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一种基于染色体特异探针的鼠疫耶尔森菌鉴定方法

文献发布时间:2023-06-19 11:30:53



技术领域

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种基于染色体特异探针的鼠疫耶尔森菌鉴定方法。

背景技术

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的人兽共患传染病。鼠疫菌属于甲类传染病致病菌,人通过接触感染的动物,食入污染的食物或被鼠蚤类动物叮咬等途径而感染,引起腺鼠疫和致命的肺鼠疫和败血症鼠疫。我国地缘辽阔,现有12块已知的鼠疫自然疫源地,每年基本都会有鼠疫疫情出现,造成社会恐慌,影响我们的正常生产生活。面对频繁出现并且涉及区域广泛的鼠疫疫情,选择快速、准确的鼠疫菌鉴定方法是至关重要的。

传统的鉴定方法为培养鉴定法,病原体经过培养后利用生化指标进行鉴定,如糖醇酵解试验及亚硝酸盐生成试验、色素沉着试验等,但耗时耗力。随着分子生物学的飞速发展,聚合酶链式反应技术(PCR)是鼠疫菌检测的常规技术方法。然而,鼠疫菌是由假结核耶尔森菌进化而来,两者DNA同源性很高。鼠疫菌携带有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,而pCD1质粒为鼠疫菌和假结核菌所共有,pMT1和pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中由外源性获得的,与鼠疫菌的致病性密切相关。这些因素给鼠疫菌分子鉴定带来很大的障碍。早先用来鉴定的靶标都是使用特有质粒上的序列,在遇到非典型菌株(如质粒丢失的菌株)不能够有效进行鉴别。还有一些染色体上的引物用来区分这两种菌,但采用的菌株数目太少,引物特异性有限。

随着分离的菌株越来越多和测序技术的迅速发展,耶尔森菌属细菌基因组文库变得更加繁杂。NCBI中的鼠疫菌基因组数据库包含了一些非鼠疫菌基因组数据,该数据来自简单的序列比对,混入了鼠疫菌基因组数据库中,误导相关人员进行后续分析。建立一个简单明确、快速高效的鉴定鼠疫菌的方法是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于染色体特异探针的鼠疫耶尔森菌鉴定方法。

第一方面,本发明要求保护用于鉴定或者辅助鉴定鼠疫耶尔森菌的探针组。

本发明要求保护的用于鉴定或者辅助鉴定鼠疫耶尔森菌的探针组,由如下组成:

探针1:SEQ ID No.1所示单链DNA;

探针2:SEQ ID No.2所示单链DNA;

探针3:SEQ ID No.3所示单链DNA;

探针4:SEQ ID No.4所示单链DNA;

探针5:SEQ ID No.5所示单链DNA;

探针6:SEQ ID No.6所示单链DNA;

探针7:SEQ ID No.7所示单链DNA;

探针8:SEQ ID No.8所示单链DNA;

探针9:SEQ ID No.9所示单链DNA;

探针10:SEQ ID No.10所示单链DNA;

探针11:SEQ ID No.11所示单链DNA;

探针12:SEQ ID No.12所示单链DNA;

探针13:SEQ ID No.13所示单链DNA;

探针14:SEQ ID No.14所示单链DNA;

探针15:SEQ ID No.15所示单链DNA;

探针16:SEQ ID No.16所示单链DNA;

探针17:SEQ ID No.17所示单链DNA;

探针18:SEQ ID No.18所示单链DNA;

探针19:SEQ ID No.19所示单链DNA;

探针20:SEQ ID No.20所示单链DNA;

探针21:SEQ ID No.21所示单链DNA;

探针22:SEQ ID No.22所示单链DNA;

探针23:SEQ ID No.23所示单链DNA;

探针24:SEQ ID No.24所示单链DNA;

探针25:SEQ ID No.25所示单链DNA;

探针26:SEQ ID No.26所示单链DNA;

探针27:SEQ ID No.27所示单链DNA;

探针28:SEQ ID No.28所示单链DNA;

探针29:SEQ ID No.29所示单链DNA;

探针30:SEQ ID No.30所示单链DNA;

探针31:SEQ ID No.31所示单链DNA;

探针32:SEQ ID No.32所示单链DNA;

探针33:SEQ ID No.33所示单链DNA;

探针34:SEQ ID No.34所示单链DNA;

探针35:SEQ ID No.35所示单链DNA;

探针36:SEQ ID No.36所示单链DNA;

探针37:SEQ ID No.37所示单链DNA;

探针38:SEQ ID No.38所示单链DNA;

探针39:SEQ ID No.39所示单链DNA;

探针40:SEQ ID No.40所示单链DNA;

探针41:SEQ ID No.41所示单链DNA;

探针42:SEQ ID No.42所示单链DNA;

探针43:SEQ ID No.43所示单链DNA;

探针44:SEQ ID No.44所示单链DNA;

探针45:SEQ ID No.45所示单链DNA;

探针46:SEQ ID No.46所示单链DNA;

探针47:SEQ ID No.47所示单链DNA;

探针48:SEQ ID No.48所示单链DNA;

探针49:SEQ ID No.49所示单链DNA;

探针50:SEQ ID No.50所示单链DNA;

探针51:SEQ ID No.51所示单链DNA;

探针52:SEQ ID No.52所示单链DNA;

探针53:SEQ ID No.53所示单链DNA;

探针54:SEQ ID No.54所示单链DNA;

探针55:SEQ ID No.55所示单链DNA;

探针56:SEQ ID No.56所示单链DNA;

探针57:SEQ ID No.57所示单链DNA;

探针58:SEQ ID No.58所示单链DNA;

探针59:SEQ ID No.59所示单链DNA;

探针60:SEQ ID No.60所示单链DNA;

探针61:SEQ ID No.61所示单链DNA;

探针62:SEQ ID No.62所示单链DNA;

探针63:SEQ ID No.63所示单链DNA;

探针64:SEQ ID No.64所示单链DNA;

探针65:SEQ ID No.65所示单链DNA;

探针66:SEQ ID No.66所示单链DNA;

探针67:SEQ ID No.67所示单链DNA;

探针68:SEQ ID No.68所示单链DNA;

探针69:SEQ ID No.69所示单链DNA;

探针70:SEQ ID No.70所示单链DNA;

探针71:SEQ ID No71所示单链DNA;

探针72:SEQ ID No.72所示单链DNA;

探针73:SEQ ID No.73所示单链DNA;

探针74:SEQ ID No.74所示单链DNA;

探针75:SEQ ID No.75所示单链DNA;

探针76:SEQ ID No.76所示单链DNA;

探针77:SEQ ID No.77所示单链DNA;

探针78:SEQ ID No.78所示单链DNA;

探针79:SEQ ID No.79所示单链DNA;

探针80:SEQ ID No.80所示单链DNA;

探针81:SEQ ID No.81所示单链DNA;

探针82:SEQ ID No.82所示单链DNA;

探针83:SEQ ID No.83所示单链DNA;

探针84:SEQ ID No.84所示单链DNA;

探针85:SEQ ID No.85所示单链DNA;

探针86:SEQ ID No.86所示单链DNA;

探针87:SEQ ID No.87所示单链DNA;

探针88:SEQ ID No.88所示单链DNA;

探针89:SEQ ID No.89所示单链DNA;

探针90:SEQ ID No.90所示单链DNA;

探针91:SEQ ID No.91所示单链DNA;

探针92:SEQ ID No.92所示单链DNA;

探针93:SEQ ID No.93所示单链DNA;

探针94:SEQ ID No.94所示单链DNA;

探针95:SEQ ID No.95所示单链DNA;

探针96:SEQ ID No.96所示单链DNA;

探针97:SEQ ID No.97所示单链DNA。

第二方面,本发明要求保护用于鉴定或者辅助鉴定鼠疫耶尔森菌的探针。

本发明要求保护的用于鉴定或者辅助鉴定鼠疫耶尔森菌的探针,可为前文第一方面中的所述探针1至所述探针97中的任意一个。

第三方面,本发明要求保护含有前文第一方面所述探针组或前文第二方面所述探针的试剂盒。

第四方面,本发明要求保护前文第一方面所述探针组或前文第二方面所述探针或前文第三方面所述试剂盒在如下任一中的应用:

P1、鉴定或辅助鉴定鼠疫耶尔森菌;

P2、制备用于鉴定或辅助鉴定鼠疫耶尔森菌的产品;

P3、检测或者辅助检测待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌;

P4、制备用于检测或者辅助检测待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌的产品;

P5、检测或者辅助检测目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌;

P6、制备用于检测或者辅助检测目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌的产品。

第五方面,本发明要求保护一种检测或者辅助检测待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌的方法。

本发明要求保护的检测或者辅助检测待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌的方法,可为方法A或方法B。

所述方法A可包括如下步骤:

(A1)对待测菌株进行全基因组测序;

(A2)用生物信息学软件将测序结果与前文第一方面所述探针组中的每个探针进行序列比对;

(A3)根据(A2)序列比对结果按照如下确定所述待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌:如果测序结果中存在所述探针组中的任何一条探针序列,则所述待测菌株为或候选为鼠疫耶尔森菌;如果测序结果中不存在所述探针组中的任何一条探针序列,则所述待测菌株不为或候选不为鼠疫耶尔森菌。

所述方法B可包括如下步骤:

(B1)采用前文第一方面所述探针组中每个探针分别与所述待测菌株的基因组进行杂交;

(B2)根据(B1)所得结果按照如下确定所述待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌:若所述探针组中任何一条探针与所述待测菌株的基因组杂交后有阳性信号,则所述待测菌株为或候选为鼠疫耶尔森菌;若所述探针组中任何一条探针与所述待测菌株的基因组杂交后都没有产生阳性信号,则所述待测菌株不为鼠疫耶尔森菌。

在该方法中,检测出的探针越多,则结果越可靠,多条电子探针能够避免由于测序质量较差,或人工修饰细菌导致错误鉴定。

所述方法可为非疾病诊断治疗方法,如用于单纯的检测待测菌株是否为鼠疫耶尔森菌,而不涉及任何疾病诊断目的。

第六方面,本发明要求保护一种检测或者辅助检测目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌的方法。

本发明要求保护的检测或者辅助检测目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌的方法,可为方法C或方法D。

所述方法C可包括如下步骤:

(C1)对目标个体的供试样本进行细菌全基因组提取,然后进行测序;

(C2)用生物信息学软件将测序结果与前文第一方面所述探针组中的每个探针进行序列比对;

(C3)根据(C2)序列比对结果按照如下确定所述目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌:如果测序结果中存在所述探针组中的任何一条探针序列,则所述目标个体携带或候选携带鼠疫耶尔森菌;如果测序结果中不存在所述探针组中的任何一条探针序列,则所述目标个体不携带或候选不携带鼠疫耶尔森菌。

所述方法D可包括如下步骤:

(D1)对目标个体的供试样本进行细菌全基因组提取,然后采用前文第一方面所述探针组中每个探针分别与提取的基因组进行杂交;

(D2)根据(D1)所得结果按照如下确定所述目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌:若所述探针组中任何一条探针与步骤(D1)提取的基因组杂交后有阳性信号,则所述目标个体携带或候选携带鼠疫耶尔森菌;若所述探针组中任何一条探针与步骤(D1)提取的基因组杂交后都没有产生阳性信号,则所述目标个体不携带或候选不携带鼠疫耶尔森菌。

在该方法中,检测出的探针越多,则结果越可靠,多条电子探针能够避免由于测序质量较差,或人工修饰细菌导致错误鉴定。

所述方法可为非疾病诊断治疗方法,如用于单纯的检测目标个体是否携带鼠疫耶尔森菌(如用于海关检验检疫),而不涉及任何疾病诊断目的。

在上述各方面中,所述待测菌株可为任意菌株,包括但不限于耶尔森属菌株,如芽胞杆菌属菌株。

进一步地,所述待测菌株可为鼠疫耶尔森菌或假结核耶尔森氏菌。

本发明经过对NCBI数据库中鼠疫菌和和非鼠疫耶尔森菌的全基因组序列深入的研究,借助本地blast,编写python程序,进行大量的筛选比对,确定了鼠疫菌基因组序列中保守的DNA区域。筛选出特异探针序列,这些探针涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂,可用于对未知样品的测序结果(包括二代或三代)进行检测,由于本发明采用多达97条特异探针,只要有任何一条探针检测出来,就可以判定为阳性,检测出来的探针越多,可信度越高,从而保证了即使测序质量差及覆盖度不高的基因组序列,也可以用这些电子探针进行查询,快速简便高效地鉴定出该样品是否携带有鼠疫菌。

附图说明

图1为本发明特异性标签获取思路。

图2为鼠疫菌与假结核耶尔森氏菌全基因组的聚类树。

图3为SEQ ID No.1探针在NCBI库中Blast测试结果。

图4为SEQ ID No.1在单个菌株中Blast具体结果示例。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1、基于染色体特异探针的鼠疫耶尔森菌鉴定方法的建立

本发明所描述的鼠疫耶尔森菌DNA序列是标准株Yersinia pestisCO92染色体序列(GenBank:NC_003143,13-DEC-2020),所述的核酸序列位置也是以Yersinia pestisCO92染色体(GenBank:NC_003143,13-DEC-2020)为标准计算的。

1、从NCBI基因组数据库下载鼠疫耶尔森菌(共539株,表1)基因组和耶尔森属中非鼠疫耶尔森菌(包括20个种共572株菌,表1)基因组(为了方便叙述,在下文中分别简称为:鼠疫菌和非鼠疫菌)。

2、编写python脚本,截取Yersinia pestisCO92染色体序列(GenBank:NC_003143,13-DEC-2020)片段(步长1bp;长度100bp),共截取4829756个100bp长的片段,如图1所示。

3、通过本地blast(blast-2.7.1+),去除出现在非鼠疫菌中的4191017个标签,剩余638739个标签。

4、编写Python脚本,查询这638739个标签中在所有鼠疫菌(Yersinia pestis共539株菌)中都出现的标签,在此过程中发现有一株菌的基因组(Assembly ID:GCA_902387395.1,UHGG_MGYG-HGUT-02476)中只检测到这638739个标签中的1341个(0.21%)标签,而其它538株鼠疫菌的标签检出率在62.36%-100%之间,后经全基因组聚类树分析发现该菌株不是鼠疫菌(图2),而是与鼠疫菌近源的假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis),故将其从基因组训练集剔除。结果本发明获得了35680个在所有鼠疫菌(538株)中都出现的标签。

5、根据片段之间的重叠合并这35680标签,得到833条特异片段,这些片段长度介于100bp~411bp之间。

6、用这833个DNA片段,进行本地Blast查询非鼠疫菌(572株菌),并根据blast结果截取每一株菌对应的DNA序列,并做成fasta格式。

7、运用megaX软件对步骤6获得的文件进行比对,寻找能够区分鼠疫菌与其它所有近源耶尔森氏菌的SNP位点,结果发现共有483个片段含有SNP位点。

8、为了方便应用及提高检测的特异性,我们从这483个片段中选取含有至少2个(包含2个)以上SNP位点的序列,并截取含这些SNP位点的100-150bp长度的序列作为电子探针(表2),共发现97条探针可用于鼠疫菌的快速鉴定。

9、为了测试这97条电子探针在更大的数据库中的特异性,将这97个电子探针进行在线blast查询(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),以SEQ ID No.1为例测试结果如图3,结果显示这些电子探针均只能在Yersinia pestis中达到Query Cover和Per.Ident(Percentage of Identity)值均100%,具体展示如图4中A,序列完全一致,在其它菌株中均不能查到,如图4中B和C显示,不能满足Query Cover和Per.Ident值均100%,序列不完全一致。

表1、使用的耶尔森属菌种及数目

注:*表示这株菌是鉴定错误的鼠疫菌,实际为假结核耶尔森氏菌。

表2、特异电子探针序列

注:表中开始和结束位置是以Yersinia pestisCO92染色体(GenBank:NC_003143,13-DEC-2020)为标准计算的。表格中中括号[]中的碱基表示SNP,第一个碱基指的是鼠疫菌基因组中的核苷酸,第二碱基指的是其它耶尔森菌基因组中的核苷酸。探针序列对应的是在鼠疫菌基因组中的序列,因此各探针序列的中括号[]中的碱基取第一个碱基。

11、利用本发明的97条鼠疫菌特异性探针和方法,可以简单快速鉴定待测菌株是否为鼠疫菌,以及目标个体是否携带有鼠疫菌。

步骤:

(1)收集待测菌株或来自目标个体的样本,提取其基因组,细菌全基因组提取按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒步骤进行;

(2)基因组样本使用测序仪进行测序(二代或三代皆可);

(3)用生物信息学软件将测序结果与探针序列进行比对和分析;

如果测序结果与其中任何一条探针100%吻合(即序列完全一致)(既可以采用blast方法,也可以编写python脚本实现),则检测结果为阳性,该样本携带有鼠疫菌,检测出的探针越多,则结果越可靠,多条电子探针能够避免由于测序质量较差,或人工修饰细菌导致错误鉴定,如果所有的探针都未检测(即序列不完全一致)到就是阴性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于染色体特异探针的鼠疫耶尔森菌鉴定方法

<130> GNCLN210502

<160> 97

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ttgttctgga ttatcggtaa cgttctcact gtttcaacaa tgaattcaat ggattgtctg 60

atgatgatca gcattaaaag gaagtaagct gatgactatt 100

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<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acgatgcggt agctgctgga aaccatggtg ccgagtagca acatcagcat catgaatagc 60

aggttgctgg cattctgaat tatcagcata gctgtcttat 100

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tagctgcttt tattctggtt gccagccagc gaggggagga aagcccaatg accaagcaag 60

tgacatttat ctgcgggctt cttaatggcg ttcatgcccg 100

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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cctgcgagcc atatagaaag ggtatgcaac cgcttccaat cgcgtttcca ctggtataat 60

ccgcgttctg gcatcgtggg agatggcaag agcgtacttt 100

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

aatcaaggtg ccgaatccat tggcttgttt cgtactgaaa tattgtatat ggatcgtgca 60

gccgcgcctt cagaagagga gctttatacc ctctacgctc aggcacttgg cgctgccaag 120

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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tttttccaaa ctggcgcgtc ggatcatgca cgaggggttc cgcgatgcgc tggttagcgc 60

tgggacggcc cagcaagtag aaatgctgct gaaacacgag 100

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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ttttggttaa aacataatgg cagtggattg agtgcggaac aggtaaaagt gcttaatcgc 60

ctattagatg gcggtgagaa tggcttttct gctgggataa atgcgtcaca atatcagaaa 120

gtcgcaaagg tcagtaaagc aaccgccacg 150

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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tttctcggcc catggtgtgt cacaggccgt tcgggcagag gcccgttcac gtaatttgac 60

gatgctgttt gatgcaacct gtccattggt taccaaagtc 100

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aaaatgcggc tttgagtgag atgggatgct gtgcagtatt atcaatacta aacttacttt 60

ctccccgtga cagcagtgct tgaataccaa tccagatcag gtagcaggcc ccggcatatt 120

tcagcaaatt gaataaccat ggtgtggtcg 150

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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gatctttctg gccacagagc aaagcctctt cctgctgttg aagatcgtaa attccttact 60

ttcgatcagg ataatttcga tgcccggatg agagcaatta 100

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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gccgatattg cggtgtactt gttcctcaac aatatcgata agttacctgg cggcgaaacc 60

ttcctctcgt taatgaacga cgaacttctg gccggagggc ttgggattag catgacccat 120

aatgaaaagg ggcagaacaa tttcgttgcc 150

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gaaatttgag ttccagagga aaatttccgg tgttggaagc ggtacgcaaa acataatcaa 60

tggatacaga aatacaggga ggtctgcgat acgactcgca 100

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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attcacttgc cgtatgactg caacctcgat ggcttttggt atttataagc attctacttc 60

ccaccccgaa tcagcccacc taaaccacgg cgctccataa 100

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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gggggcggcc tcttgcccta accgacgacc aaaccagatc tcagcggtta aatcccggat 60

ccggttaaac agcacgctgt ggttatgagt ctcatcgctt ttaaccagaa tcaacaccgc 120

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gcccgtcagt tagtgcagca agccgcttcc ggggcttgtg ctctggtcga ggctaaccca 60

cacgtgccac tttcggcctt gcgagagcag gtcacgtcca 100

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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ttcaagactc gatgcgccta aacgagcact ggctattact cggtggcctg cgctacgaca 120

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tggtgcccga gcacagtttg ctgcggtgcc attgaacttg cttggtgacc gcaacagcgc 60

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caggcttcta tcgcaatcag gttgctatta ctaaccgctc 100

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<212> DNA

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gtcattcaag gtattcgggt agttacgggc gcggaagcgg aataacaggg cctccaaccg 60

tgggtcctga aatgtcaaat ccagtgctgg cagattttgt gactcagttt gctggataat 120

ctttatggtg gcgcgatcag catcactgaa 150

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aaatctgtgg ttgccgttgt aacagcccaa tcaaatacac 100

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tagttgtagt gatatcacta ttatctatca attatacgag gctattgagg ttcgattggt 60

tttgttaaag gtttgtatat gatatgtgtt gtgtattaac 100

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

tggctcttta attgcgtctg gatagaacgc aatgtgccat ccccgactaa tgcaccatta 60

ctcgtggatt gatcctggcc tgtctctaca acggtatatt 100

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ttttggccgg gttgagtaat cgtgatcgtg cgtgttgcat cactgctacc caatttatct 60

gtagcgctag gcacatctgc cgataacagc gattgtgctt 100

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

aatataaagg tgaagtggat gctactaatg gaaaagtaac atttgcagat gatgctaatg 60

gcgatccaat tgatgacgct accaagctgg aagcagcggc 100

<210> 25

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

acgaaaggcg atcgctctat gtacccattc gcaacagcga actccatcat cgcggcaaaa 60

caagaaaggt agacgtttac cgttctgaca gaccgacctt 100

<210> 26

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

caaaggagta acggtcaact ttggttaaat ctgcaacata gcggctaccg ggttcgcaaa 60

tacgcgctag atcgttacga gccagatcca ccaacattaa atgttctgcc atctctttat 120

ggtcagtacg catttccaac tcgatacggc 150

<210> 27

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

aagaataccc gcaagattct gcgtagcggt gaagttgcac caccgaaaga agatccggta 60

ccattgttag agttgccttg cgagaaatca gatgcttatt tcgtcctacg agatggcgca 120

gctggcgtgt tcttggcagc caatacattc 150

<210> 28

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

agatcaacgg catcagtccc gacaccaaat attgagatga tctgcacttc aggcaataac 60

gccaggacct cattagtgac gccaatatca cctctagtca 100

<210> 29

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

ttatcattac cgaagctgaa ttgtttcagc tacagaatag gcgttaacaa tctctgtcgc 60

accttagggg ggaatgttat tggttgatac gcattgttat acgttggcgt cacctgttaa 120

caggcgataa ttgatgagcc gatgctctac 150

<210> 30

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

ggcttcgcta tccgccgccg gtgcgtacat aaacaagcgc atcactacgg caaagatagc 60

aatcttgctg gcggtcgcca ggaacgtgga aactggcgcg ggtgcgccct gatacacatc 120

gggtgtccac aattggaacg gtaccaacga 150

<210> 31

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

cctattcctg aaaggattcg gttgggcacc gttcttaaaa taccaaatag tgaaccgacg 60

aagaaggcga tcacccaagc acataatgat aatgcgaccg 100

<210> 32

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

cccccttgat gaacctcatg gctctggtct gcacattcac ggtattcact cccacgaaga 60

aggccatagt catggtgatc acgatcatga ccacagccat 100

<210> 33

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

tcgggaccag tcgctggctg acagcacggc aacgccagag tgaaccaatc aataaaccca 60

cctgcaattt tcatcatttt cattaccacc attggtgaaa 100

<210> 34

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

ccccctcaat gggcgtgatc caacttaagc caaatctgaa ggaaggagat ttgactcaag 60

ggtattgtgt tcccaggggc agctcgttct tcacccatat cgcacctggc gagacaaccc 120

gctgcgagtt ccgcagtggt caggatgtgg 150

<210> 35

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

ggctccttat ggcgatagct tgcgctacct ctctattgaa gctcaggtga ctaatcggga 60

tcttccgcgc ctgatttccg ccagtggtaa ttttgaattg accatgtcgg attcagcgcc 120

cgttcacggt gcccggtttg tcttccaacc 150

<210> 36

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

ccccatcccc acagttgcag ccgttacagt tgcaatcggc acagttgcaa cctgtaccga 60

tacagtcaca gccggtgcct gtccagcagc aagggatcca 100

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

cgtatcctgc aacttcacac ttcagattcg aactctataa aattaaagat acgttgaatt 60

taactgatac caacggcgaa cgtgttctgc cgggtggcac aatagcttat acctgggcga 120

<210> 38

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

ccgataataa ttacatcaag gtaaaagaca gccagaacca agaagaccgg ttgcttatca 60

aaatcagcga caccaacggt caacagatga aagtgaatgg 100

<210> 39

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

cccccaagtg tcgactccca ttccgcagga gacagcggaa cctgtagaac aggagagtac 60

ggttatttta attctcggtc cctatgctga gaaatggttt 100

<210> 40

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

ccccctcccc tgcgtatttg ctatttacgc gcagttgagt aatgaacgcc ttagccataa 60

ttctgataac gcatattgga ctggaaatat taatcttgcg aaccagcagc ctatcgagat 120

tacgcaagcc ctacagtcac tgagccaacg 150

<210> 41

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

tgagccaacg acttgagtta caagacatca atcactcaag atttgcaact cagcgtaatg 60

ttatggcgca taatttattt acttggttga atgaatcggg 100

<210> 42

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

atctctggcg cgggagtatt ggcttccagc aaacatccgc agcaagccca gaaattcgtg 60

caatgggtca ccggcaaagc ggggcaggat ttcttgcgcg agagcaatag cgcctttgaa 120

tatgcggttg gcgtgaatgc cgcttccaat 150

<210> 43

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

ttgattacct ttgaataccc ttggcccttg acgttgcaac ggtgttcacc gctctcatga 60

acccgaatga ctgacgcctg tcagctcatc ggggtttgcg cgttagcggc cttgctgcaa 120

caacaatgac ttgggtcggt 140

<210> 44

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

tagtccgcca gcaatttcag gtttaggtgg gtcgtcaggt ttcgatatgg aattacagga 60

ccatggcggc catggccatg ataaattgat ggtcgcccgc aaccaattgt tgcagatggc 120

gtcgcaggaa cccgcgttaa cccgagtgcg 150

<210> 45

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

gcacaagcgt gccaatcaga gaagaataga tcttatgatt atcgattaac ggctcagcta 60

aacctagtga ctagcaaacg tgttacagct attaggatca 100

<210> 46

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

aaagcagtta ctcgatagct tgggtttggc aactgcgccg tggcaattgt tatccagcgc 60

cagtgaatgg cctgaggtgt tcgccacgtt gggtgagcta 100

<210> 47

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 47

accaacctgt ttcaacatcg caccgatgtc taacaaactc agtgttggga actggcgatt 60

taactgaacc aaagcctctc catcaccgtg atagcggaag 100

<210> 48

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 48

ccccaccagc aacgaaatca atactaatga tcccattgac cacacccatg gccatagccc 60

ggcagtgggt aactctgcgg gcaataccgg cgctaataac caaaccaata gcctctcaaa 120

taagagacca atgacactgc cgcagaggcc 150

<210> 49

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 49

tttccaaata attatgtagg tgacaattgt atacctgcat aattaattag caatcaacca 60

gactcgctcc acacattaca tacattacca atcaaccccc 100

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 50

accagtgacg gggtttgcgt tccatcaagt acatgatggg cgacgtcctg atacaacgct 60

tcacgactag ccaacacatc cagtatttct tcaacgatgg 100

<210> 51

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 51

ttaaggaagt tatttcgctc gaatcgcaat gggtgcgagc acccatttcc ggcttcatta 60

aggttagtga tcacatgatc ggcatggcca aaagtcgatg 100

<210> 52

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 52

gcaatgaaaa cacaactggt gcctctacca cgggtgttaa ttcaactgac ttatccgcca 60

ttacccgatc tccctatcag ctcagggctt accctctatt 100

<210> 53

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 53

tttacccacg tcgatgccgg tgccatggac cgtgtcgcca tgcaccacgc tgccatggtt 60

accggacaga ttggccgcca gatccacgcc cttgccctcg gtactgttgc cattgagcgt 120

agcgttatcc agcgtgctct cgccatcgat 150

<210> 54

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 54

agtgcctgtt gtcgccacac cttgtagaat caacaagtca gcttcactgg tcccggtaac 60

gtttgaattt tcgccaatat caataccgta gcccgtgcca gtagtcgttc cgttaatcga 120

<210> 55

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 55

gctgggtatc ccaaatgacg cccttccatc gccgctgcta cggtacccga atagataaca 60

tcatccccta aattagggcc agcattaata ccagagacaa 100

<210> 56

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 56

gcactaccaa gccaatcaca agtagaagcc gagcaactta aacaaatcgg cgccaaagat 60

tgtctgctga aacccatatc gtctatcagg cttatccctt tactcttggc cgaagacacg 120

cacagtaaag taccatcaga ggagcaacca 150

<210> 57

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 57

taacgccaac ttgccaccct ttagcgccaa cttactgtca gtgaactcag attcgcggtc 60

aattagccct aattcgccac cgactcacgc caaatcgctg 100

<210> 58

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 58

attttgatgg ccgcctggtt gggtaaagct cgtctgattg ataaccaact ggttgatttg 60

cgccactgat attttaccga tcaggcggtt gctcattccc ctcaagccgc gagttggccc 120

aaaatcaacc aggaacgcca aggtaaaagt 150

<210> 59

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 59

ggggaagcca gattgggcat aaagaatcaa tcaaggatac cgcccgtgta ttaggccgta 60

tgtatgacgg cattcaatat cgtggctatg ggcaacgcgt 100

<210> 60

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 60

aacactcgca gaatttgccg gcgtaccggt ctggaatggc ctgaccgatg agtttcatcc 60

aacccaactc ctggctgatt tgctgactat gcgggaacac ctgcccaata aatcgctgaa 120

taaaatgacg ttggcgtacc tcggtgatac 150

<210> 61

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 61

agcggccgca ctggtaggaa tggatttacg cctagtcgca ccgaaagcct gttggccaga 60

ggaagccttc gttatcagtt gccaggcact ggcacagaaa 100

<210> 62

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 62

aaaagggtca ggtcatcccg caagccgaca acaattggcg tctggcaatt cttgatagca 60

agcaaccttt ggatattcgt tttgaaacct ctccaactgc 100

<210> 63

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 63

gcttcgccgt ttatcacatc gatttacaga gaaagtaatc tctggcggca acgccttaca 60

ctgtacgctg ctgtcacccc ataataccca cttggagtta tatcacaatc tataacatgc 120

atttattatg 130

<210> 64

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 64

catcacagcg cctaacttgt ggtgatgggg cctttgtgga agaagaacaa cacctagtaa 60

ttaaagcgat aaccccactg cgcgccctct tgattgattt 100

<210> 65

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 65

tcgagccaaa cttcataacc ttgttgttga taactgctca gcaaatccag aacggcatcg 60

ggcacacaat ccgggcgagt ccccacgcac aggcccacaa 100

<210> 66

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 66

ttttgatgca gtattgaccc gtgaacgcat gggtagcacc gggattggca gtggtatcgc 60

aatacctcat ggcaagttgg aagaggatac actgcgcgcg 100

<210> 67

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 67

tatgatatcc ctttccgcat tacgtaaatc aggagtcaag atgttacgtg ctatcaaaac 60

taaactcgcc cctgctgcca ttggccctta tgttcaaggt gtcgatctgg gcagcatgat 120

catgacttcc ggtcagatcc cgatcgatcc 150

<210> 68

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 68

ttcctttgcc agccaggagt acggggaaat acgggcttta tcgcggcgtg gataattgat 60

tgtcacactg tgtagtgggt gaccatattc attgcaacgc agcacaatct gctggctgca 120

ttgcgggtct tgcgcgatac gttcgtagtg 150

<210> 69

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 69

ttttcatcca accagaattg gacagaactg cggtaaagca actgactctc tgcgcccata 60

ttattgttgg tggtgcacag taaatagggt ttactggcga 100

<210> 70

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 70

atgcctgttg gcaacgcgat agccagtggt tcggcaaagc ggttaccact ctggttgcgg 60

taaatgagca gttggctggt ggtggcataa ataaggtcaa tggtaccgga gccatcaata 120

tctgccagat agatcgctag tggattaaat 150

<210> 71

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 71

aagccatagt taaagtgtga gaaggcgtcc tgacggaaat tccaggattt tccttttatg 60

attaccggca cttgctccgc gatattactg tattcgccgt 100

<210> 72

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 72

aagcttgatc gccttggcta ataatcaagt ctaaggtacg cataaagatc gccagcttat 60

attgcatcgg atcttgcatg gcaataacat ccggatcatc 100

<210> 73

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 73

attgtacaaa aatctctgtt agactcagac ctatggcgtt ctctatttta tccgtataag 60

tcgtcgtatt actacgtcgc cacggcactt ttctgaacga 100

<210> 74

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 74

tcatcaccac ggcgaatagc aacaatcaca caaggagcaa tttgcggata atagcgctcc 60

cgacagtggt tacataagct ggcccattcc gtccggctgg 100

<210> 75

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 75

ccatcccggt ctatgacacc tccggtccct atggtgaccc acaagctaaa ctggatgttc 60

ataacgggct gcctaaactg cgtgccgctt gggtcgcaga tcgccaagat actgaagcgc 120

tggcatctgt cagttccggc tttacccaac 150

<210> 76

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 76

ccgttatcga gagcaaagct aacggattga ttagctaata ggttgtcatg agcatcggta 60

accaacgctt gtgcaatgtt accggcttta ccattcgcaa gctggttatc caagaacgac 120

gttagcttaa gctgggctgt cgaaacatcg 150

<210> 77

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 77

cacccgagac ggtatgcgtc agtgtggtac tggcagtacc attagctcct gttcttgcct 60

ctgtcgtact taatgttgcc tgagtattaa ccgcaaagtt gatgagctgc ccgataatcg 120

gttggccgtc gccatcggtt actgtggctt 150

<210> 78

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 78

cctgtaattg gcatgtcgat agttgcacgc tgaccaaagt tgtcagaagc agcgagtacc 60

gcaggatttg acgtcactcc agcttatctt tttcacgtgg cccaagagag gaagcctgag 120

tatgatgaac ctgtctttca cgcatgttga 150

<210> 79

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 79

ggtaaccatc attaaattca tactcacggc aaacccgtgt ccaggcagca taggcgctga 60

ctatacgttc atactcttcg gggcgaagat tatctctgga taagttgtac aaatagatgc 120

cgagaaggct taggctcatc tcaactcctg 150

<210> 80

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 80

aattacatca ggctcatccg ggccgggttc ttccaaggcg tcaaattggc ttctcaataa 60

atcgcttggc ataaaatggc cggaacgtgc ttgcaaccgc 100

<210> 81

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 81

cattgccacc attttcaacg ccgatatggg caaaacgctg ctgtacggca cgttgctggc 60

aatcccaacc gtgattttgg caggcccggt gtacgcccgc tttctaaaag gaattgataa 120

gcctgttcct gaagggttgt ataacccgaa 150

<210> 82

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 82

aaaataatgt tcattcggcg cggtaatggt ttatttaact gttctcacga ataaacacgt 60

ctaattccgc cagtggcttt gcaccatcaa tagcattggc 100

<210> 83

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 83

tttattcata acgcggtgcc tgtgggtgaa tgtcgatagc cgctagtcaa tcacaagccg 60

gtaaatgcaa aatgtcagaa gccgttcata attgtcataa agttgaatag ttaaccgaga 120

tcacattccc gatagggaaa tcatcgctag 150

<210> 84

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 84

aacttgctcg tggtggcggt caccctgatg gtgagtggtg tcgcggtgct gggcttcgag 60

caggcaagcc gcttacaaaa gcaggtccag gagcggacac 100

<210> 85

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 85

tcagcccaga tgaccgcggc ggtctctatc ggtattgcca gttataccgg catgccagta 60

tcgaccactc aagtgctctc ttctgctgtt gccgggacca tgttggtcga tggcggtggc 120

gtgcagagta aaacggtgaa gagcattatg 150

<210> 86

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 86

tattagtgta ggaaatgaaa tggaaaatag cctgataatc tcgcatttaa gcctatcttg 60

ccgtttgttc aataccgatt aatgttaacg tctcattggt attgattgtt atcaccgtat 120

ttctcgcgct gatcaccgtg ctcaaacatt 150

<210> 87

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 87

tatgcctatt atcctaatcc aggtagcttc agcccaatat ggattaatta cagtttcagc 60

gataaccaac atcccagcag attaaatgat ggtggcggag tattaacaca tgagatcggc 120

<210> 88

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 88

ctcagcaagg cagtgcggct tcagtggcat cgatggcagc ctatttagga ttagacctca 60

cactgccacg cattgcgctg atcgtcagtc tgcgtgaaca 100

<210> 89

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 89

agagcacact cagcagcggg atctggtcga aatattaagc aaccacagcc gtgaaacatt 60

ggtcacctta catgggtttg agcgggttgt ggtgctattg ccgctgaacc ttgcacacag 120

tgacgatcgt gaagtgacgg ccagaaaggc 150

<210> 90

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 90

actggcactg gcagttgcga cgatgctgct gacagcggtc ggggtgttta tcgatgtcgc 60

ggtgattacc gtttccccaa tcgctctggc cattgcgcac 100

<210> 91

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 91

tgatactgcg ctgcctgcct ttggtgcagc aatggcggca cctctggtcg ccatcttcct 60

actggcatta cgccctatag ctggcattgc cattgacccc 100

<210> 92

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 92

tacaaccggg gattgagata gtcaccgaag cgctaaaatt agcggctacc gtgcaaaatg 60

ctgatttagt cattaccggc gaagggcgta tcgatagcca aaccatttac ggcaaaacac 120

cggtcggggt ggcgcgagtc gcgaagcgtt 150

<210> 93

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 93

gtcgcatttg agccacccgc tgaaatatag atacccgcac ccttggtcgc atgagtacta 60

ttaatggtgt tattcgcgcc cgttaagctc cctccggaac catccagata aatgccatag 120

ctaccactgc cactggtatt gagggtggta 150

<210> 94

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 94

cgttacggtc tggcaataac cgcactaccc tctggggatt ttttactgct ggccaacaaa 60

gcaagcctga taacccagga tcgcgcctca gcagaggagc tgcaagatca cacctgtcag 120

gtgctacctc acctcccggt gcaataacac 150

<210> 95

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 95

tcccggataa gaccaattgt agatccagcc ccgccagatt tccgggatcg gttaaggtcc 60

cgacgacggc caccagagta gaaccgtagc gcatatccgc 100

<210> 96

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 96

caaaaggccg ttgtaactcg gcggagactt tttggttaat cgttggcttc aagcgattcc 60

agtcaaaaga agagacaaat atcaccaccg ccaccaatga caacaggata aacccactgg 120

cgcccaccaa tacttttccg gttcttgtca 150

<210> 97

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 97

ttttgccacc cagataatgc agtgaaatga ttcgagtcta ccaacccgac gatctcaatg 60

ccctgatgca actgtggcta accagtacta ttgacgcgca 100

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