一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法

技术领域

本申请属于突变体筛选技术领域，尤其涉及一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法。

背景技术

在大肠杆菌中，L-阿拉伯糖的代谢是由araB、araA和araD基因所编码的三种酶催化组成，它们形成一个基因簇，简写为araBAD，当有L-阿拉伯糖存在时，阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白(AraC)与其诱导物L-阿拉伯糖结合形成复合体从而诱导表达，当L-阿拉伯糖不存在时，或者存在葡萄糖时，表现为阻遏，不表达。

常见的经典操纵子模型涉及阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、四环素操纵子模型等等，它们具有良好的诱导调控性能，被广泛的应用于生物技术领域，但是随着合成生物学的兴起，目前的操纵子模型已经无法满足行业的需求，如代谢途径复杂、难以合成、产量低、成本高等等，开发响应其它小分子的操纵子则有利于解决这一难题。目前，定向进化广泛应用于小分子的改造，一般步骤主要包括突变文库的构建、突变体的筛选。常用的筛选系统主要依靠于大型仪器，如微流控、流式细胞仪等，面临操作复杂、成本高等问题，不利于实验的高效开展。因此亟需开发一种简单的、不依靠大型仪器的突变体筛选系统。

发明内容

鉴于此，本申请提供了一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法，本申请的双重筛选系统是一种简单的、不依靠大型仪器即可筛选AraC突变体的系统，该方法还可以被用于筛选相应AraC突变体的操纵子模型。

本申请第一方面提供了一种AraC突变体的双重筛选系统，包括：

第一轮筛选质粒和第二轮筛选质粒；

所述第一轮筛选质粒为含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和毒性基因的质粒；

所述第二轮筛选质粒为含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和卡那霉素基因的质粒。

优选的，所述毒性基因选自ccdB、MazF、RelB中的一种或多种。

优选的，所述ccdB的具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。

本申请第二方面提供了AraC突变体的筛选方法，包括：

步骤1、构建所述的双重筛选系统；

构建AraC突变体文库；

步骤2、以所述第一轮筛选质粒为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第一轮筛选质粒骨架；

以所述第二轮筛选质粒为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第二轮筛选质粒骨架；

步骤3、采用基因工程手段，将AraC突变体文库构建至所述第一轮筛选质粒骨架中，得到含有所述AraC突变体文库的第一筛选质粒；

步骤4、将所述第一筛选质粒转化至宿主菌中，加入阿拉伯糖，所述阿拉伯糖诱导所述宿主菌表达所述毒性基因，所述毒性基因表达的毒性蛋白用于去除含有AraC非突变体的宿主菌，以及去除含有无活性AraC突变体的宿主菌；不响应所述阿拉伯糖诱导的且有活性AraC突变体的宿主菌存活；

步骤5、从所述有活性AraC突变体的宿主菌中获得AraC突变体的核苷酸片段；

步骤6、将所述AraC突变体的核苷酸片段构建至所述第二轮筛选质粒骨架中，得到含有有活性AraC突变体的第二筛选质粒，将所述第二筛选质粒转化至宿主菌中，通过添加卡那霉素和预设诱导分子，响应所述诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌存活，筛选得到响应所述诱导分子诱导的AraC突变体。

优选的，步骤1具体包括：通过易错PCR扩增方法得到AraC突变体。

具体的，采用PCR低保真酶扩增AraC基因，得到AraC突变体。

具体的，步骤1中，所述第一轮筛选质粒的制备方法包括：

将含有阿拉伯糖启动子和AraC基因的商业化载体线性化，使得所述线性化位置为外源基因插入位点，得到Arac外骨架；

通过无缝克隆的方法，将毒性基因构建至所述Arac外骨架中，得到第一轮筛选载体质粒。具体的，所述Arac外骨架与所述毒性基因按照摩尔比1：3比例混合进行无缝克隆。

具体的，步骤1中，所述第二轮筛选质粒的制备方法包括：

将含有阿拉伯糖启动子和AraC基因的商业化载体线性化，使得所述线性化位置为外源基因插入位点，得到Arac外骨架；

通过无缝克隆的方法，将卡那霉素基因构建至所述Arac外骨架中，得到第二轮筛选载体质粒。具体的，所述Arac外骨架与所述卡那霉素基因按照摩尔比1：3比例混合进行无缝克隆。

优选的，步骤2中，所述毒性基因选自ccdB、MazF和、RelBE、HigB、Doc和VapC中的一种或多种。

更优选的，所述毒性基因选自ccdB基因，所述ccdB的具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。

优选的，步骤3中，所述第一筛选质粒的制备方法包括：

通过无缝克隆的方法，将所述AraC突变体文库的基因构建至所述第一轮筛选质粒骨架中，得到含有所述AraC突变体文库的第一筛选质粒。

优选的，步骤6中，所述第二筛选质粒的制备方法包括：

通过无缝克隆的方法，将所述AraC突变体的核苷酸片段构建至所述第二轮筛选质粒骨架中，得到含有所述AraC突变体的核苷酸片段与所述卡那霉素基因的第二筛选质粒。

优选的，步骤6中，不响应所述诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌死亡。

优选的，步骤6具体包括得到含有有活性AraC突变体的第二筛选质粒之后，测序验证所述第二筛选质粒，以验证得到AraC突变体的核苷酸片段。

优选的，步骤6中，添加卡那霉素和预设诱导分子，以筛选得到响应所述诱导分子诱导的AraC突变体的过程次数为多次，通过多次所述诱导分子诱导，富集响应所述诱导分子诱导的AraC突变体的宿主菌，从而得到响应所述诱导分子诱导的AraC突变体。

具体的，步骤4和步骤6中，所述宿主菌选自BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、OrigamiB系列大肠杆菌、TOP10系列大肠杆菌中的一种或多种。

具体的，步骤4中，因为所述第一轮筛选质粒中含有AraC突变体或AraC非突变体，所以通过阿拉伯糖对宿主菌进行第一轮筛选，阿拉伯糖可诱导含有AraC非突变体的宿主菌表达所述毒性基因，表达出毒性蛋白，因此，响应阿拉伯糖诱导的含有AraC非突变体的宿主菌会被该毒性蛋白杀死；无活性AraC突变体的宿主菌会表达所述毒性基因，表达出毒性蛋白，因此，无活性AraC突变体的宿主菌会被该毒性蛋白杀死；与此同时，不响应所述阿拉伯糖诱导的且含有有活性AraC突变体的宿主菌中所述毒性基因不表达，含有有活性AraC突变体的宿主菌存活。

具体的，步骤5中，通过常规细菌培养方法富集所述含有有活性AraC突变体的宿主菌，然后通过常规PCR方法从所述含有有活性AraC突变体的宿主菌中获得AraC突变体的核苷酸片段。

优选的，步骤6中，预设的诱导分子可以为现有任意一种物质，所述诱导分子可以为代谢性诱导物质或非代谢性诱导物质。

优选的，步骤7中，不响应所述诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌死亡。

具体的，不响应所述诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌，不能表达所述卡拉霉素基因，所述宿主菌不具有卡拉霉素抗性，会被卡拉霉素杀死。

具体的，步骤6中，因为所述第二轮筛选载体质粒中含有不响应阿拉伯糖的AraC突变体，所以添加任意诱导分子和卡拉霉素对宿主菌进行第二轮筛选，若该不响应阿拉伯糖的AraC突变体不响应该诱导分子，即该诱导分子不能诱导含有该AraC突变体的宿主菌表达所述卡拉霉素基因，不能表达出卡拉霉素蛋白，因此，不响应该诱导分子诱导的含有AraC突变体的宿主菌会被卡拉霉素杀死；若该不响应阿拉伯糖的AraC突变体响应该诱导分子，即该诱导分子能诱导含有该AraC突变体的宿主菌表达所述卡拉霉素基因，表达出卡拉霉素蛋白，因此，响应该诱导分子诱导的含有AraC突变体的宿主菌具有卡拉霉素抗性，不会被卡拉霉素杀死，存活下来。因此，存活下来的宿主菌即含有新的操纵子系统，为该诱导分子和响应该诱导分子的AraC突变体。

可见，本申请根据AraC诱导原理，利用毒性基因设计了第一轮筛选系统AraC-毒性基因，利用毒性基因(如ccdB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)经过阿拉伯糖诱导重复多次，去除无活性的AraC突变体以及无突变的AraC。根据Kana抗性原理，设计了第二轮筛选系统AraC-kana系统，使用添加特定的诱导分子，不断诱导富集，响应该诱导分子的AraC突变体活性越高，其表现kana抗性越高，即能筛选得到诱导分子和响应该诱导分子的AraC突变体。

本申请涉及一种简单针对响应任意小分子的阿拉伯糖操纵子突变体双重筛选系统。该方法适用于响应任意小分子AraC突变体(AraCm)的筛选及鉴定，具体包括：构建去除无突变和无活性的AraC第一轮筛选系统AraCm-毒性基因、响应任意小分子的AraC突变体的第二轮筛选系统AraCm-kana、第一轮与第二轮筛选系统的验证即可筛选得到诱导分子和响应该诱导分子的AraC突变体。本申请提供的双重筛选方法简单、快捷、实用，可极大节省AraC突变体的筛选时间与成本。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例提供的Arac-ccdB载体构建示意图；

图2为本申请实施例提供的Arac-kana载体构建示意图；

图3为本申请实施例提供的Arac-ccdB筛选系统验证示意图；

图4为本申请实施例提供的Arac-kana筛选系统验证示意图；

图5为本申请实施例提供的AraC突变体的筛选方法的原理和流程示意图。

具体实施方式

本申请提供了一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法，用于解决现有技术筛选操纵子模型方法中存在的依靠大型仪器、操作复杂、成本高的技术缺陷。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。

本申请所叙述的一些术语具有如下含义：

ccdB：毒性蛋白DNA旋转酶B。

AraC：阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白。

AraCm：阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白突变体。

cmR：氯霉素抗性。

本申请所用的AraC基因、kana基因和ccdB基因序列可从ncbi数据库中获得。

实施例1

本申请实施例提供了第一轮筛选载体质粒(Arac-ccdB)、第二轮筛选载体质粒(Arac-kana)的构建，方法包括：

如图1和图2所示，图1为Arac-ccdB载体含有正常Arac、ccdB、cmR抗性基因(用于宿主菌的筛选)。图2为Arac-kana载体含有正常Arac、kana、cmR抗性基因(用于宿主菌的筛选)。

通过无缝克隆的方法，将Arac-ccdB外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC基因且不含有ccdB基因的表达载体质粒)与ccdB片段混匀；Arac-kana外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC且不含有kana基因的表达载体质粒)与kana片段混匀，转入大肠杆菌DH5α感受态中，进行筛选，包括如下步骤：

以本实验室保持的质粒MP4为模板，分别通过特异性引物，扩增出Arac外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC基因且不含有ccdB基因的线性片段)，以基因合成片段ccdB，扩增出ccdB片段。

通过无缝克隆试剂盒，将该Arac外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC基因且不含有ccdB基因的线性片段)与ccdB片段按照摩尔比1：3比例混匀，得到含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和ccdB基因的第一轮筛选质粒。

以本实验室保持的质粒MP4为模板，通过特异性引物，扩增出Arac外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC基因且不含有kana基因的线性片段)。以pET28a为模板，扩增出kana片段。

通过无缝克隆试剂盒将该Arac外骨架(为含有响应阿拉伯糖的AraC基因且不含有kana基因的线性片段)与kana片段按照摩尔比1：3比例混匀，最后分别在50℃处理20min，涂布于LB(cmR)，挑取阳性克隆子进行验证及测序。

上述克隆所用引物如表1所示。

表1引物表

克隆的其他条件：上下引物各20pmol。PCR反应条件为98℃2min；98℃10s；55℃30s；循环25次，72℃1min。

1、Arac-ccdB第一轮筛选质粒的验证：

通过测序无误后，挑取上述中含有Arac-ccdB第一轮筛选质粒的宿主菌接种于5mLLB含cmR抗性液体培养基，挑取DH5α单菌落接种于5mL LB液体培养基，全部放入摇床37℃200rpm培养12h，分别将Arac-ccdB宿主菌、DH5α接种于50mL LB液体培养基至OD

2、Arac-kana第二轮筛选质粒的验证：

通过测序无误后，挑取含有Arac-Kana第二轮筛选质粒的宿主菌接种于5mL LB含cmR抗性液体培养基，挑取DH5α单菌落接种于5mL LB液体培养基，全部放入摇床37℃200rpm培养12h制备种子夜，分别将Arac-kana、DH5α种子液接种于50mL LB液体培养基至OD

经过上述验证后成功得到第一轮筛选载体质粒(Arac-ccdB)、第二轮筛选载体质粒(Arac-kana)。

实施例2

本申请实施例提供了AraC突变体的筛选方法，具体包括：

请参阅图5，图5为筛选AraC突变体及其诱导分子放入原理和流程示意图，从图5可知，本申请方法包括Arac-ccdB第一轮筛选和Arac-kana第二轮筛选，具体包括：

构建AraC突变体文库；

以第一轮筛选质粒(Arac-ccdB)为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第一轮筛选质粒骨架；

以第二轮筛选质粒(Arac-kana)为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第二轮筛选质粒骨架；

采用基因工程手段，将AraC突变体文库构建至第一轮筛选质粒骨架中，得到含有AraC突变体文库的第一筛选质粒；

将含有AraC突变体文库的第一轮筛选质粒的宿主菌在阿拉伯糖下进行第一轮筛选，响应阿拉伯糖诱导的AraC的宿主菌中ccdB基因被诱导表达，该ccdB蛋白杀死该宿主菌，无AraC活性的突变体宿主菌中，ccdB基因会被表达，该ccdB蛋白杀死该宿主菌；不响应阿拉伯糖诱导的AraC突变体且具有AraC活性的宿主菌中ccdB基因不能被诱导表达，该宿主菌存活，该过程进行数次，富集不响应阿拉伯糖诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌。

然后获取存活宿主菌中不响应L-阿拉伯糖的AraC突变体核苷酸序列，将该AraC突变体的核苷酸片段构建至第二轮筛选质粒骨架中，得到含有有活性AraC突变体的第二筛选质粒，将第二筛选质粒转化至宿主菌中，通过添加卡那霉素和预设诱导分子，在该诱导分子和卡拉霉素作用下进行第二轮筛选，不响应该诱导分子诱导的AraC突变体的宿主菌中卡拉霉素基因不被诱导表达，该宿主菌不具有卡拉霉素抗性，被卡拉霉素杀死；响应该诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌中卡拉霉素基因被诱导表达，该卡拉霉素蛋白使得宿主菌具有卡拉霉素抗性，该宿主菌存活，最终获得响应该诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体(图5中的AraCm)。

其中，上述加入卡拉霉素和预设诱导分子的过程进行数次，直到得到响应该诱导分子诱导的含有有活性AraC突变体的宿主菌，然后通过多次诱导分子和卡拉霉素的诱导，富集该宿主菌，得到有活性AraC突变体。

因此，本申请提供的方法通过两轮筛选，得到响应该诱导分子的AraC突变体，即得到新的操纵子系统。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 广州市乾相生物科技有限公司

<120> 一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法

<130> MP22006886

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Phe Lys Val Tyr Thr Tyr Lys Arg Glu Ser Arg Tyr Arg Leu

1 5 10 15

Phe Val Asp Val Gln Ser Asp Ile Ile Asp Thr Pro Gly Arg Arg Met

20 25 30

Val Ile Pro Leu Ala Ser Ala Arg Leu Leu Ser Asp Lys Val Ser Arg

35 40 45

Glu Leu Tyr Pro Val Val His Ile Gly Asp Glu Ser Trp Arg Met Met

50 55 60

Thr Thr Asp Met Ala Ser Val Pro Val Ser Val Ile Gly Glu Glu Val

65 70 75 80

Ala Asp Leu Ser His Arg Glu Asn Asp Ile Lys Asn Ala Ile Asn Leu

85 90 95

Met Phe Trp Gly Ile

100