差；且尚未有将刺梨和厚朴发酵液制备饮品的相关记载。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种增强抗炎抗氧化活性功效的发酵液的制备方法。

本发明还提供了利用上述制备方法得到的发酵液。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种增强抗炎抗氧化活性功效的发酵液的制备方法，包括以下步骤：

（1）将刺梨清洗干净后，打浆得刺梨浆，将刺梨中加入米曲霉和果胶酶，室温下发酵，得发酵浆料，将发酵浆料灭酶后挤压过滤，得刺梨发酵液；

（2）将厚朴粉碎，过筛后得到厚朴粉；

（3）将厚朴粉中加入PDA液体培养基，边加入边搅拌，直至厚朴干粉变成既不松散也不成团，且紧握成团状而松开时分散的状态，得厚朴培养基；

（4）将厚朴培养基密封状态下高压蒸汽灭菌；

（5）发酵厚朴：夹取羊肚菌接入厚朴培养基的底部，搅拌均匀，封口后密封发酵培养，得到羊肚菌发酵厚朴的发酵物；

（6）取烘干的发酵物用70%乙醇（V/V）浸泡，用纱布过滤后，8000r/min离心得上清液，对得到的上清液进行旋蒸，旋蒸后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，再行研磨，得到粉末状羊肚菌发酵厚朴提取物；

（7）将刺梨发酵液中加入羊肚菌发酵厚朴提取物，搅拌均匀即可。

进一步的，步骤（1）中，所述果胶酶的加入量占刺梨重量的0.1%；所述米曲霉的加入量占刺梨重量的0.05%。

进一步的，步骤（1）中，所述发酵的时间为10-12h。

进一步的，步骤（2）中，所述厚朴粉为过60目筛所得。

进一步的，步骤（5）中，所述羊肚菌在厚朴培养基中的接入量为5-6%。

进一步的，步骤（5）中，所述发酵培养为在20℃培养箱中培养30d。

进一步的，步骤（6）中，所述发酵物和70%乙醇的体积比为1:10。

进一步的，步骤（6）中，所述浸泡为室温下浸泡24h。

进一步的，步骤（7）中，每L刺梨发酵液中羊肚菌发酵厚朴提取物的含量为0.15g。

本发明还提供了一种利用上述制备方法得到的厚朴刺梨汁饮料。

本发明所使用的羊肚菌，首先将羊肚菌的菌丝按照5%的接种量接种于PDA固体培养基中，然后在20℃的恒温培养箱中培养2‑3d。

本发明所使用的羊肚菌菌株为普通市售即可，如货号TS308771，其表观特征为：初期，羊肚菌菌丝为白色或淡黄色，有光泽，菌丝尖端呈多指状或树枝状分枝；中期，在培养基上形成菌落，菌落中心较老的菌丝分泌色素，使菌丝呈棕黄色，菌丝老化时，菌落由深棕色转为乌棕色，光泽消失。本发明所使用的果胶酶的酶活为10000u/g。

本发明的有益效果为：

（1）本发明通过对刺梨汁进行发酵预处理，能够降低刺梨汁的酸涩度，且制备出的刺梨汁稳定性好；

（2）本发明首次提供了一种增强抗炎抗氧化活性功效的中药发酵厚朴刺梨汁饮品，通过在刺梨汁中添加一定浓度的羊肚菌发酵厚朴提取物，两者协同作用下，提高了刺梨汁抗炎和抗氧化的作用，制备的饮片具有消食健脾、消渴解暑、解酒以及为人体提供大量维生素、抗炎抗和氧化的作用。

附图说明

图1为不同浓度发酵粗提物对RAW264.7细胞的增值抑制情况；

图2为厚朴提取物和羊肚菌发酵厚朴提取物对DPPH自由基的影响。

具体实施方法

为了使本发明的目的、技术手段及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。但是本发明的内容不仅限于实施例所述的范围。

实施例1羊肚菌发酵厚朴提取物的制备

1、羊肚菌的活化

羊肚菌是羊肚菌科、羊肚菌属真菌。其采用培养基组成为：每L培养基中马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15‑20g。将配制好的PDA固体培养基灭菌（115℃，30min）后冷却至50℃左右，移至超净工作台中进行倒平板，待平板中固体培养基成型后，取羊肚菌菌株，用竹签挑取菌丝接种（5%）在平板中央静置倒放在20℃的恒温培养箱中培养2d，得到活化后的羊肚菌。

2、厚朴的发酵

（1）粉碎厚朴：将厚朴粉碎，用60目的筛网筛选后，得到厚朴粉。

（2）将若干厚朴粉加入事先配制好的PDA液体培养基（1:10），边加入边搅拌，搅拌均匀，可加入适量蒸馏水，直至厚朴干粉既不松散也不成团，且紧握成团状而松开时分散的状态；

（3）把制好的厚朴装入盒子中，加塑料封口膜，加盖密封，并放入灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌，115℃、30min。

（4）发酵厚朴：夹取适当大小的羊肚菌接入厚朴培养基中（接种量5%），尽可能接入厚朴的底部，搅拌均匀，盖上塑料封口膜，加盖密封；20℃培养箱中培养30d，然后烘干至恒重，得到烘干的发酵物。

3、提取

取烘干的发酵物用10倍体积的70%乙醇（V/V）室温浸泡48h后进行离心，得上清液，对得到的上清液进行旋蒸，旋蒸后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，再行研磨，得到粉末状易保藏的羊肚菌发酵厚朴提取物。

实施例2羊肚菌发酵厚朴提取物抗炎能力测定

1、细胞复苏

取出冻存的RAW264.7细胞，转移至37℃的恒温水浴锅中，晃动使其融化。于1000rpm条件下离心5min，弃上清，重悬于DMEM完全培养基中，倒置显微镜下观察细胞密度。转移至培养箱内37℃、5% CO

2、细胞培养与传代

每2‑3天更换培养液，当细胞密度达70‑90%时传代。弃去旧培养基，PBS清洗两次，加入适量胰蛋白酶消化1‑2min，用含血清的完全培养基终止消化，吹打混匀后，1000 rpm离心5min，重悬于新鲜培养基，1：2分装，于培养箱内37℃、5% CO

3、细胞存活率测定

（1）复苏、培养上述细胞。

（2）将2.0～3.0×10

（3）用20%乙醇稀释制备的粗提物，制成含不同浓度粗提物的样品溶液。

（4）培养过夜，将浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL的羊肚菌发酵厚朴提取物、未发酵厚朴提取物样品溶液（直接采用70%浸泡厚朴粉48h）加入各个孔中，每孔5μl，每个浓度6个复孔，同时设置正常对照，同样设6个复孔，培养12-24h。

（5）向各孔中加入10μL CCK-8孵育2h。

（6）孵育结束后，放置在振荡器上振荡10min，振荡结束，置于酶标仪上，450nm处检测其OD值，按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率(%)＝[(样品孔OD值‑调零孔OD值)/(对照孔OD值‑调零孔OD值)]×100%。

实验结果如图1所示，在50‑200μg/mL范围内，羊肚菌发酵厚朴提取物和未发酵厚朴提取物对RAW264.7细胞均具有促进增殖的作用，且呈剂量依赖型增强巨噬细胞活性，前者较后者促进作用更加明显。在浓度达到150μg/mL时，效果最佳，相对于未发酵厚朴提取物处理后，存活率提高了15%。

实施例3羊肚菌发酵厚朴提取物抗氧化能力测定

配制10

A

A

A

由图2可知，厚朴提取物和羊肚菌发酵厚朴提取物均能清除DPPH自由基，其中羊肚菌发酵厚朴提取物效果更好，具有更强的抗氧化能力。

实施例4 刺梨汁的制备

将刺梨清洗干净后，打浆得刺梨浆，将刺梨中加入占刺梨重量的0.05%的米曲霉和0.1%的果胶酶，室温下发酵12h，得发酵浆料，将发酵浆料灭酶后挤压过滤，得刺梨发酵液。

分别在刺梨浆中添加不同量的米曲霉和果胶酶进行发酵，通过品尝评定其对刺梨发酵液涩味的影响，采用10分制进行打分。

表1

评测结果如表1所示，当同时添加米曲霉和果胶酶时，制备得到的刺梨发酵液涩味最低，当单一的添加米曲霉时，制备得到的刺梨发酵液口感会有特殊的苦味，而当单一的仅添加果胶酶时，虽然能够适当降低其涩味，但是刺梨汁会带有特殊的气味，而采用米曲霉和果胶酶共同发酵则无此气味，并且除涩效果更好。

实施例5

将每L刺梨发酵液中羊肚菌发酵厚朴提取物的含量为0.15g，得厚朴刺梨饮品。

将实施例5制备的饮品进行抗氧化能力测定，具体结果见表2。

表2

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。