一种糖尿病动物模型制备方法及应用

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种糖尿病动物模型制备方法及应用。

背景技术

物模型是探讨糖尿病发病机制，测试新药的功效和安全性的重要手段。目前，糖尿病实验研究仍然主要应用啮齿类动物模型，这是由于它们具备维持费用低廉，标准化的饲养环境，伦理上的易于接受，快速繁殖的生物学特性，高效和成熟的遗传修饰技术，大规模的标准化表型分析计划，以及方便应用的大规模的参考信息数据库。尽管野生型和遗传修饰的工程化啮齿类动物模型已经成为基础医学研究的主要材料，但是由于啮齿类动物模型通常难以精确地模拟人类疾病的病理过程，在研究发现向人类临床转化过程中，例如，对于新的候选药物的临床效力和安全性的预测方面，常常难以获得理想的结果。近年来，猪在生物医学研究领域的应用快速增长，这是由于它们在解剖学、代谢、生理和病理生理方面与人类有许多相似性，具有很强的繁殖能力，伦理上易于接受，而且猪的遗传修饰技术发展充分。人们普遍认为非啮齿类动物模型提供了更多的信息并改善了临床前研究的预测价值，猪可以作为啮齿类动物研究成果向临床转化的桥梁。

既往建立1型哺乳类动物糖尿病动物模型造模方式通过大量注射链脲佐菌素静脉注射或者腹腔注射完全破坏胰岛B细胞，这些方法造模的动物死亡率高。既往建立2型哺乳类动物糖尿病动物模型造模方式包括长期高脂饮食诱导胰岛素抵抗；还有通过高脂饮食诱导胰岛素抵抗，后用注射链脲佐菌素静脉注射或者腹腔注射破坏胰岛B细胞，后续再次高脂饮食饲喂而实现。这些方法造模时间长，需要至少半年以上，而且动物饮食不好控制，极易失败。所以找到一种短时间的建模方法可以为进一步开发更有效的降糖药物及术式带来便利。随着内镜技术的发展，内镜超声引导下的细针注射已经广泛开展。很多报告评估了该技术在胰腺恶性肿瘤中注射抗肿瘤药物或者在胰腺囊性病变中注射乙醇行消融治疗的可行性和安全性，报告证实了内镜超声引导下的细针注射具有很高的可行性及成功率,而且并没有不良事件的发生。这项技术的成功开展使得直接胰腺注射成为可能。通过内镜超声引导下细针注射直接向动物的胰腺注射适当剂量的链脲佐菌素，将减少动物的死亡率，同时大大缩短动物模型的制备周期，克服现有方法造模时间过长的缺陷。

发明内容

本申请第一方面明提供一种糖尿病动物模型制备方法，所述糖尿病动物模型制备方法包括：

S1.对选取对象称重、测量并记录选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值；

S2.根据动物的空腹血糖及体重计算所需补充的链脲佐菌素计量；

S3.在内镜超声引导下向动物的胰腺注射步骤S2得到的链脲佐菌素计量;

S4.复测选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值至符合糖尿病指标得到糖尿病动物模型。

进一步的，所述步骤S2中所需补充的链脲佐菌素计量的计算公式为：

Mi=S×[10+(10-S)

其中，Mi为单位重量所需补充链脲佐菌素药剂量，单位为mg/kg；S为空腹血糖量，单位为mmol/l；P为计算参数。

进一步的，哺乳类动物糖尿病动物模型包括1型哺乳类动物糖尿病动物模型和2型哺乳类动物糖尿病动物模型，所述1型哺乳类动物糖尿病动物模型在计算所需补充的链脲佐菌素计量中计算参数P≥1;所述2型哺乳类动物糖尿病动物模型在步骤S1中计算参数P=0。

进一步的，所述2型哺乳类动物糖尿病动物模型在步骤S3之前需要饲喂高脂饲料0.5-2个月。

进一步的，所述高脂饲料中高脂所占比例大于40％。

进一步的，所述步骤S2包括将内窥镜经口入胃，至胃体扫查胰体及胰尾部，将钳道帽拔去，插入穿刺针，旋转手柄将穿刺针固定于钳道口，使穿刺针与超声内镜连成一体；根据需要穿刺深度将穿刺针安全锁调试至合适位置后将针芯后退露出针尖；

在超声内镜引导下避开血管，穿刺针进入胰腺实质；

将针芯推进回复原位，使穿刺针针道内混入的不需要的组织排除后彻底拔出针芯；

连接装有链脲佐菌素的注射器，在链脲佐菌素有效时间内多点注射；

拔出穿刺针，观察有无出血后撤除超声内镜。

进一步的，将内窥镜经口入胃，至胃体扫查胰体及胰尾部之前，先将动物全身麻醉，并持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度。

进一步的，将动物全身麻醉并持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度操作前，先将动物禁食水。

本申请第二方面提供糖尿病动物模型制备方法得到糖尿病动物模型在筛选治疗糖尿病药物中的应用。

在上述技术方案中，基于糖尿病动物模型，可以进行治疗糖尿病药物的药效验证、药物筛选。

综上所述，本发明提供一种糖尿病动物模型制备方法及应用，所述糖尿病动物模型制备方法包括S1.对选取对象称重、测量并记录选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值；S2.根据动物的空腹血糖及体重计算所需补充的链脲佐菌素计量；S3.在内镜超声引导下向动物的胰腺注射步骤S2得到的链脲佐菌素计量;S4.复测选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值至符合糖尿病指标得到糖尿病动物模型。本发明提供的糖尿病动物模型制备方法操作步骤简单、易于操作、制备成本低且重复性强，可以快速成模，极大的缩短了糖尿病动物模型制备时间。

附图说明

图1是本发明糖尿病动物模型制备过程中操作示意图；

图2是本发明在糖尿病动物模型制备过程中超声内镜显示图；

图3是2型糖尿病指标对比表。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供一种糖尿病动物模型制备方法，包括：

S1.对选取对象称重、测量并记录选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值；

S2.根据动物的空腹血糖及体重计算所需补充的链脲佐菌素计量；

S3.在内镜超声引导下向动物的胰腺注射步骤S2得到的链脲佐菌素计量;

S4.复测选取对象的空腹血糖以及空腹胰岛素值至符合糖尿病指标得到糖尿病动物模型。

进一步的，所述步骤S2中所需补充的链脲佐菌素计量的计算公式为：

Mi=S×[10+(10-S)

其中，Mi为单位重量所需补充链脲佐菌素药剂量，单位为mg/kg；S为空腹血糖量，单位为mmol/l；P为计算参数。

进一步的，哺乳类动物糖尿病动物模型包括1型哺乳类动物糖尿病动物模型和2型哺乳类动物糖尿病动物模型，所述1型哺乳类动物糖尿病动物模型在计算所需补充的链脲佐菌素计量中计算参数P≥1;所述2型哺乳类动物糖尿病动物模型在步骤S1中计算参数P=0。

进一步的，所述2型哺乳类动物糖尿病动物模型在步骤S3之前需要饲喂高脂饲料0.5-2个月。

进一步的，所述高脂饲料中高脂所占比例大于40％。

进一步的，所述步骤S2包括将内窥镜经口入胃，至胃体扫查胰体及胰尾部，将钳道帽拔去，插入穿刺针，旋转手柄将穿刺针固定于钳道口，使穿刺针与超声内镜连成一体；根据需要穿刺深度将穿刺针安全锁调试至合适位置后将针芯后退露出针尖；

在超声内镜引导下避开血管，穿刺针进入胰腺实质；

将针芯推进回复原位，使穿刺针针道内混入的不需要的组织排除后彻底拔出针芯；

连接装有链脲佐菌素的注射器，在保证其活性状态下多点注射；

拔出穿刺针，观察有无出血后撤除超声内镜。

进一步的，将内窥镜经口入胃，至胃体扫查胰体及胰尾部之前，先将动物全身麻醉，并持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度。

进一步的，将动物全身麻醉并持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度操作前，先将动物禁食水。

本申请第二方面提供糖尿病动物模型制备方法得到糖尿病动物模型在筛选治疗糖尿病药物中的应用。

在上述技术方案中，基于糖尿病动物模型，可以进行治疗糖尿病药物的药效验证、药物筛选。

在本实施例中，选取对象：巴马小型猪，雄性，3月龄，体重12.43kg；

测量空腹血糖：4.89mmol/L，空腹胰岛素：9.28mIU/L；

计算所需补充胰腺注射给药剂量（Mi）：Mi=S×[10+(10-S)

Mi=4.89×[10+(10-4.89)

≥4.89×[10+(10-4.89)

≥4.89×31.2221+3×4.89

≥167.346069mg/kg

根据该猪的空腹血糖及体重计算所需的剂量为Mi×12.43≈2080mg，即当所需补充胰腺注射给药剂量大于2080mg时可用于制备1型糖尿病动物模型，在本实施例中选用2100mg。

注射前实验动物禁食水，据相关文献表明禁食时间越长越容易成模，但是禁食太长动物会出现低血糖甚至死亡，因此将禁食水时间设定为12-48小时，在本实施例中选取禁食水时间12小时，称取需要的链脲佐菌素，放在一干燥灭菌瓶内，外用锡纸包好，将0.1mmol/L pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及装有链脲佐菌素的灭菌瓶置冰浴，一起带到内镜手术室，因链脲佐菌素易失活，快速称取后仍要干燥避光。

注射时用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液以10%的质量浓度溶解，现配现用，配制成21ml的溶液。按照图1和图2，操作在全身麻醉下进行，持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度；

将线阵超声内窥镜经口进入胃内，于胃体扫查胰体及胰尾部，将钳道帽拔去，插入22g（19g和22g都可以，优选22g）穿刺针，旋转手柄将针固定于钳道口，使针与超声内镜连成一体；

根据需要穿刺的深度，将穿刺针安全锁调至合适的位置，将针芯后退数毫米，使锐利的针尖露出；

在超声内镜引导下避开血管，穿刺针进入胰腺实质；

将针芯插回原来的位置，使针道内混入的不需要的组织排除，然后彻底拔出针芯；

连接装有链脲佐菌素的注射器，在链脲佐菌素易有效时间内多点注射（在可操作范围内尽可能多的选择注射点，每点的注射量为注射药物的总体积/注射点数，例如21mg/7点，每注射点注射3mg）。因链脲佐菌素易失活，须快速注射（在30分钟内注射完毕）;

注射结束后拔除穿刺针，观察有无出血，然后撤出超声内镜。

注射后第二日复测，空腹血糖33.63mmol/L，空腹胰岛素1.02mIU/L。证明1型糖尿病造模成功。

实施例2

本实施例给出了制备2型糖尿病动物模型的实施例以及具体制备过程如下：

选取对象：巴马小型猪，雄性，3月龄，体重11.36kg，

采用高脂饲料饲喂0.5-2个月，在本实施例中高脂饲料采用蔗糖37%，猪油10%，胆固醇2%，普通饲料51%，饲喂时间：1个月，饲喂量：1kg/日；

饲喂前空腹血糖S=4.46mmol/L，空腹胰岛素8.37mIU/L，胰岛素抵抗指数1.66；

饲喂1个月在注射前体重13.12kg，空腹血糖S=5.23mmol/L，空腹胰岛素9.21mIU/L，胰岛素抵抗指数2.14;

利用公式：Mi=5.23×[10+(10-5.23)

=5.23×[10+(10-5.23)

根据该猪的空腹血糖及体重计算所需的剂量为Mi×13.12≈1888.6mg，理论上（92%-105%）Mi之内的剂量都可以成功造模，在本实施例中根据该猪的空腹血糖及体重选取所需补充胰腺注射给药剂量1800mg。

准备制备：在本实施例中将该动物禁食水16小时，称取需要的链脲佐菌素，放在一干燥灭菌瓶内，外用锡纸包好，将0.1mmol/L pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及装有链脲佐菌素的灭菌瓶置冰浴，一起带到内镜手术室，因链脲佐菌素易失活，快速称取后仍要干燥避光。注射时用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液以10%的质量浓度溶解，现配现用，配制成18ml的溶液；

按照图1和图2，操作在全身麻醉下进行，持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度；

将线阵超声内窥镜经口进入胃内，于胃体扫查胰体及胰尾部，将钳道帽拔去，插入22g（19g和22g都可以，优选22g）穿刺针，旋转手柄将针固定于钳道口，使针与超声内镜连成一体，根据需要穿刺的深度，将穿刺针安全锁调至合适的位置，将针芯后退数毫米，使锐利的针尖露出；

在超声内镜引导下避开血管，穿刺针进入胰腺实质。将针芯插回原来的位置，使针道内混入的不需要的组织排除，然后彻底拔出针芯；

连接装有链脲佐菌素的注射器，多点注射（在可操作范围内尽可能多的选择注射点，每点的注射量为注射药物的总体积/注射点数，18ml/6点，每注射点注射3ml）。因链脲佐菌素易失活，须快速注射（在30分钟内注射完毕）。注射结束后拔除穿刺针，观察有无出血，然后撤出超声内镜。

观察动物的进食及活动状态，接着高脂饲喂。注射后1个月体重14.10kg，空腹血糖8.23mmol/L，空腹胰岛素8.92mIU/L，胰岛素抵抗指数3.26。按照表1的指标，达到造模标准，证明2型糖尿病动物模型制备成功。造模总时间为2个月。

实施例3

本实施例给出了制备2型糖尿病动物模型的实施例以及具体制备过程如下：选取对象：巴马小型猪，雄性，4月龄，体重14.35kg；

饲喂前空腹血糖4.96mmol/L，空腹胰岛素11.12mIU/L，胰岛素抵抗指数2.45；

选用高脂饲料饲喂0.5-2个月，在本实施例中选用高脂饲料（蔗糖37%，猪油10%，胆固醇2%，普通饲料51%）、饲喂时间：0.5个月，饲喂量：1kg/日；

饲喂1个月后，体重15.03kg，空腹血糖5.35mmol/L，空腹胰岛素11.27mIU/L，胰岛素抵抗指数2.68

利用公式：Mi=5.35×[10+(10-5.35)

=5.35×[10+(10-5.35)

根据该猪的空腹血糖及体重计算所需的剂量为Mi×15.03≈2112.58mg，理论上（92%-105%）Mi内的剂量都可以成功造模，在本实施例中选取所需的剂量为2000mg。

动物模型制备前准备：在本实施例中，将动物禁食水24小时，称取需要的链脲佐菌素，放在一干燥灭菌瓶内，外用锡纸包好，将0.1mmol/L pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及装有链脲佐菌素的灭菌瓶置冰浴，一起带到内镜手术室，因链脲佐菌素易失活，快速称取后仍要干燥避光；

注射时用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液以10%的质量浓度溶解，现配现用，配制成20ml的溶液。

糖尿病动物模型制备：按照图1和图2，操作在全身麻醉下进行，持续监测心率、呼吸频率和氧饱和度；

将线阵超声内窥镜经口进入胃内，于胃体扫查胰体及胰尾部，将钳道帽拔去，插入22g（19g和22g都可以，优选22g）穿刺针，旋转手柄将针固定于钳道口，使针与超声内镜连成一体；

根据需要穿刺的深度，将穿刺针安全锁调至合适的位置，将针芯后退数毫米，使锐利的针尖露出；

在超声内镜引导下避开血管，穿刺针进入胰腺实质。将针芯插回原来的位置，使针道内混入的不需要的组织排除；

然后彻底拔出针芯，连接装有链脲佐菌素的注射器，多点注射（在可操作范围内尽可能多的选择注射点，每点的注射量为注射药物的总体积/注射点数，20ml/5点，每注射点注射4ml）因链脲佐菌素易失活，须快速注射（在30分钟内注射完毕）；

注射结束后拔除穿刺针，观察有无出血，然后撤出超声内镜。

观察动物的进食及活动状态，接着高脂饲喂。注射后1个月体重15.26kg，空腹血糖7.78mmol/L，空腹胰岛素10.35mIU/L，胰岛素抵抗指数3.58。按照表1的指标，达到造模标准，证明2型糖尿病动物模型制备成功。造模总时间为1.5个月。

实施例4

本实施例同样的给出了制备2型糖尿病动物模型的实施例以及具体制备过程如下：

选取对象：巴马小型猪，雄性，3.5月龄，体重10.25kg，空腹血糖4.32mmol/L，空腹胰岛素9.65mIU/L，胰岛素抵抗指数1.85；

采用高脂饲料（蔗糖37%，猪油10%，胆固醇2%，普通饲料51%）、饲喂时间：2个月，饲喂量：1kg/日。

饲喂2个月后体重13.70kg，空腹血糖6.03mmol/L，空腹胰岛素10.13mIU/L，胰岛素抵抗指数2.71

利用公式：Mi=6.03×[10+(10-6.03）

=6.03×[10+(10-6.03)

根据该猪的空腹血糖及体重计算所需的剂量为Mi×13.70≈1629.99mg，理论上（92%-105%）Mi内的剂量都可以成功造模，在本实施例中选取所需的剂量为为1500mg。

采用同实施例1-3相同的制备动物模型准备步骤和制备步骤操作后观察动物的进食及活动状态，接着高脂饲喂。糖尿病动物模型制备1个月后体重14.24kg，空腹血糖10.35mmol/L，空腹胰岛素9.22mIU/L，胰岛素抵抗指数4.24。按照表1的指标，达到造模标准，证明2型糖尿病动物模型制备成功。糖尿病动物模型制备成功总时间为3个月。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。