神经元前体细胞的扩增和分化

技术领域

本发明涉及神经元前体细胞的制备，包含其的组合物和治疗性用途。

背景技术

在说明书中对任何现有技术的引用并不是承认或表明该现有技术构成任何管辖范围内的公知常识的一部分或者该现有技术可被合理地预期为被本领域技术人员理解为、视为与其他现有技术部分相关和/或组合。

多能干细胞是用于从头制备神经元的惯常起点——细胞在其原始复制状态下的扩增随后定向分化为成熟的神经元表型。多能干细胞可从胚胎来源(即胚胎干细胞)或成体干细胞储库(即成体干细胞，例如间充质干细胞)中分离，或者如最近发现的那样，通过将成熟的分化后细胞(例如成纤维细胞)重编程为胚胎样干细胞(即诱导多潜能干细胞)。

根据定义，这些方法中的每一种均具有能够具有多种细胞命运(即多能)的通用限制。因此，神经元的产率低且可变化，甚至在用特定的神经元分化条件处理之后导致非神经元细胞表型。例如，在这样的处理之后神经胶质细胞分化是常见的限制。出于生物学研究、商业应用或治疗性用途的目的，能够产生均质的单能神经前体群(即，一致的、瞬时复制且命运忠于(fate-committed to)神经元谱系的细胞)将是有用的。

迄今为止，最接近的近似法已将成熟的分化后细胞(例如成纤维细胞)直接遗传重编程为有丝分裂后神经元，通过上调关键神经元诱导基因来绕过增殖干细胞或前体阶段(Vierbuchen et al.，2010，Pang et al.，2011，Son et al.，2011，Zhou et al.，2014，Tsunemoto et al.，2018)。然而，该方法依赖于遗传操作且不产生可扩增的群体，并且像提到的所有方法一样遭受不可接受地高的系间(line-to-line)变异性(Truong et al.，2016)。

考虑到这一点，有趣的是人皮肤和中枢神经系统共有相同的胚胎学起源，外胚层生殖谱系(ectoderm germ lineage)。很少认识到这两种器官中的成体干细胞和前体表达许多相同的细胞标志物(例如，巢蛋白、CD133、Sox2等)，并利用许多相同的细胞周期调节因子(头蛋白、SHH、FGF、EGF、BDNF等)。

在2001年，Toma et al.2001)首次证明了哺乳动物毛囊微环境(niche)中的多能干细胞确实可在体外产生神经元，尽管分化之后产率很低(＜15％)，且大多数细胞发展为非神经元细胞类型。这一基本结果此后已被该团体(Vierbuchen et al.，2010，Pang etal.，2011，Son et al.，2011，Zhou et al.，2014，Tsunemoto et al.，2018)和其他团体(Joannides et al.，2004，Yu et al.，2010，Yu et al.，2006，Belicchi et al.，2004)使用人皮肤重复。有趣的是，最近也已显示出相反的情况：Hwang et al.(2016)发现(人胎儿来源的)真正的神经干细胞提取物可提高脱毛小鼠中的体内毛发再生。

因此，尽管两种器官系统在结构和功能方面截然不同，但它们保留了控制干细胞和前体细胞增殖的许多相同生物学机构。此外，来自一个微环境的干细胞和前体可仅凭借环境提示来承担另一个的角色和特征。鉴于在从其生理微环境(在脑中)获取成人神经干细胞方面的困难，从概念上启发了在不借助遗传操作的情况下，神经前体可从来自其自身的毛囊前体群的给定个体获得。

迄今为止，该假定在实践中失败了。来自天然人皮肤的细胞生存力和神经元产率太低并且系间变异性太大。

在这种背景下，前体的来源——成人毛囊——包含单能前体细胞以及多能干细胞二者。由于命运仅限于一种细胞谱系并且不能在体外进行无限细胞复制，因此单能前体在根本上不同于多能干细胞。最近，已发现毛囊中的瞬时扩增前体细胞之间存在大的异质性，并且这种变异允许发展具有不同谱系命运的亚群(Yang et al.，2017)。此外，这种“谱系失真(lineage infidelity)”在伤口修复、致瘤性转化或体外细胞培养的条件下最大程度地出现(Ge et al.，2017，Fuchs，2018)。

迄今为止，尚未认识到人毛囊干细胞或前体细胞的亚群具有潜在的神经元命运限制的能力。

从成熟的皮肤分离和扩增这样的单能神经前体的设施在物种之间大不相同。例如，我们先前已开发了关于成年犬皮肤的方法(Valenzuela et al.(2008))，但是由于在毛囊数量和品质方面的大的个体间和个体内差异，因此该方法通常不适用于人皮肤。

发明内容

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理经调节细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球的条件下处理经调节细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球的条件下处理经调节细胞的样品；

-为神经球样品提供条件以扩增神经球的细胞数目；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-为经调节细胞的样品提供条件以使细胞能够解离成单细胞；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球的条件下处理经调节细胞的样品；

-为神经球样品提供条件以扩增神经球的细胞数目；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理经调节皮肤的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-从经调节皮肤的样品中耗竭终末分化细胞或凋亡细胞或细胞碎片，从而形成非终末分化细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-将细胞从经调节皮肤释放到样品中；

-从经调节皮肤的样品中耗竭终末分化细胞或凋亡细胞或细胞碎片，从而形成非终末分化细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在另一些实施方案中，提供了通过上述方法产生的细胞的组合物。组合物可包含治疗有效量的细胞和可药用稀释剂、载体或赋形剂。组合物的细胞组分可由通过上述方法产生的细胞组成，或者细胞组分可包含通过上述方法产生的细胞并且还包含其他细胞。可改变组合物使得能够注射或输注。

在另一些实施方案中，提供了细胞组合物用于治疗，例如用于治疗神经组织的病症或疾病的用途。因此，在一个实施方案中，提供了用于在需要所述治疗的个体中治疗疾病或病症，优选神经组织的疾病或病症的方法，其包括向需要所述治疗的个体施用上述组合物，从而在所述个体中治疗所述疾病或病症。

在另一些实施方案中，提供了用于治疗疾病或病症，优选神经组织的疾病或病症的上述细胞的组合物。

在另一些实施方案中，提供了上述细胞的组合物在制备用于治疗疾病或病症，优选神经组织的疾病或病症的药物中的用途。

在另一个实施方案中，提供了用于治疗疾病或病症，优选神经组织的疾病或病症的一种或更多种装置，其包含上述细胞的组合物。

除上下文另有要求的情况之外，本文中使用的术语“包含/包括”及该术语的变化形式并不旨在排除另外的添加项、组分、整体(integer)或步骤。

从通过实例的方式给出的以下描述中，本发明的另一些方面以及前述段落中描述的方面的另一些实施方案将变得明显。

附图说明

图1.在具有或不具有先前用音猬因子(sonic hedge hog，SHH)化学预处理6或72小时的情况下，在神经球解离之后，每个毛囊的典型细胞产率。数据来自一位45岁的男性。

图2.在用胶原酶/分散酶处理和研磨进行的立即的毛囊酶促处理之后优异的细胞产率。

图3.来源于45岁男性(上排)和25岁男性(下排)的毛囊的典型神经球的明视野显微图。

图4.针对一系列典型的神经前体生物标志物染色的神经球的荧光显微图。A)普遍存在的神经干细胞标志物巢蛋白(＞90％的细胞呈阳性)。B)神经祖细胞标志物双皮质素(DCX；＞80％的细胞呈阳性)。C)未成熟的神经元标志物βIII-微管蛋白(B3T；＞50％的细胞呈阳性)。D)阴性对照(无一抗(no primary))。所有的神经球均来源于一位34岁男性的毛囊。

图5.HFN的单层扩增。来自25岁男性的汇合HFN的典型形态的明视野显微图。荧光图像示出了干细胞标志物CD133和神经干细胞标志物巢蛋白和未成熟的神经元标志物βIII-微管蛋白(B3T)的普遍存在(＞90％阳性)的蛋白质表达。HFN细胞的荧光图像来自一位45岁的男性。

具体实施方式

本发明提供了用于产生前体神经元细胞组合物的方法，其能够产生遗传上未经修饰的人细胞，所述细胞显示出有限的系间变异性和迅速扩增成商业上可用的细胞数目的能力。所述方法包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理经调节细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

通过所述方法产生的组合物的细胞是神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的更普遍增殖的细胞。神经谱系生物标志物涵盖了发育谱，其可包含(最原始地)神经干细胞样标志物巢蛋白、放射状神经胶质细胞标志物GFAP、成神经细胞标志物双皮质素(DCX)和NCAM以及未成熟的神经元标志物βIII-微管蛋白。还可表达更通用的干细胞样标志物，例如CD133、Sox2和OCT4。对这些标志物呈阳性的细胞在神经球中富集，并且其具有形成终末分化神经元的潜力。通常来说，这些细胞是多能的，即具有产生神经谱系的终末分化细胞(例如神经元和神经胶质)的潜力。

通常来说，所述方法的初始步骤涉及毛囊细胞的处理。如下所述，这些细胞可以以具有毛囊的皮肤样品的形式获得。或者，这些细胞可从毛囊分离物获得。如通常已知的，毛囊细胞可处于在生长背景中的一系列时期(生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen))中而存在。休止期是静止阶段(resting phase)(即，无生长)，生长期是生长阶段(growth phase)，并且退行期是生长期与休止期之间的中间阶段。处理步骤导致处于生长阶段或生长期的毛囊细胞的富集。富集可由以下产生：刺激毛囊细胞以使得处于休止期的那些细胞转换到生长期，和/或阻止处于生长期的细胞转换到退行期。作为处理步骤的结果，存在具有在生长期中形成神经谱系生物标志物的潜力的毛囊细胞的特别富集。

在另一个步骤中，对细胞进行处理以富集或以其他方式提高包含神经元谱系生物标志物的细胞数目。这可通过提高包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的处理和/或通过降低不包含神经元谱系生物标志物的细胞数目来实现。在一个特别优选的步骤中，在使得能够形成神经球的条件下处理细胞。用于神经球形成的方法通常是本领域中公知的，并且在本文中进一步例示。在一个实施方案中，通过在生物反应器中培养细胞来对细胞进行处理以富集或以其他方式提高包含神经元谱系生物标志物的细胞数目，或者使得能够形成神经球。可利用生物反应器来提供改善的条件以形成神经球。

现在描述本发明的第一实施方案，其中利用包含毛囊的皮肤样品来获得神经元前体细胞的组合物，据此，在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理包含毛囊细胞的皮肤样品，从而形成经调节皮肤的样品；并且在此之后，在使得能够富集样品中包含神经谱系特异性生物标志物的细胞数目的条件下处理经调节细胞的样品，从而产生神经元前体细胞的组合物。

所述方法的第一步骤可涉及收获包含毛囊细胞的皮肤样品。优选地是，样品从包含最高和最一致的毛囊密度的人头皮皮肤，优选枕中线头皮皮肤获得。该皮肤通常在个体之间包含较高密度的活性毛囊。我们已发现，与包含较低密度的毛囊的皮肤区域相比，包含较高密度的活性毛囊的皮肤区域使该方法能够产生更大数量和更高品质的细胞。

毛囊的细胞通常包含来自不同微环境的前体和干细胞，包括隆突区(bulgearea)、毛芽区(germ zone)和真皮乳头，其统称为毛囊前体。毛囊前体可表达神经外胚层生物标志物。

然后在使得基本上所有毛囊前体能够转换到生长阶段的条件下处理收获的皮肤样品。该步骤是重要的，因为其有助于提高神经前体细胞的产率。在本文中的实施例中较为详细地描述了该步骤的一个示例。

该步骤通常涉及体外调节人皮肤样品，其目的是提供支持皮肤样品细胞的细胞存活并且使细胞能够转换到生长期(或囊细胞周期的活跃生长阶段)的条件。

在此步骤之前，皮肤样品的细胞可处于囊周期的生长期、休止期或任何其他阶段。优选的是，大多数毛囊前体在收获时处于生长期，但是这不是必需的，因为体外培养的最终结果是使大多数毛囊前体转换到生长期。

可利用抗不应性毛囊因子(anti-refractory hair follicle)和/或促生长因子来促进毛囊前体和干细胞向生长期的转换，从而使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段。抗不应性毛囊因子的一些实例包括头蛋白或音猬因子(SHH)，或者激活Wnt1信号传导途径或抑制骨形态发生蛋白(促不应性)刺激的因子。抗不应性因子的另一些实例包括WNT，以及BMP拮抗剂，例如Grem1和Bambi。TGF-β2是关键的促生长因子，促生长因子的另一些实例包括FGF7、FGF10和血小板来源的生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)。

皮肤样品的体外调节通常利用支持上皮细胞的体外生存力和毛囊的器官发生的细胞培养基。Williams培养基E是一个实例。另一些实例包括杜氏改良eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)加F-12的不同组合、F12加哺乳动物血清的不同组合以及不同的补充的磷酸盐缓冲盐水组合。

通常体外调节持续12至100小时的时间，尽管在一些情况下可能培养更长的时间。

在培养时间期间可监测体外培养的进程。例如，可通过分离的毛囊内毛干(hairshaft)的生长来评估细胞或培养物的特征。

优选的是，在体外细胞培养完成时，至少80％的细胞处于生长期。

在培养完成时，由此获得了经调节皮肤的样品，许多细胞将仍然被皮肤组织的胞外基质和非细胞组分包埋(entrap)在经调节皮肤内。这些细胞待从皮肤组织释放。根据该方法，通过在使得能够降解经调节皮肤的胞外基质以从经调节的皮肤释放细胞的条件下使皮肤与一种或更多种酶接触，从而将细胞释放到样品中。通常来说，酶是选自以下的一种或更多种：胰蛋白酶、DNA酶、分散酶、胶原酶以及Accustase和TrypLE的组合。

根据经调节皮肤的性质，作为替代，可通过机械手段从经调节的皮肤释放细胞，所述机械手段通过破坏经调节的组织来将组织切碎或分离成较小的颗粒。

在一些实施方案中，通过酶促处理和机械处理的组合使细胞从经调节的皮肤释放。酶促处理和机械处理可同时发生，尽管通常来说，在开始进行机械处理之前开始进行酶促处理。

在从经调节皮肤组织样品释放细胞的步骤完成时，提供了释放的细胞，其可悬浮在细胞培养基以及皮肤组织的胞外基质的非细胞组分和其他非细胞组分中。这些通常在开始后续步骤之前去除。可利用离心和过滤。该方法的一个示例在本文中的实施例中描述。

从经调节的皮肤释放的细胞的组合物是异质性的，包含神经元前体细胞、其他多能细胞和终末分化细胞(包括成纤维细胞、角质形成细胞和皮肤组织的表皮层和真皮层的其他细胞)，这取决于收获组织的地方。下一步骤需要获得主要由神经前体细胞构成的细胞的样品。然后，这需要从经调节的人皮肤释放的细胞的组合物中去除作为非神经前体细胞的细胞。待去除的细胞通常是终末分化细胞(即角质形成细胞、成纤维细胞、其他真皮细胞和表皮细胞以及凋亡细胞)。

在一个实施方案中，通过在使得能够从样品中选择性耗竭终末分化细胞的条件下使样品与用于从样品中选择性耗竭终末分化细胞的试剂接触，从样品中耗竭终末分化细胞。优选地，试剂是与终末分化细胞结合但不与非终末分化细胞结合的抗体。不与神经前体细胞结合的抗体，优选单克隆抗体，对于该步骤是有效的。优选地，抗体与表皮或真皮的细胞，例如角质形成细胞或成纤维细胞结合。抗体的一些实例包括与成纤维细胞特异性抗原1或与CD45(这些不是存在于神经元前体细胞表面上的抗原)选择性结合的那些。

耗竭步骤完成时，样品包含按数量计不超过约5％的终末分化细胞。

因此，根据本发明的第一实施方案，提供了用于产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-将细胞从经调节皮肤释放到样品中；

-从样品中耗竭终末分化细胞或凋亡细胞或细胞碎片，从而形成非终末分化细胞的样品；以及任选地

-在使得能够扩增样品中非终末分化细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞的组合物。

所述方法可在没有从经调节的皮肤释放细胞的单独步骤的情况下实施。例如，在毛囊细胞转换到生长阶段的处理步骤的条件下，细胞可从皮肤释放到样品中。因此，所述方法可广泛地包括通过以下产生富含神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-从经调节皮肤的样品中耗竭终末分化细胞或凋亡细胞或细胞碎片，从而形成非终末分化细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

或者，可需要实施如在包括以下的方法中的单独的处理步骤以从经调节皮肤释放细胞：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-将细胞从经调节皮肤释放到样品中；

-从经调节皮肤的样品中耗竭终末分化细胞或凋亡细胞或细胞碎片，从而形成非终末分化细胞的样品；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在一些实施方案中，从经调节皮肤的样品中耗竭终末分化细胞的步骤可在以下步骤期间或作为以下步骤的一部分进行：在使得能够富集包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理非终末分化细胞的样品。例如，在一个实施方案中，导致富集包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件可包括有利于损失终末分化细胞、多能细胞或具有除产生神经谱系细胞之外的潜力的细胞的条件。因此，在一个实施方案中，该方法可包括：

-在使得皮肤中的毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理皮肤样品，所述皮肤包含毛囊细胞，从而形成经调节皮肤的样品；

-任选地，将细胞从经调节皮肤释放到样品中；

-在使得能够富集样品中包含神经元谱系生物标志物的细胞数目的条件下处理来自经调节皮肤的细胞样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

现在描述本发明的第二实施方案，其中利用毛囊样品来获得神经元前体细胞的组合物，所述毛囊样品从在天然状态下附着于其的皮肤组织中分离、或是以其他方式分开，使得毛囊样品不附着于皮肤组织。使用分离的毛囊的一个特别的优势在于所述方法可在不大量使用酶或机械手段的情况下实施，在其他情况下需要酶或机械手段从周围皮肤组织释放毛囊细胞。此外，这也避免了终末分化的真皮细胞和非神经元谱系细胞对后续培养的污染。根据该实施方案，所述方法产生了富含神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物，并且包括以下步骤：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球的条件下处理经调节细胞的样品；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

经调节细胞的样品通常富含处于生长阶段的毛囊细胞，并且包含显示神经元谱系生物标志物的细胞。

在神经球的形成完成时，通过扩增步骤提高作为神经前体细胞或表达神经谱系生物标志物的神经球的细胞数目可以是有利的。存在用于该目的的多种已知的技术。因此，在另一个实施方案中，提供了用于产生富含神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球样品的条件下处理经调节细胞的样品；

-为神经球样品提供条件以扩增神经球的细胞数目；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

在处理毛囊细胞以使细胞转换到生长阶段的步骤完成时，可将细胞与其他细胞或材料一起聚集或分组，在这种情况下，可将细胞解离以形成单细胞的混悬液。这可通过本领域中已知的多种技术来实现。在一个实例中，使用酶促解离，其使用可用于将毛囊细胞解离成单细胞的酶。因此，在另一个实施方案中，提供了用于产生富含神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物的方法，其包括：

-在使得毛囊细胞能够转换到生长阶段的条件下处理毛囊细胞的样品，从而形成经调节细胞的样品；

-为经调节细胞的样品提供条件以使细胞能够解离成单细胞；

-在使得能够从经调节细胞的样品中的细胞形成神经球样品的条件下处理经调节细胞的样品；

-为神经球样品提供条件以扩增神经球的细胞数目；

从而产生神经元前体细胞或表达神经谱系生物标志物的能够增殖的细胞的组合物。

根据本发明的第二实施方案，从枕中线头皮获得的约200个毛囊的样品可在促进生长期的环境中调节多至100小时的时间。可将所得细胞酶促解离成单细胞以提供约10

应当理解，在本说明书中公开和限定的本发明扩展至所提及的单独特征中两个或更多个的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多个替代方面。

实施例

如下从枕部头皮收获成人皮肤：对枕部进行剃毛、消毒和麻醉，之后收获。使用双刀片手术刀，在中线周围的轴向平面中周向取10mm宽、3cm长的样品，全厚度直至脂肪层。

用抗不应性或促增殖毛囊调节因子调节供体皮肤组织多至100小时提高了整个皮肤样品的生长期：休止期比例，以及提高了囊间同步性。因此，用这样的因子预处理供体皮肤组织提高了最终的细胞生存力、产率和一致性。在补充型Williams’E培养基环境内进行皮肤的孵育，这离体提供了提高的原位毛囊生存力。头蛋白或SHH作为样例抗不应性毛囊细胞周期因子提高了生长期：休止期比例，并且因此提高了最终的细胞生存力、产率和一致性。TGF-β2作为样例促增殖毛囊细胞周期因子提高了生长期：休止期比例，并且因此提高了最终的细胞生存力、产率和一致性。在补充型Williams’E培养基中头蛋白、SHH和TGF-β2的组合提供了高的细胞生存力、产率和一致性。在实践中：

1.修剪掉过量的皮下脂肪，确保真皮乳头作为暗点可见并保留在皮肤样品的脂肪侧上。

2.用PBS中的1％抗-抗(anti-anti)将剩余的皮肤另外洗涤3次

3.用手术刀将样品切成4mm×10mm的碎片。

4.在补充有10微克/ml胰岛素加：100至500ng/ml头蛋白(12至100小时)、100至500ng/ml SHH(12至100小时)或50ng至200/ml TGF-β2(Foitzik et al.，1999a)(12至100小时)、或者其组合的补充型Williams’E培养基(包含11.1mM葡萄糖和2mM L-谷氨酰胺)中孵育皮肤碎片。

用于皮肤解离的机械装置与用于从胞外基质释放前体细胞的酶促消化组合可提高细胞生存力、产率和一致性。一个样例组合是与gentleMACS酶促消化试剂盒组合使用的Miltenyi Biotec gentleMACS解离器装置，其一起提高了细胞生存力、产率和一致性。

在专有使用说明之外的细胞过滤的定制方法提供了高的细胞生存力、产率和一致性。

1.准备gentleMACS解离酶(以下体积是针对4×4mm皮肤碎片的)。

2.小心地混合缓冲液L(435ul)和酶P(12.5ul)

3.小心地混合酶D(50ul)和酶A(2.5ul)

4.在C管内将D/A混合物添加至L/P混合物

5.将4个皮肤碎片放置在含有酶的C管中，并拧上盖。

6.在37℃下孵育12小时

第二天

7.开始之前，配制至少50mL冷的洗涤培养基(DMEM/F12 3∶1+1％抗-抗)，并温热至少50mL生长培养基(DMEM/F12 3∶120ng/mL EGF+40ng/mL FGF2+2％B27)

8.通过添加0.5ml冷的洗涤培养基，稀释每个C管的内容物

9.再次拧紧C管盖，并将其倒置依附于gentleMACS解离器的套筒上。

10.在gentleMACS上选择程序h_skin_01，并按开始。

11.在离心机中以45秒@300×G将管中的内容物旋转向下至底部。

12.将来自C管的内容物清空于放置在6孔板孔上方的丝网过滤器上

13.使用洗涤培养基将内容物通过过滤器清洗到孔中

14.当你进行时，从过滤器去除任何大的阻塞性组织碎片。注意：在你通过吸取冷的培养基至其上而将其彻底洗涤之后仅去除组织碎片。

15.使用洗涤培养基将所有C管彻底清洗到50mL管中。

16.吸取这些使其通过过滤器到相同的6个孔中

17.将40uM过滤器放置在50mL管上，并用洗涤培养基润湿滤网。

18.通过40uM过滤器过滤细胞/培养基混合物

19.通过第二个40uM过滤器过滤细胞/培养基混合物，重复上述过滤步骤。

20.以300×g将细胞离心10分钟。完全去除上清液。

潜在污染细胞的耗竭与不进行这样的耗竭相比提高了细胞生存力、产率和一致性。一个样例方法使用Miltenyi MACS磁性细胞分离系统用于这样的活细胞耗竭。使用该装置，耗竭终末分化细胞类型提高了细胞生存力、产率和一致性。可使用一种或更多种标志物来耗竭成熟的、非神经球形成细胞，例如：成纤维细胞(成纤维细胞特异性抗原1)或上皮细胞(CD45)。使用该装置，用Miltenyi死细胞去除试剂盒耗竭凋亡细胞和碎片也提高了细胞生存力、产率和一致性。

对于凋亡细胞的耗竭：

1.对于每10

2.对于每约10

3.充分混合并在室温(20℃至25℃)下孵育15分钟。

4.根据细胞数目选择柱类型，并将柱放置在MACS分离器的磁场中。

5.通过用1×结合缓冲液(MS：500μL；LS：3mL)进行清洗来准备柱。

6.以合适量的1×结合缓冲液将细胞混悬液施加到柱(MS：500至1000μL；LS：1至10mL)上。让阴性(未经标记的)细胞级分穿过，到包含温热的DMEM的15mL管中。

7.用适当量的1×结合缓冲液(MS：4×500μL；LS：4×3mL)对柱进行清洗并收集未经标记的细胞

8.将细胞以300×g离心10分钟。

9.通过用autoMACS清洗液1∶20稀释MACS BSA储备溶液来制备缓冲液。使缓冲液保持低温(2℃至8℃)。

10.完全从细胞去除上清液，并且对于每10

11.充分混合，并在室温(19℃至25℃)下孵育30分钟。

12.通过添加1至2mL缓冲液/10

13.完全吸出上清液。在500μL缓冲液中重悬多至10

14.根据细胞数目选择柱类型，并将柱放置在MACS分离器的磁场中。通过用缓冲液进行清洗来准备柱。

15.将细胞混悬液施加到柱上。收集包含未经标记细胞的流通物。用适当量的缓冲液对柱进行洗涤。收集穿过并与流出的细胞混悬液组合的未经标记的细胞。

1.以350×G将未经标记的细胞级分离心10分钟。

2.去除上清液，并将沉淀重悬于5mL SKN生长培养基(DMEM/F12(3∶1)，20ng/mLEGF，40ng/mL bFGF和2％B27)中

3.移取10uL至微瓶中，并与10uL台盼蓝(Trypan blue)混合。记录细胞计数和生存力。

4.用SKN生长培养基稀释细胞混悬液，并以每孔6mL培养基中1×10

5.在37℃、5％CO2下孵育-这表示培养第0天。

6.传输所有记录和图像以存档。

7.培养第1天：评估污染的迹象，并且如果需要的话处理(dispose)培养物。

8.培养第5天和第7天：在低和高放大率下对细胞进行拍照，并测量神经球尺寸。记录关于培养物生长的观察。如果大多数神经球的直径＞50um(首次出现之后约1天)，则进行2D单层扩增。第7天之后，每天监测神经球尺寸。解离必须在大多数神经球变得＞100um或贴壁之前发生。

避免球体开始黏附至板，因为它们将变得难以回收和解离。目标是大多数直径约100μm的球体。在最初的1至2天出现的大的不规则细胞簇是细胞聚集体，而不是神经球。它们表明细胞密度太高或组织未充分解离。

1.在开始之前，用0.5μg/cm

2.在高和低放大率两种情况下拍摄球体的照片

3.将所有包含球体的培养基从培养孔转移到离心管中。

4.以300×G离心10分钟。

5.去除上清液，并重悬于1mL TrypLE中。在培养箱中放置5分钟

6.从培养箱中取出细胞，并通过上下吸取(用200uL移液器)100至200次使球体破碎

7.添加2mL生长培养基并充分混合

8.移取10uL混悬液至具有10uL台盼蓝的小瓶中并进行细胞计数。

9.记录总的活细胞和死细胞计数

10.根据需要在另外温热的生长培养基中稀释细胞混悬液

11.为准备T25烧瓶，去除层黏连蛋白511

12以1×10

13.以最少的移动将细胞返回培养箱，持续最初的24小时。

14.24小时之后将培养基更换成新鲜的生长培养基

15.每3天更换生长培养基。当烧瓶为约80％汇合时，用TryPLE对细胞进行传代，以1×10

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