一种生物发酵提取制备天然橙皮苷的方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术，具体涉及一种技术领域，具体为一种生物发酵提取制备天然橙皮苷的方法。

背景技术

橙皮苷是一种具有多种生物活性的天然功能性组分, 在医药、食品和化工等领域应用广泛。橙皮苷具有维持血管正常渗透压、增强毛细管韧性、降低胆固醇、调节免疫力、抗癌抗肿瘤等多种功效。橙皮苷广泛存在于桔皮和橙皮中，从桔皮和橙皮中高效环保提取橙皮苷对提高柑橘产业附加值具有重要意义。与此同时，橙皮苷是合成新型甜味剂新橙皮苷二氢查耳酮的原料。

目前，从桔皮和橙皮中提取橙皮苷的主要提取方法有索氏提取法、微波提取法、超声波提取法和碱提取酸沉淀法。其中索氏提取法提取操作简单，但提取速率慢，且溶剂消耗量大。微波提取法和超声提取法环境危害小，但提取过程中温度易升高且温度不易控制，不利于橙皮苷的稳定，不适宜工业化大规模生产。传统大规模生产的碱提取酸沉淀法成本低廉方法简单，但大量消耗石灰水容易污染环境，提取时间长，该方法的弊端已越来越明显。

发明内容

本发明提供一种生物发酵提取制备天然橙皮苷的方法，直接以新鲜桔皮或橙皮为原料，无需进行烘干及粉碎等操作，避免了提取阶段的高温条件对橙皮苷的降解，也避免了石灰水等碱液对环境的污染，整个过程设备要求简单，工艺流程短，橙皮苷的提取收率高。

本发明的技术方案是，一种生物发酵提取制备天然橙皮苷的方法，包括以下步骤：

S1、配制发酵培养液，并将其与新鲜的桔皮或橙皮混合，固液质量比1: 1~1.5;

S2、将S1中得到的物料进行蒸汽爆破处理，压力为1.0~1.2 MPa，处理时间为1-2min；

S3、S2处理后得到的物料接种微生物菌种，接种量为物料质量的1~3%，在30~35℃通气培养18~24小时；

S4、S3中的物料降低通气量进行酶解反应，调整pH为4.0~5.0，酶解时间在14~22h；酶解反应后停止通气，在20-25℃静置结晶，晶体进行过滤即得橙皮苷。

进一步地，S1中所述的发酵培养液包括可溶性淀粉10g/L-15g/L，甘油2g/L-5g/L，豆粕10g/L-15 g/L，酵母粉5g/L-10 g/L，大豆多肽粉1g/L-2g/L，二丁基羟基甲苯0.1g/L-0.2g/L，硫酸镁0.1g/L-0.2g/L和氯化锌0.05g/L-0.1g/L。

进一步地，S2中蒸汽爆破处理时，先通入蒸汽升压至0.5 ~0.7MPa，保压6~8min，然后快速通入蒸汽升压至1.0~1.2MPa，爆破处理完成后后泄至常压。

进一步地，快速通入蒸汽升压至1.0~1.2MPa所用的时间在5min内。

进一步地，S3所述的微生物菌种为黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌和酵母菌。

更进一步优选方案中，黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌的接种量均为3%，酵母菌的接种量为2%。

进一步地，S3中通气量为0.3VVM-0.5VVM。

进一步地，S4中酶解反应时，先控制温度为15~20℃，酶解反应6~12小时，再将温度调整为35~40℃，酶解反应8-10h。

进一步地，S4中酶解反应时，通气量调整为0.2VVM-0.3VVM。

进一步地，结晶过程中，结晶时间为12~18h。

本发明具有以下有益效果：

1、采用生物发酵提取的工艺，首先对微生物菌种进行快速的增殖培养，然后利用其代谢产物对桔皮或橙皮进行酶解，使得细胞壁破裂，橙皮苷能够快速溶出，提高橙皮苷的提取率，相比直接进行酶解，其易于达到要求，成本低。

2、在对桔皮或橙皮进行发酵降解之前，增加蒸汽爆破预处理，有利于生物质中细胞壁内果胶、木质纤维素等破裂，使得后期通过微生物发酵酶解处理，提升提取收率。而且避免了原材料的烘干和粉碎操作，还能起到灭菌效果，便于后期接种微生物。进一步地，现有的爆破处理，一般是一次性加压至预定范围后快速泄压，利用压力的快速变化，来增强爆破的效果，但发明人通过试验发现，蒸汽爆破处理时，先进行预加压并维持一定时间，能够使蒸汽与待提取物细胞充分接触，对细胞壁起到一定的软化作用，再增压至目标压力后进行汽爆处理，效果更好，更有助于橙皮苷收率的提高。

3、在微生物接种后，先维持通气量和一定温度，进行培养，使得微生物能够大幅繁殖。在培养基中加入了大豆多肽粉，对增加菌种活力具有显著效果；待微生物菌种繁殖达到一定规模后，开始降低通气量，抑制其继续增殖；再利用微生物代谢产物对待提取的桔皮或橙皮进行酶解，通过降低温度和控制较低的pH，有利于酶的产生和保持良好的活性，且该pH适合橙皮苷结晶，酶解完无需其他调控即可进行结晶，工艺简单。在酶解过程中维持较低的通气量，不仅能够抑制菌种的增殖，又能使微生物菌种存活率。

附图说明

图1是标准品橙皮苷的液相谱图。

图2是实施例3制备得到的橙皮苷的液相谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

以下实施例中，所用的微生物菌种中，具体为黑曲霉ATCC16404、米曲霉ATCC42149、枯草芽孢杆菌ATCC 6051和酵母菌ATCC 9763。

实施例1：

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉10g/L，甘油2g/L，豆粕10g/L，酵母粉5g/L，大豆多肽粉1.5g/L，二丁基羟基甲苯0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化锌0.05g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1的比例混合，蒸汽升压至0.5 MPa，在此压力下保压6min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.0MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照1%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，1%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，1%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC6051，1%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制30℃，通气量0.3VVM，培养时间18小时；桔皮的酶解阶段将通气量调整为0.2VVM，pH值调整为4.0，先温度控制为15℃，维持6小时，接着温度控制调整为35℃，酶解8小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀12小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率为36%。纯度达到82%。

实施例2：

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉10g/L，甘油2g/L，豆粕10g/L，酵母粉5g/L，大豆多肽粉1g/L，二丁基羟基甲苯0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化锌0.05g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1的比例混合，蒸汽升压至1.0MPa后进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照1%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，1%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，1%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC 6051，1%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制30℃，通气量0.3VVM，培养时间18小时；桔皮的酶解阶段将通气量调整为0.2VVM，pH值调整为4.0，先温度控制为15℃，维持6小时，接着温度控制调整为35℃，酶解8小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀12小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率达到31%，纯度为77%。

实施例3

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉12g/L，甘油3g/L，豆粕12 g/L，酵母粉8 g/L，大豆多肽粉1.5g/L，二丁基羟基甲苯0.15/L，硫酸镁0.15g/L，氯化锌0.08g/L；新鲜橙皮与培养液按照1:1.2的比例混合，蒸汽升压至0.7 MPa，在此压力下保压8min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.2MPa，再进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照2%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，2%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，2%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC 6051，1.5%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制35℃，通气量0.5VVM，培养时间24小时；橙皮的酶解阶段将通气量调整为0.3VVM，pH值调整为5.0，先温度控制为15℃，维持6小时，接着温度控制调整为40℃，酶解12小时；橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在25℃，静置结晶沉淀18小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率达到38%，纯度为85%，其液相谱图如图2所示。标准品橙皮苷的液相谱图如图1所示。

实施例4

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉15g/L，甘油5g/L，豆粕15g/L，酵母粉10g/L，大豆多肽粉2g/L，二丁基羟基甲苯0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化锌0.1g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1.5的比例混合，蒸汽升压至0.7 MPa，在此压力下保压8min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.2MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照3%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，3%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，3%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC 6051，2%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制35℃，通气量0.5VVM，培养时间24小时；桔皮的酶解阶段将通气量调整为0.3VVM，pH值调整为5.0，先温度控制为20℃，维持12小时，接着温度控制调整为40℃，酶解12小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀18小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率为42%，纯度为86%。

实施例5

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉15g/L，甘油5g/L，豆粕15g/L，酵母粉10g/L，大豆多肽粉1g/L，二丁基羟基甲苯0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化锌0.1g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1.5的比例混合，蒸汽升压至0.7 MPa，在此压力下保压8min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.2MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照3%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，3%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，3%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC 6051，2%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制35℃，通气量0.5VVM，培养时间24小时；桔皮的酶解阶段将通气量为0.5VVM，pH值调整为5.0，温度控制在30℃维持24小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀18小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率达到29%，纯度为79%。

实施例6

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉15g/L，甘油5g/L，豆粕15g/L，酵母粉10g/L，大豆多肽粉1g/L，二丁基羟基甲苯0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化锌0.1g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1.5的比例混合，蒸汽升压至0.7 MPa，在此压力下保压8min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.2MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照3%的接种量接种黑曲霉ATCC16404和 2%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制35℃，通气量0.5VVM，培养时间24小时；桔皮的酶解阶段将通气量调整为0.3VVM，pH值调整为5.0，先温度控制为20℃，维持12小时，接着温度控制调整为40℃，酶解12小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀18小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率为30%，纯度为78%。

实施例7

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉10g/L，甘油3g/L，豆粕10g/L，酵母粉8g/L，大豆多肽粉2g/L，二丁基羟基甲苯0.15g/L，硫酸镁0.12g/L，氯化锌0.07g/L；新鲜橙皮与培养液按照1:1.4的比例混合，蒸汽升压至0.6 MPa，在此压力下保压7min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.1MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照2%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，2%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，3%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC 6051，2%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制32℃，通气量0.4VVM，培养时间20小时；橙皮的酶解阶段将通气量调整为0.2VVM，pH值调整为4.0，先温度控制为18℃，维持10小时，接着温度控制调整为35℃，酶解10小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在22℃，静置结晶沉淀16小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率达到39%，纯度在85%。

实施例8

在发酵罐中配置培养液，可溶性淀粉15g/L，甘油4g/L，豆粕15g/L，酵母粉8g/L，大豆多肽粉2g/L，二丁基羟基甲苯0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化锌0.1g/L；新鲜桔皮与培养液按照1:1.4的比例混合，蒸汽升压至0.6 MPa，在此压力下保压8min，然后一次性大量通入蒸汽升压，一直将压力升高至1.0MPa，进行爆破；菌体生长阶段发酵罐中按照3%的接种量接种黑曲霉ATCC16404，3%的接种量接种米曲霉ATCC 42149，3%的接种量接种枯草芽孢杆菌ATCC6051，2%的接种量接种酵母菌ATCC 9763，温度控制35℃，通气量0.4VVM，培养时间24小时；桔皮的酶解阶段将通气量调整为0.3VVM，pH值调整为4.0，先温度控制为18℃，维持12小时，接着温度控制调整为38℃，酶解12小时。橙皮苷的结晶阶段停止通气，温度控制在20℃，静置结晶沉淀18小时，得到橙皮苷粗品，橙皮苷收率达到40%，纯度在85%。

上述实施例得到的橙皮苷可直接用于制备新甲基橙皮苷二氢查耳酮产品。