鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针。

背景技术

马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS，D.solani)是一种新发现的对欧洲马铃薯生产造成严重威胁的细菌有害生物。Dickeya属病菌(原Erwinia chrysanthemi) 可引起世界上许多作物和观赏植物病害。20世纪70年代，Dickeya属病菌在荷兰马铃薯上首次报道(Maas Geesteranus,1972)，之后在欧洲多个国家也相继发生为害。但从2004年开始，一种新的病原菌，通过种薯贸易在欧洲和欧洲以外的许多马铃薯种植地区蔓延开来，引起严重的经济损失。2012年尚未被正式命名的‘Dickeya solani’被《molecular plantpathology》评为排名前十的植物病原细菌(John et al.,2012)。 2014年，van der Wolf等通过多位点序列分析(Multilocus sequence analysis，MLSA)、脂肪酸分析、DNA-DNA杂交等一系列实验，将该病菌命名为Dickeya solani(van der Wolf et al.，2014)。

由马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS)引起的马铃薯黑胫病(Blackleg ofpotato)是我国进境检疫性有害生物之一(2021年新增列入名录)。病菌主要侵染马铃薯茎基部和薯块，在马铃薯各个生长阶段均可发病(Sawiak et al.，2009)。病菌主要通过带菌种薯传播，由伤口或茎皮孔侵入组织，导致地下部块茎腐烂与地上部植株茎腐及叶片枯死，严重时全株枯死。维管束组织自茎基部开始变褐，逐渐延至上部，最终导致茎基部中空坏死(Toth et al.，2011；Sarris et al.，2011)。

Dickeya solani在马铃薯上危害十分严重，正式命名以前就引起多个国家关注，风险分析后列入检疫性有害生物，其危害程度远远高于Dickeya属内的其他种。随着农产品贸易及种植资源交流的发展，病菌随农产品和植物产品在贸易中传入的风险增加，会对我国农业发展和农产品贸易构成严重的威胁。马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的世界第四大粮食作物。我国是马铃薯生产大国，种植面积与产量均居世界第一，该病菌一旦传入，将使我国马铃薯种植业遭受巨大的损失。近年来我国的种苗贸易逐年递增，各地口岸已从进境种球上多次截获该有害生物。因此，为了保护我国相关产业安全，防止有害生物的传入和疫情扩散，十分必要建立一套快速、准确、特异、灵敏、方便、可靠、稳定的分子检测方法，可在球茎样品的常规检测、分离株诊断和疫情监测方面发挥作用，为进口检疫提供可靠、有效的技术保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌(Dickeyasolani，DS)。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了马铃薯黑胫病菌的特异性引物对，所述引物对由引物Ds4和引物Ds5组成；所述引物Ds4为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物Ds5为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。

所述引物对名称为Ds4/Ds5。

所述引物Ds4为正向引物，所述引物Ds5为反向引物。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的组合物，所述组合物由特异性引物对Ds4/Ds5和马铃薯黑胫病菌特异性探针组成，所述马铃薯黑胫病菌特异性探针为P-Dsol，所述P-Dsol的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

进一步地，所述P-Dsol为TaqMan-MGB探针。

所述P-Dsol可为在SEQ ID No.3所示的单链DNA分子的5’端连接有荧光报告基团和3’端连接非荧光淬灭基团(MGB)的TaqMan-MGB探针。

所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3、JOE、 TexasRed、LC RED640或LC RED705中的任一种；所述淬灭基团为选自MGB-λ、MGB 中的任一种。

进一步地，所述探针P-Dsol的5’端连接有FAM，所述探针P-Dsol的3’端连接有MGB。

所述组合物名称为Ds4/Ds5-Dsol。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的方法，所述方法包括如下步骤：

A1)提取待测样品基因组DNA；

A2)以所述基因组DNA为模板，用组合物Ds4/Ds5-Dsol进行实时荧光PCR反应；根据实时荧光PCR的扩增曲线确定待测样品是否含有马铃薯黑胫病菌或对待测样品中的马铃薯黑胫病菌进行定量检测。

上述方法中，所述根据实时荧光PCR的扩增曲线确定待测样品是否含有马铃薯黑胫病菌的方法为：如果实时荧光PCR的扩增曲线为S型曲线确定待测样品中含有马铃薯黑胫病菌或为马铃薯黑胫病菌；如果实时荧光PCR的扩增曲线不为S型曲线，确定待测样品中不含有马铃薯黑胫病菌或不为马铃薯黑胫病菌。

上述方法中，步骤A2)所述实时荧光PCR反应程序为95℃预变性10s；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。

上述方法中，步骤A2)所述实时荧光PCR反应体系为25μL，包括12.5μL 2× PremixEx Taq，引物Ds4和引物Ds5(5μmol/L)以及探针(5μmol/L)各1μL，1 μL模板DNA，0.5μL 50×ROX Reference DyeⅡ，加无菌水补至25μL。

上述方法中，步骤A1)所述提取待测样品基因组DNA包括如下步骤：

供试菌株在营养琼脂(NA)平板上划线，28℃培养48h，无菌水洗脱，取菌液1mL， 12000r/min(13523g)离心5min，收集菌体，用植物基因组DNA提取试剂盒提取 DNA。种球和种苗样品的DNA提取方法可以浸泡组织样品后离心处理液，沉淀参考上述方法提取DNA。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的方法，所述方法包括如下步骤：

A1)提取待测样品基因组DNA；

A2)以所述基因组DNA为模板，用引物对Ds4/Ds5进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有一个491bp的DNA片段，所述待测样品中含有马铃薯黑胫病菌或所述待测样品为马铃薯黑胫病菌；如果所述PCR产物不含有一个491bp的DNA片段，所述待测样品中不含有马铃薯黑胫病菌或所述待测样品不为马铃薯黑胫病菌。

本发明还提供了特异性引物对Ds4/Ds5或组合物Ds4/Ds5-Dsol在鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的产品中的应用。

本发明所述待测样品可为球茎类种球样品、种苗或细菌菌株。

本发明为了快速准确检测马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS)，根据GenBank中DS的flic(flagellin-coding)基因序列设计了特异引物对Ds4/Ds5和探针P-Dsol，建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。分别测试90株供试菌株，试验结果显示，引物对Ds4/Ds5能扩增供试的17株DS，得到491bp的预期目标条带，其它供试73株相关菌株和空白对照均不能扩增出预期产物，检测灵敏度为40pg菌体DNA。探针 P-Dsol对供试17株DS表现为阳性扩增，其它供试73株相关菌株和空白对照均为阴性扩增，检测灵敏度可达40fg菌丝DNA，比常规PCR高1000倍。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的方法具有快速、准确、特异、灵敏、方便、可靠的特点，在球茎类种球种苗样品的常规检测、分离株诊断和疫情监测方面具有潜在的应用价值。

2、本发明鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针，灵敏度高，可达40fg菌丝DNA，比常规PCR高1000倍。

3、本发明鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针，特异性高，有效避免了假阳性扩增现象。

附图说明

图1为D.solani及其近似种常规PCR扩增电泳图。D.solani为马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS)；M：Markers，从上至下的条带大小依次为2000bp，1000bp， 750bp，500bp，250bp，100bp；1：NCPPB4479(D.solani)；2：NCPPB3530(D.dian thoicola)；3：NCPPB2976(D.dieffenbachiae)；4：NCPPB4580(D.aquatica)；5：N CPPB1861(D.chrysanthemi pv.parthenii)；6：NCPPB898(D.dadantii)；7：NCPPB 3531(D.zeae)；8：NCPPB402(D.chrysanthemi)；9：XS05(D.fangzhongdai)；10： NCPPB2511(D.paradisiaca)；11：空白对照(无菌水)。

图2为D.solani及其近似种实时荧光PCR扩增结果图。1：NCPPB4479(D.solan i)；2：NCPPB3530(D.dianthoicola)；3：NCPPB2976(D.dieffenbachiae)；4：NCP PB4580(D.aquatica)；5：NCPPB1861(D.chrysanthemi pv.parthenii)；6：NCPPB8 98(D.dadantii)；7：NCPPB3531(D.zeae)；8：NCPPB402(D.chrysanthemi)；9：X S05(D.fangzhongdai)；10：NCPPB2511(D.paradisiaca)；11：空白对照(无菌水)。图2中1为NCPPB4479(D.solani)的扩增曲线。

图3为常规PCR检测灵敏度结果图。M为Markers；1-5分别为用引物对Ds4/Ds5 扩增NCPPB4479(D.solani)稀释度为40ng，4ng，400pg，40pg，4pg的DNA条带。DNA MarkerDL2000：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

图4为实时荧光PCR检测灵敏度结果图。图4中A-H分别为用引物对Ds4/Ds5扩增NCPPB4479(D.solani)不同稀释度的DNA：40ng，4ng，400pg，40pg，4pg，400f g，40fg，4fg的扩增曲线。

图5为用文献报道的探针DS-P对D.solani及其近似种进行实时荧光PCR扩增结果图。1:NCPPB4479(D.solani)；2：NCPPB2511(D.paradisiaca)；3：NCPPB3530(D.dianthoicola)；4：NCPPB2976(D.dadantii subsp.dieffenbachiae)；5：NCPPB89 8(D.dadantii)；6：NCPPB3531(D.zeae)；7：XS05(D.fangzhongdai)；8：NCPPB4 02(D.chrysanthemi)；9：NCPPB4580(D.aquatica)；10：NCPPB1861(D.chrysanth emi)；空白对照(无菌水)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面实施例中，涉及的试剂、仪器和培养基为：

1、主要仪器

超净台(ESCO)、离心机(Eppendorf)、恒温孵育仪(Eppendorf)、灭菌锅(HIRAYAMA)、恒温培养箱(Memmert)、天平(Sartorius)、纯水仪(millipore)、制冰机(Grant)、冰箱(Haier)、超低温冰箱(NBS)、漩涡震荡仪(IKEA)、PCR仪 (ABI veriti)、琼脂糖凝胶电泳仪(Continental Lab)、凝胶成像系统(Syngene)、实时荧光PCR仪(ABI7500fast)。

2、常用试剂

酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨、蔗糖、琼脂、溴化乙锭、琼脂糖、DNA提取试剂盒(天根)、PCR试剂(大连宝生生物公司)、DNA Marker DL2000(大连宝生生物公司)。

3、培养基

NA培养基：酵母粉1g、牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、蔗糖10g、琼脂17g、水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

实施例1供试菌株的选取及引物和探针的设计

1、供试菌株的选取

选取供试菌株共计90株，包括17株马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS，D.solani)，试验用D.solani菌株部分从国外菌种库购买，部分由本实验室从荷兰进境风信子种球样品中分离并鉴定。菌株除来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心 American typeculture collection)外，由宁波海关、福州海关、长沙海关、舟山海关、南京农业大学、浙江大学、云南农业大学和中国检验检疫科学院等单位提供。供试菌株编号和来源如表1所示。(所有供试菌株均可从上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，即申请人处获得，以重复本发明的实验用。)

表1供试菌株及PCR检测结果

表1的常规PCR列中，“+”表示阳性，即以该菌株的基因组DNA为模板，利用特异引物对Ds4/Ds5进行PCR扩增，PCR产物中含有491bp的DNA片段；“-”表示阴性，即以该菌株的基因组DNA为模板，利用特异引物对Ds4/Ds5进行PCR扩增，PCR 产物不含有491bp的DNA片段。Real-time PCR列中，“+”表示阳性，即以该菌株的基因组DNA为模板，利用特异引物对Ds4/Ds5和探针P-Dsol进行实时荧光定量P CR，实时荧光PCR的扩增曲线为S型曲线；“-”表示阴性，即以该菌株的基因组DNA 为模板，利用特异引物对Ds4/Ds5和探针P-Dsol进行实时荧光定量PCR，实时荧光 PCR的扩增曲线为非S型曲线。ATCC(American TypeCultureCollection)为美国典型培养物保藏中心，其网站为https://www.atcc.org/；NCPPB(The National Colle ction of Plant Pathogenic Bacteria)为英国植物病原细菌国家保藏中心，其网站为https://www.fera.co.uk/ncppb。

a:张慧丽，宁波海关；b:胡白石，南京农业大学；c：楼兵干，浙江大学；d：李敏，福州海关；e：赵文军，中国检验检疫科学院；f：朱金国，长沙海关；g：叶露飞，舟山海关；h：姬广海，云南农业大学。

2、引物和探针的设计

根据GenBank中D.solani的fliC(flagellin-coding)基因序列设计特异引物对Ds4/Ds5和探针P-Dsol，预期扩增产物491bp。引物和探针由上海基康公司合成。本发明的引物对Ds4/Ds5由引物Ds4和引物Ds5组成；所述引物Ds4为SEQ ID No.1 所示的单链DNA分子；所述引物Ds5为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。探针P-Dsol 的核苷酸序列为SEQ IDNo.3。探针P-Dsol为TaqMan-MGB探针，SEQ ID No.3所示的单链DNA分子的5’端连接有荧光报告基团FAM，SEQ ID No.3所示的单链DNA分子的3’端连接有非荧光淬灭基团MGB。

同时以文献报道的针对D.solani的fliC(flagellin-coding)基因的引物 ds-f/ds-r和探针ds-p(Van Vaerenbergh et al.，2012)作为对照。

所测试的引物和探针如表2所示。

表2试验引物和探针

注：a：正向引物，b：反向引物，c：探针；MGB(Minor Groove Binder)表示修饰基团，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

实施例2、引物和探针的特异性试验

1、细菌培养及DNA提取

表1中的90株供试菌株分别单独在营养琼脂(NA)平板上划线，28℃培养48h，无菌水洗脱，取菌液1mL，12 000r/min(13523g)离心5min，收集菌体，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，得到表1中的90株供试菌株的DNA，分别作为模板DNA。

2、引物的特异性试验-常规PCR鉴定马铃薯黑胫病菌

用引物对Ds4/Ds5扩增供试的90个菌株DNA。PCR试剂购于上海生工。PCR反应体系25μL，包括2.5μL 10×PCR buffer(Mg

反应程序为：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃60s，循环30次；最后72℃5min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。

引物对Ds4/Ds5分别对90株供试菌株DNA进行PCR扩增，供试17株D.solani 菌株均有特异性扩增，得到491bp的预期目标片段；其他供试73菌株和空白对照均无预期扩增产物(表1)，Dickeya属下的其他种均无491bp的预期目标片段(图 1)。试验结果表明引物对Ds4/Ds5可用于特异性扩增D.solani。说明引物对Ds4/Ds5 可以用于特异性鉴定马铃薯黑胫病菌。

3、探针的特异性试验-实时荧光PCR鉴定马铃薯黑胫病菌

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测供试的90个菌株DNA。PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。反应体系为25μL，包括12.5μL 2× Premix Ex Taq，上下游引物(5μmol/L)和探针(5μmol/L)各1μL，1μL 模板DNA，0.5μL 50×ROX Reference DyeⅡ，加无菌水补至25μL。其中，上下游引物为引物Ds4和引物Ds5，探针为P-Dsol。

反应程序为：95℃预变性10s；然后以95℃15s，60℃1min进行40个循环。

同时以文献报道的针对D.solani的fliC(flagellin-coding)基因的引物 ds-f/ds-r和探针ds-p(Van Vaerenbergh et al.，2012)作为对照。

该实时荧光PCR将基线作为阈值(threshold)。Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn＝Rn-基线)，代表PCR扩增产物的量。Ct(cycle threshold，指反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)。其扩增曲线如图2所示。

90株供试菌株DNA经实时荧光PCR检测，探针P-Dsol对供试的17个D.solani 菌株DNA都有荧光信号的增加，实时荧光PCR的扩增曲线均为S型曲线，实时荧光 PCR扩增曲线的Ct均小于25，表现为阳性扩增，而其他供试73个菌株和空白对照都没有检测到荧光信号的增加，实时荧光PCR的扩增曲线为非S型曲线，表现为阴性(表1)，Dickeya属下的其他种均为阴性(图2)。该试验结果与步骤2的常规 PCR一致(表1)，表明探针P-Dsol可特异性检测D.solani。

实施例3、引物和探针的灵敏度试验

1、常规PCR和实时荧光PCR反应测试引物和探针的灵敏度

取D.solani菌株NCPPB4479的模板DNA系列稀释为40ng/μL、4ng/μL、400 pg/μL、40pg/μL、4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL和4fg/μL，分别取1 μL DNA作为常规PCR和实时荧光PCR的反应模板进行PCR扩增，反应体系和程序同实施例2中的步骤2和步骤3。

2、结果与分析

引物对Ds4/Ds5扩增NCPPB4479不同系列稀释度DNA，40ng、4ng、400pg和40pg 的DNA均可扩增得到491bp的预期条带，4pg的DNA未出现预期条带(图3)。结果表明引物对Ds4/Ds5的检测灵敏度为40pg菌体DNA。

实时荧光PCR检测NCPPB4479不同稀释度的DNA，试验结果表明，40ng、4ng、 400pg、40pg、4pg、400fg和40fg的DNA都能检测到荧光信号增加，表现为阳性扩增，4fg的菌体DNA扩增信号不明显(图4)，探针P-Dsol对菌体DNA的检测灵敏度为40fg。实时荧光PCR对菌体DNA的检测灵敏度比常规PCR高1000倍。

对比例、文献报道探针DS-P的测试

利用表2中的文献报道引物ds-f/ds-r和探针ds-p(Van Vaerenbergh et al.，2012)测试D.solani及其近似种菌株DNA，测试材料包括8个种10个菌株： NCPPB4479、NCPPB2511、NCPPB3530、NCPPB898、NCPPB2976、NCPPB3531、XS05、 NCPPB402、NCPPB1861和NCPPB4580。测试程序同实施例2中的步骤3，反应体系中，上下游引物为引物ds-f，ds-r，探针为ds-p。

引物ds-f、ds-r和探针ds-p测试D.solani及其近似种菌株DNA，测试结果显示，测试材料(NCPPB4479、NCPPB2511、NCPPB3530、NCPPB898、NCPPB2976、NCPPB3531、 XS05、NCPPB402、NCPPB1861和NCPPB4580)中除NCPPB4479(D.solani)以外，其中5个种6个菌株均出现阳性扩增(如图5和表3所示)，NCPPB3530、NCPPB898、 NCPPB2976、NCPPB3531、XS05、NCPPB2511的Ct值分别为14.8、20.6、28、23.9、 28.1、34和18。特别是NCPPB2511(D.paradisiaca)和NCPPB3530(D.dianthoicola) 的Ct值和阳性NCPPB4479(D.solani)Ct值(14.8)接近，说明该探针对近似种有假阳性扩增现象。

表3实时荧光PCR(引物ds-f，ds-r，探针为ds-p)对D.solani及其近似种的扩增结果

-：≧40

上述实施例表明，马铃薯黑胫病菌D.solani特异性引物对Ds4/Ds5可特异性扩增所有供试D.solani菌株得到491bp的预期扩增产物，而供试其他菌株均没有预期扩增条带。引物对Ds4/Ds5的检测灵敏度为40pg菌体DNA。

引物对Ds4/Ds5和探针P-Dsol组成的实时荧光PCR检测方法可以特异性检测供试的17个D.solani菌株，产生明显的扩增荧光信号，而所有供试的其他菌株均未发现明显增加的荧光信号。该方法检测灵敏度可达到40fg菌体DNA，比常规PCR 高1000倍。

而文献报道的引物ds-f/ds-r和探针DS-P测试D.solani及其近似种，D.dianthoicola、D.dadantii、D.dadantii subsp.dieffenbachiae、D.zeae、D.fangzhongdai和D.paradisiaca菌株出现不同程度的假阳性扩增，仅 D.chrysanthemi和D.aquatica表现为阴性扩增。说明引物ds-f/ds-r和探针DS-P 的特异性不足，针对Dickeya属部分种类存在假阳性扩增现象。序列分析发现，其引物探针序列和近似种相关序列之间的序列相似性非常高，测试结果与序列分析结果相符。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

aatgctaacg acggcgta 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atggtgttgc ccaggttctg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cttcagcggt atttaccag 19