芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法。

背景技术

众所周知，黄樟为常绿乔木，其树姿秀丽，主干明显而通直光滑，生长快速，其胸径年平均生长量比香樟大50％，材积大100％，是优良的速生树种。黄樟枝繁叶茂，四季常青，耐修剪，可造型，且具有良好的材用、观赏、生态和经济价值，近年栽培和造林面积不断扩大。

现有优良芳樟醇型黄樟繁殖方法主要有播种、扦插和组织培养三种方法，播种受季节影响且不能保证所有播种苗能遗传母株的优良性状；扦插亦受季节影响且对优良母株伤害很大；组织培养可不受季节影响，而且只需采集少量芽既可，对优良母株无伤害。但是目前黄樟在组织培养过程中容易出现初代芽褐化、枯黄坏死及芽增殖系数低等问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法，旨在采用特定的培养基和对幼芽进行分段取殖培养，以实现幼芽快速繁殖的目的。

为实现所述发明的目的，本发明所采用的技术方案为：

一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集：取生长多年的黄樟母株当年萌发的嫩枝条作为外植体；

S2、外植体处理：将步骤1中的外植体切成带至少一个腋芽的茎段，长度为0.5cm-1.5cm，将茎段用密闭容器装好放入冰箱冷藏10h-15h，然后取出清洗消毒，备用；

S3、腋芽诱导：首先将步骤2中得到的外植体接种至MS培养基中，待腋芽成长至0.5cm-1cm,再将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养18天-25天后转入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中培养15天-20天，出现丛状小芽团；

S4、增殖培养：将步骤3中的丛状小芽团分切成3-5个芽/团，转入MS+6-BA0.2mg/L-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中30天，以30天为一个周期进行续代，续代一次将产生5-8个子芽，续代3-5代后，从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个个周期进行扩繁；

S5、生根培养：将步骤4中高于2.5cm的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+

IAA0.3mg/L的生根培养基中，培养15天-20天后根开始萌动，40天-45天后95％的芽均可完成生根形成小苗；

S6、移植：将步骤5中的小苗放入荫棚内炼苗10天，再将小苗从培养器皿中取出，移栽入泥土基质中进行生长；

所述的MS培养基包括如下组分：

720mg/LNHANO3、1800mg/LKNO3、200mg/L Ca(NO3)2、170mg/LKH2PO1、22.3mg/LMnSO4·4H20、8.6mg/L ZnS04·7H20、6.2mg/L H3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L NazMoO4·2H20、0.025mg/L CuSO·5H20、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4·7H20，以上MH培养基均采用电镀级纯水，蔗糖含量3％，卡拉胶含量0.75％，pH为5.8，以上培养条件均在温度24℃-26℃，光照强度1500-2000lx的环境下光照10h/d-12h/d。

可选地，步骤2中所述外植体的消毒步骤具体为：从冰箱取出外植体后用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30min-50min；再用酒精浸润0.3min-0.8min，再用无菌水冲洗2-3次；然后用0.1％-0.2％的升汞消毒6min-12min，最后用无菌水冲洗3-5次后用滤纸吸干水分。

可选地，步骤2中所述冰箱的冷藏温度在4℃-6℃。

可选地，步骤3中所述腋芽在培养基中暗培养18天-25天后，基部呈浅绿色。

可选地，步骤4中所述粗壮单株每株茎段可分成4-7个节段，增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍。

可选地，步骤5中所述芽的生根长度为0.4cm-0.6cm。

可选地，步骤6中所述小苗从培养器皿中取出后需洗去所述小苗的培养基。

可选地，步骤4中所述15天-20天后出现丛状小芽团时，需再观察25天-35天后再执行步骤5。

可选地，得到步骤4中的所述丛状小芽团后，需切除多余的侧面芽和不定芽。

可选地，步骤6中所述炼苗10天后，所述小苗的叶片呈绿色。

可选地，步骤3中所述外植体接种至MS培养基中需经过36天-42天的培养后，再将所述腋芽挑下。

可选地，步骤6中所述泥土基质包括1/3的椰糠和2/3的泥炭土，将所述椰糠和所述泥炭土混合。

本发明的技术方案中的MS培养基均采用电镀级纯水，水质长期稳定无其它杂质，以确保产品放入培养基后不会因培养基的水质变化而导致产品在诱导过程中出现褐化、落叶、枯黄死亡等现象。同时，外植体在诱导出芽后，幼芽经过在培养基中培养成小芽团，再将小芽团分切成3-5个芽/团，而后转入增殖培养基中进行增殖培养，首先，在MS+6-BA0.2mg/L-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中培养30天，以30天为一个周期进行续代，续代一次将产生5-8个子芽，续代3-5代后，从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁，其中粗壮单株每株茎段可分成4-7个节段，增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍，最后，将高于2.5cm的粗壮单芽挑下，接入生根培养基中，培养15天-20天后开始生根萌动，形成可种植的小苗。所以，在增殖培养过程中通过将粗壮单株芽进行分段取殖培养，极大地提高了幼芽的繁殖效率，同时降低了繁殖成本。

附图说明

图1为本发明芳樟型黄樟的组培诱导芽；

图2为本发明芳樟型黄樟的组培增殖芽；

图3为本发明芳樟型黄樟的组培生根芽；

图4为本发明芳樟型黄樟的组培苗的移栽图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例1

如图1所示，本实施例提供一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集：取生长多年的黄樟母株当年萌发的嫩枝条作为外植体；

S2、外植体处理：将步骤1中的外植体切成带至少一个腋芽的茎段，长度为0.5cm-1.5cm，将茎段用密闭容器装好放入冰箱冷藏12h，然后取出清洗消毒，备用；

S3、腋芽诱导：首先将步骤2中得到的外植体接种至MS培养基中，经过36天-42天后腋芽成长至0.5cm-1cm,再将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养20天后转入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中培养15天，出现丛状小芽团；

S4、增殖培养：将步骤3中的丛状小芽团分切成3-5个芽/团，转入MS+6-BA0.2mg/L-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中30天，以30天为一个周期进行续代，续代一次将产生5-8个子芽，续代3-5代后，从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁；

S5、生根培养：将步骤4中高于2.5cm的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中，培养15天-20天后根开始萌动，40天-45天后95％的芽均可完成生根形成小苗；

S6、移植：将步骤5中的小苗放入荫棚内炼苗10天，再将小苗从培养器皿中取出，移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中进行生长；

所述的MS培养基包括如下组分：

720mg/LNHANO3、1800mg/LKNO3、200mg/L Ca(NO3)2、170mg/LKH2PO1、22.3mg/LMnSO4·4H20、8.6mg/L ZnS04·7H20、6.2mg/L H3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L NazMoO4·2H20、0.025mg/L CuSO·5H20、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4·7H20，以上MH培养基均采用电镀级纯水，蔗糖含量3％，卡拉胶含量0.75％，pH为5.8，以上培养条件均在温度24℃-26℃，光照强度1500-2000lx的环境下光照10h/d-12h/d。

在本实施例中，本发明采用嫩枝条作为诱导对象，易于获取，保证了周期短，生根率高，易成活。取多年生优良大叶芳樟母株当年萌发的嫩枝条，切成约1cm长带腋芽的小段。注意不可用生锈的手术刀并要减少伤口在空气中暴露的时间，否则茎段会由于多酚氧化酶等的氧化作用而切口褐化，增加制种难度。采回的茎段用密闭容器装好后放入冰箱冷藏室约12h后用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30mi n以上。后用70％的酒精浸润约0.5mi n，无菌水冲洗2-3次。再视材料大小，老嫩程度分别用0.1％的升汞消毒6min-10min和0.2％的升汞消毒8min-12min，无菌水冲洗3-5次，再用滤纸吸干水后接种至MS基本培养基中，经过40天后消毒成功的腋芽生长至约0.5cm-1cm。将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养约20天后其基部形成淡黄偏绿色，疏密程度适中的质量较好的愈伤组织，把愈伤组织接入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中，培养约15天后出现丛状小芽，30d后把芽团分切成3-5个芽/团进行继代培养。

从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁，其中粗壮单株每株茎段可分成4-7个节段，增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍。也就是说，每个芽团有3-5个芽，再从芽团中选择粗壮的单株进行分段取殖培养，即分成0.3cm一节段，每株茎段可以分成4-7个节段，而一团的话可以分成20-35个节段，当然每一节段都至少有一个腋芽，续代一次将产生5-8个子芽，如此续代3-5代后，芽的增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍。最后将扩繁后的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中15—20天后根开始萌动，40—45天后有95％的苗生出2-3条长0.4-0.6cm的根即完成苗的繁殖。

将上述生成的苗放入荫棚内炼苗约10天，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗将进行正常生长。

培养基配方是否适当直接影响外植体的分化与生长，各种生长调节剂的配比显得尤为关键，本实施例将长度为0.5cm-1cm的腋芽为1个增殖单位接种到不同激素配比的诱导愈伤培养基中，试验结果见表1。

表1不同激素配比对愈伤组织的试验结果

从表1可知：腋芽对6-BA比对KT和2ip更敏感，KT和2ip所使用浓度虽和6-BA一样高，但形成愈伤率却低很多。6-BA又以4号培养基为最好，所形成腋芽质量很高。从实验结果可知，添加NAA比IAA更易诱导出愈伤组织，但NAA的浓度要严格控制，否则易导致愈伤组织玻璃化现象严重。对于轻微玻璃化现象，可通过增加培养基硬度、适当低温处理、增强光照、降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度等措施应对。

实施例2

如图2所示，本实施例提供一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集：取生长多年的黄樟母株当年萌发的嫩枝条作为外植体；

S2、外植体处理：将步骤1中的外植体切成带至少一个腋芽的茎段，长度为0.5cm-1.5cm，将茎段用密闭容器装好放入冰箱冷藏12h，然后取出清洗消毒，备用；

S3、腋芽诱导：首先将步骤2中得到的外植体接种至MS培养基中，经过36天-42天后腋芽成长至0.5cm-1cm,再将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养20天后转入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中培养15天，出现丛状小芽团；

S4、增殖培养：将步骤3中的丛状小芽团分切成3-5个芽/团，转入MS+6-BA0.2mg/L-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中30天，以30天为一个周期进行续代，续代一次将产生5-8个子芽，续代3-5代后，从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁；

S5、生根培养：将步骤4中高于2.5cm的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中，培养15天-20天后根开始萌动，40天-45天后95％的芽均可完成生根形成小苗；

S6、移植：将步骤5中的小苗放入荫棚内炼苗10天，再将小苗从培养器皿中取出，移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中进行生长；

所述的MS培养基包括如下组分：

720mg/LNHANO3、1800mg/LKNO3、200mg/L Ca(NO3)2、170mg/LKH2PO1、22.3mg/LMnSO4·4H20、8.6mg/L ZnS04·7H20、6.2mg/L H3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L NazMoO4·2H20、0.025mg/L CuSO·5H20、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4·7H20，以上MH培养基均采用电镀级纯水，蔗糖含量3％，卡拉胶含量0.75％，pH为5.8，以上培养条件均在温度24℃-26℃，光照强度1500-2000lx的环境下光照10h/d-12h/d。

在本实施例中，本发明采用嫩枝条作为诱导对象，易于获取，保证了周期短，生根率高，易成活。取多年生优良大叶芳樟母株当年萌发的嫩枝条，切成约1cm长带腋芽的小段。注意不可用生锈的手术刀并要减少伤口在空气中暴露的时间，否则茎段会由于多酚氧化酶等的氧化作用而切口褐化，增加制种难度。采回的茎段用密闭容器装好后放入冰箱冷藏室约12h后用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30min以上。后用70％的酒精浸润约0.5min，无菌水冲洗2-3次。再视材料大小，老嫩程度分别用0.1％的升汞消毒6-10min和0.2％的升汞消毒8-12min，无菌水冲洗3-5次，再用滤纸吸干水后接种至MS基本培养基中，经过40天后消毒成功的腋芽生长至约0.5cm-1cm。将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养约20天后其基部形成淡黄偏绿色，疏密程度适中的质量较好的愈伤组织，把愈伤组织接入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中，培养约15天后出现丛状小芽。30天后把芽团分切成3-5个芽/团进行继代培养。从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁，其中粗壮单株每株茎段可分成4-7个节段，增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍。最后将扩繁后的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中15—20天后根开始萌动，40—45天后有95％的苗生出2-3条长0.4-0.6cm的根即完成苗的繁殖。

将上述生成的苗放入荫棚内炼苗约10天，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗将进行正常生长。

实验表面不同激素组合对芽的诱导结果不同，见表2：

表2不同激素配比对芽诱导的试验结果

综合以上数据分析，用培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L从愈伤组织中诱导出芽效果较好。生长素方面从数据上看NAA要略优于IAA。综上以d号培养基为最好，芽最多，愈伤组织虽增大明显且其质量并没有变差。

实施例3

如图3和图4所示，本实施例提供一种芳樟醇型黄樟的组培繁殖方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集：取生长多年的黄樟母株当年萌发的嫩枝条作为外植体；

S2、外植体处理：将步骤1中的外植体切成带至少一个腋芽的茎段，长度为0.5cm-1.5cm，将茎段用密闭容器装好放入冰箱冷藏12h，然后取出清洗消毒，备用；

S3、腋芽诱导：首先将步骤2中得到的外植体接种至MS培养基中，经过36天-42天后腋芽成长至0.5cm-1cm,再将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养20天后转入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中培养15天，出现丛状小芽团；

S4、增殖培养：将步骤3中的丛状小芽团分切成3-5个芽/团，转入MS+6-BA0.2mg/L-0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培养基中30天，以30天为一个周期进行续代，续代一次将产生5-8个子芽，续代3-5代后，从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁；

S5、生根培养：将步骤4中高于2.5cm的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中，培养15天-20天后根开始萌动，40天-45天后95％的芽均可完成生根形成小苗；

S6、移植：将步骤5中的小苗放入荫棚内炼苗10天，再将小苗从培养器皿中取出，移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中进行生长；

所述的MS培养基包括如下组分：

720mg/LNHANO3、1800mg/LKNO3、200mg/L Ca(NO3)2、170mg/LKH2PO1、22.3mg/LMnSO4·4H20、8.6mg/L ZnS04·7H20、6.2mg/L H3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L NazMoO4·2H20、0.025mg/L CuSO·5H20、0.025mg/L CoCl2、27.8mg/L FeSO4·7H20，以上MH培养基均采用电镀级纯水，蔗糖含量3％，卡拉胶含量0.75％，pH为5.8，以上培养条件均在温度24℃-26℃，光照强度1500-2000lx的环境下光照10h/d-12h/d。

在本实施例中，本发明采用嫩枝条作为诱导对象，易于获取，保证了周期短，生根率高，易成活。取多年生优良大叶芳樟母株当年萌发的嫩枝条，切成约1cm长带腋芽的小段。注意不可用生锈的手术刀并要减少伤口在空气中暴露的时间，否则茎段会由于多酚氧化酶等的氧化作用而切口褐化，增加制种难度。采回的茎段用密闭容器装好后放入冰箱冷藏室约12h后用无菌水清洗干净，再用无菌水在振荡器上振荡清洗30min以上。后用70％的酒精浸润约0.5min，无菌水冲洗2-3次。再视材料大小，老嫩程度分别用0.1％的升汞消毒6-10min和0.2％的升汞消毒8-12min，无菌水冲洗3-5次，再用滤纸吸干水后接种至MS基本培养基中，经过40天后消毒成功的腋芽生长至约0.5cm-1cm。将腋芽挑下接种至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，进行暗培养约20天后其基部形成淡黄偏绿色，疏密程度适中的质量较好的愈伤组织，把愈伤组织接入MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基中，培养约15天后出现丛状小芽。30天后把芽团分切成3-5个芽/团进行继代培养。从芽团上选取高于2.5cm的粗壮单株，将其茎段分成0.3cm一段的节段，再转入MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中，使其成团扩繁生长，以50天为一个周期进行扩繁，其中粗壮单株每株茎段可分成4-7个节段，增殖倍数可扩增至9.0-12.0倍。最后将扩繁后的粗壮单芽挑下，接入1/2MS+IAA0.3mg/L的生根培养基中15—20天后根开始萌动，40—45天后有95％的苗生出2-3条长0.4-0.6cm的根即完成苗的繁殖。

将上述生成的苗放入荫棚内炼苗约10天，使其充分木质化，叶色变绿，后将小苗从培养器皿中取出，洗去培养基移栽入1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，注意保温保湿，小苗将进行正常生长。

经实验发现，在用选取的增殖培养基续代3-5代后，从芽团上选取高度大于2.5CM的粗壮单株将其茎段分成约0.3cm/段的节段用较高浓度的6-BA培养基使其成团扩繁，以50天为周期。因每株单株茎段可分4-7个节段，因此其增殖率可成倍增加且苗的质量经多代观察可以保证。从而达到大量生产且持续稳定出苗的目的，实验结果见表3：

表3粗壮单株分段在增殖培养基各处理中的生长形态

从表3中可看出，13号处理培养基用于节段成团增殖扩繁最好。

由此可见，本发明芳樟醇型黄樟的组织培养其培养基的选择：诱导愈伤以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的培养基为好；从愈伤中诱导芽以MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L的培养基为好；续代培养以MS+6-BA0.2-0.5mg/L+NAA0.1mg/L培养基为好；生根培养则以1/2MS+IAA0.3的培养基为好，且以上培养基全部采用电镀纯水。

由于芳樟醇等醇类物质，在诱导愈伤的过程中极易导致材料褐化枯叶死亡，而且即使诱导出愈伤也会慢慢变黑死亡，所以将培养基用水改为纯水，在未添加防止褐化的抗氧化剂和吸附剂的情况下，褐化情况大有改善，成功诱导出质量好的愈伤并从愈伤中诱导出小芽。也可以尝试在培养基中添加Vc或活性碳，改善褐化情况。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。