一种多拉菌素的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种多拉菌素的分离纯化方法。

背景技术

多拉菌素(Doramectin，DRM)是大环内酯类抗生素阿维菌素的第3代衍生物，由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)基因工程变异株加入环已烷基羧酸后生物合成获得一种十六元大环内酯类半合成抗生素，与伊维菌素的差别为在C

多拉菌素对牛、马、猪和骆驼的多种胃肠道线虫、体外节肢动物具有极佳的驱虫效果。与其它市售的伊维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围广泛、体内血药浓度高，消除慢(多拉菌素半衰期5.7天，伊维菌素半衰期4.2天)，药效维持时间长，无过敏反应等特性，是伊维菌素良好的替代药物。

现有文献主要集中在对多拉菌素生产菌株的改良以及多拉菌素制剂的研究，针对多拉菌素分离纯化的研究较少，文献“发酵液中多拉菌素的提取和萃取条件研究”(天然产物研究与开发，邹泽先等，2012年，110-113)公开了以甲醇为最佳提取试剂，浓缩提取液再经2倍体积乙酸乙酯萃取2次的方法对发酵液中的多拉菌素进行提取和萃取。文献“响应面法优化发酵液中多拉菌素的脱色工艺”(邹泽先等，中国抗生素杂志，2011年，36(12)，第912～916页)公开了用甲醇做为提取试剂，采用活性炭进行脱色，活性炭的添加量为1.0％，脱色温度33℃，pH＝3的工艺条件对发酵液中多拉菌素进行脱色处理，脱色率达到68.78％。文献“多拉菌素的分离纯化工艺及其微胶囊剂型的初步研究”(邹泽先，武汉工业学院硕士学位论文，2011年，第13-37页)公开了用国产DM11树脂对多拉菌素进行分离纯化，纯度由4％左右增大至约45％，其总回收率在80％左右；再通过进行硅胶柱层析精制，可以使纯度达到约92％，总回收率约为60％。

前两篇文献只对产品的提取工艺进行了研究，第三篇文献虽然通过树脂、硅胶层析等步骤对产品进行了纯化，产品纯度较低，仅有92％，不能满足药品的质量要求；同时，由于使用了树脂、硅胶层析，收率也较低，总收率约60％，生产成本较高，不利于工业化生产。

中国专利CN104418927B公开了一种多拉菌素的分离纯化方法。该方法包括通过浸提，将多拉菌素从发酵液中分离，然后通过活性炭脱色处理，结合程序降温结晶法等步骤，得到高纯度的多拉菌素产品。本发明的优点在于采用程序降温结晶法进行分离纯化多拉菌素，收率和纯度高，工艺简单易行，生产成本低，适合工业化生产。

但是现有技术中分离纯化得到的多拉菌素，其纯度、收率和脱色效果均有待进一步提高。

因此，利用开发一种能解决上述技术问题的多拉菌素的分离纯化方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种纯度和收率高、脱色效果好的多拉菌素的分离纯化方法。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种多拉菌素的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)将多拉菌素发酵液加入聚丙烯酰胺，过滤，得到菌渣；

(2)向菌渣中加入溶剂A提取，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入溶剂B提取，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入溶剂C提取，过滤，得到滤液3；

(3)将滤液1、滤液2和滤液3混合，浓缩成浸膏，加入溶剂D和活性炭，过滤，得到滤液4；

(4)将滤液4浓缩、干燥，得到粗品；

(5)将粗品用溶剂E溶解，程序降温结晶，过滤、干燥，即得。

优选地，步骤(1)中所述聚丙烯酰胺的分子量为30万-100万。

优选地，步骤(1)中所述聚丙烯酰胺的质量为多拉菌素发酵液质量的1-5％。

更优选地，步骤(1)包括如下步骤：

将多拉菌素发酵液加入1-5％的聚丙烯酰胺(分子量为30万-100万)，过滤，得到菌渣。

优选地，步骤(2)中所述溶剂A为50-80％(体积分数)的乙醇溶液。

优选地，步骤(2)中所述菌渣与溶剂A的质量体积比为1:2-4g/mL。

优选地，步骤(2)中所述溶剂A提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h。

优选地，步骤(2)中所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为2-4:1-2:1。

更优选地，步骤(2)中所述滤渣1与溶剂B的质量体积比为1:2-4g/mL。

优选地，步骤(2)中所述溶剂B的提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h。

优选地，步骤(2)中所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为0.5-2:1。

优选地，步骤(2)中所述滤渣2与溶剂C的质量体积比为1:3-8g/mL。

优选地，步骤(2)中所述溶剂C的提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h。

更优选地，步骤(2)包括如下步骤：

(2)向菌渣中加入2-4倍量的50-80％(体积分数)的乙醇溶液提取，提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入2-4倍量的溶剂B(所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为2-4:1-2:1)提取，提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入3-8倍量的溶剂C(所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为0.5-2:1)提取，提取温度为40-60℃，提取时间为0.5-1h，过滤，得到滤液3。

优选地，步骤(3)中所述溶剂D为55-70％乙醇溶液与异丙醚的混合溶剂，两者体积比为1-3:2。

优选地，步骤(3)中所述浸膏与溶剂D的质量体积比为1:15-30g/mL。

优选地，步骤(3)中所述浸膏与活性炭的质量比为1:0.5-1.5。

更优选地，步骤(3)包括如下步骤：

将滤液1、滤液2和滤液3混合，浓缩成浸膏，加入15-30倍量的溶剂D(所述溶剂D为55-70％乙醇溶液与异丙醚的混合溶剂，两者体积比为1-3:2)和0.5-1.5倍量的活性炭，加热至50-70℃，搅拌1-2h后过滤，得到滤液4。

优选地，步骤(5)中所述溶剂E为丙酮和无水乙醇的混合溶剂，两者体积比为1-3:1。

优选地，步骤(5)中所述粗品与溶剂E的质量体积比为1:5-10g/mL。

优选地，步骤(5)中所述程序降温具体为：在50-60℃下搅拌1-2h，然后以1-2℃/min的降温速率降温至20-30℃，再以8-15℃/h的降温速率降温至5-10℃。

更优选地，步骤(5)包括如下步骤：

将粗品用5-10倍量的溶剂E(所述溶剂E为丙酮和无水乙醇的混合溶剂，两者体积比为1-3:1)溶解，在50-60℃下搅拌1-2h，然后以1-2℃/min的降温速率降温至20-30℃，再以8-15℃/h的降温速率降温至5-10℃，结晶，过滤、干燥，即得。

本发明的有益效果是：

本发明采用聚丙烯酰胺对多拉菌素发酵液进行了预处理，加速了菌渣的沉降，有利于提高多拉菌素的收率和纯度。

本发明通过优化溶剂A、溶剂B和溶剂C的组成，以及三种溶剂的提取顺序，保证了多拉菌素尽可能多地提取到溶剂中，从而提高多拉菌素的收率。

本发明优化了溶剂D的组成，进一步保证了多拉菌素尽可能多地提取到溶剂D中，同时避免了杂质的溶解，提高了多拉菌素的纯度。而且，本发明通过添加活性炭，达到了吸附脱色和吸附杂质的目的，不需要进行硅胶柱层析，制备方法更简单。本发明制备得到的多拉菌素脱色效果好。

本发明优化了溶剂E的组成以及降温程序，制备得到的多拉菌素纯度显著提高。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明各实施例和对比例中采用的多拉菌素发酵液原料购自重庆乾泰生物医药有限公司，发酵单位为1.2g/L。

实施例1

一种多拉菌素的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)将多拉菌素发酵液加入1％的聚丙烯酰胺(分子量为30万)，过滤，得到菌渣；

(2)向菌渣中加入2倍量的50％(体积分数)的乙醇溶液提取，提取温度为40℃，提取时间为0.5h，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入2倍量的溶剂B(所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为2:1:1)提取，提取温度为40℃，提取时间为0.5h，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入3倍量的溶剂C(所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为0.5:1)提取，提取温度为40℃，提取时间为0.5h，过滤，得到滤液3；

(3)将滤液1、滤液2和滤液3混合，浓缩成浸膏，加入15倍量的溶剂D(所述溶剂D为55％乙醇溶液与异丙醚的混合溶剂，两者体积比为1:2)和0.5倍量的活性炭，加热至50℃，搅拌1h后过滤，得到滤液4；

(4)将滤液4浓缩、干燥，得到粗品；

(5)将粗品用5倍量的溶剂E(所述溶剂E为丙酮和无水乙醇的混合溶剂，两者体积比为1:1)溶解，在50℃下搅拌1h，然后以1℃/min的降温速率降温至20℃，再以8℃/h的降温速率降温至5℃，结晶，过滤、干燥，即得。

实施例2

一种多拉菌素的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)将多拉菌素发酵液加入5％的聚丙烯酰胺(分子量为100万)，过滤，得到菌渣；

(2)向菌渣中加入4倍量的80％(体积分数)的乙醇溶液提取，提取温度为60℃，提取时间为1h，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入4倍量的溶剂B(所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为4:2:1)提取，提取温度为60℃，提取时间为1h，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入8倍量的溶剂C(所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为2:1)提取，提取温度为60℃，提取时间为1h，过滤，得到滤液3；

(3)将滤液1、滤液2和滤液3混合，浓缩成浸膏，加入30倍量的溶剂D(所述溶剂D为70％乙醇溶液与异丙醚的混合溶剂，两者体积比为3:2)和1.5倍量的活性炭，加热至70℃，搅拌2h后过滤，得到滤液4；

(4)将滤液4浓缩、干燥，得到粗品；

(5)将粗品用10倍量的溶剂E(所述溶剂E为丙酮和无水乙醇的混合溶剂，两者体积比为3:1)溶解，在60℃下搅拌2h，然后以2℃/min的降温速率降温至30℃，再以15℃/h的降温速率降温至10℃，结晶，过滤、干燥，即得。

实施例3

一种多拉菌素的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)将多拉菌素发酵液加入3％的聚丙烯酰胺(分子量为60万)，过滤，得到菌渣；

(2)向菌渣中加入3倍量的65％(体积分数)的乙醇溶液提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入3倍量的溶剂B(所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为3:1:1)提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入5倍量的溶剂C(所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为1:1)提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液3；

(3)将滤液1、滤液2和滤液3混合，浓缩成浸膏，加入20倍量的溶剂D(所述溶剂D为65％乙醇溶液与异丙醚的混合溶剂，两者体积比为1:1)和1倍量的活性炭，加热至60℃，搅拌1.5h后过滤，得到滤液4；

(4)将滤液4浓缩、干燥，得到粗品；

(5)将粗品用8倍量的溶剂E(所述溶剂E为丙酮和无水乙醇的混合溶剂，两者体积比为2:1)溶解，在55℃下搅拌1.5h，然后以1.5℃/min的降温速率降温至25℃，再以12℃/h的降温速率降温至8℃，结晶，过滤、干燥，即得。

对比例1

与实施例3的区别仅在于步骤(2)溶剂A-C提取顺序不同，其余条件均相同，具体如下：

(2)向菌渣中加入5倍量的溶剂C(所述溶剂C为乙酸乙酯和无水乙醇的混合溶剂，两者的体积比为1:1)提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液1和滤渣1；将滤渣1加入3倍量的溶剂B(所述溶剂B为甲醇、水和乙腈的混合溶剂，三者体积比为3:1:1)提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液2和滤渣2；将滤渣2加入3倍量的65％(体积分数)的乙醇溶液提取，提取温度为50℃，提取时间为0.75h，过滤，得到滤液3。

对比例2

与实施例3的区别仅在于步骤(2)溶剂B为等体积的甲醇，其余条件均相同。

对比例3

与实施例3的区别仅在于步骤(2)溶剂B为等体积的水和乙腈的混合溶剂，两者体积比为1:1，其余条件均相同。

对比例4

与实施例3的区别仅在于步骤(2)溶剂C中乙酸乙酯和无水乙醇的体积比为3:1，其余条件均相同。

对比例5

与实施例3的区别仅在于步骤(3)溶剂D中65％乙醇溶液与异丙醚的体积比为2:1，其余条件均相同。

对比例6

与实施例3的区别仅在于步骤(5)中的程序降温工艺不同，其余条件均相同，具体如下：以0.5℃/min的降温速率降温至25℃，再以5℃/h的降温速率降温至8℃。

对比例7

与实施例3的区别仅在于步骤(5)中的程序降温工艺不同，其余条件均相同，具体如下：以4℃/min的降温速率降温至25℃，再以20℃/h的降温速率降温至8℃。

对比例8

与实施例3的区别仅在于步骤(1)中聚丙烯酰胺替换为等质量的硅藻土，其余条件均相同。

测试例1

多拉菌素的纯度参照中国专利CN104418927B记载的方法进行测试。多拉菌素的纯度和收率如表1所示。

表1

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。