多核酸检测用结构物以及疾病、病毒或菌感染诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种不需从样品纯化核酸，直接应用样品即可同时进行核酸的纯化和检测的结构物，基于侧向流动性的一体化系统，即使不从样品纯化核酸而直接应用，也具有高检测灵敏度，并且可以同时检测多个靶核酸，从而能够快速简单地诊断多种疾病。

背景技术

随着医疗服务水平的提高和诊断设备的发展，研发一种能够在日常生活中快速方便地测量的技术，以有效地应对新病毒、超级细菌、结核病、食物中毒细菌等威胁人类健康的传染性微生物。可以测量这些的分子诊断虽然是灵敏度和特异性优异的诊断方法，但经常需要特殊设备或试剂，或者包括复杂的过程。免疫诊断方法虽然容易、快速且简单地用试剂盒重现，但具有测量灵敏度低的问题。

目前，使用实时PCR(Real-time PCR)的诊断法被称为最快且最灵敏的诊断法，通常可以在8小时以内诊断。目前，随着PCR技术和微通道技术的发展，分子诊断方法也急速发展，如由Alere公司制造的AlereTM I或由Roche公司制造的Cobas Influenza等可在60分钟内检测的产品也已上市。然而，就可进行急速分子诊断的方法学而言，需要昂贵的分析设备或昂贵的检查费用，并且需要几个步骤来实现分子诊断的全过程，因此现场诊断仍然存在局限性。

目前普遍的分子诊断法使用实时PCR，因其快速性而最普遍，但现场诊断或初级和二级医疗机构使用时需要大型且昂贵的设备，因此难以方便使用。分子诊断大致需要三个步骤：样品的预处理(preparation)、核酸扩增反应(reaction)和检测(detection)，核酸扩增反应和检测可以通过实时PCR设备同时重现，但仍然存在样品的预处理问题。

另一方面，纸上实验室(Lab-on-paper)技术是指基于一体化系统的技术，在一个芯片上执行样品的预处理、等温扩增、检测和分析步骤。由于可以通过小纸和纸中植入的芯片结构物自动化所有反应并快速执行，因此具有不受检测现场等场所的限制的优点。

发明内容

要解决的技术问题

在一个方面，提供一种多核酸检测用结构物，包括：样品垫，容纳生物样品，缓冲垫，配置成与所述样品垫分开，并容纳再水化缓冲液，第一连接垫，配置在所述样品垫的上部，并连接样品垫与反应垫，引发垫，配置在所述缓冲垫的上部，并连接缓冲垫和反应垫，反应垫，配置在所述第一连接垫和引发垫的下部，包括能够与靶核酸特异性结合的引物以及用于等温扩增反应的试剂，并且产生等温扩增反应，阻挡垫，配置在所述反应垫的上部，保持反应温度以及阻挡样品的蒸发，第二连接垫，配置在所述反应垫的上部，并且金纳米颗粒固定在所述第二连接垫，检测垫，配置在所述第二连接垫的下部，从与所述金纳米颗粒结合的等温扩增反应物获得扩增的靶核酸，吸收垫，配置在所述检测垫的侧方，并吸收残留的样品，以及加热垫，配置在所述样品垫、引发垫、反应垫和第二连接垫的下部。

另一方面，提供一种多核酸检测用结构物，所述样品垫、第一连接垫、反应垫、第二连接垫、检测垫和吸收垫依次至少部分地接触并沿侧向配置，并且缓冲垫、引发垫、反应垫、第二连接垫、检测垫和吸收垫依次至少部分地接触并沿侧向配置。

又一方面，提供一种疾病或菌感染诊断试剂盒，包括所述多核酸检测用结构物。

又一方面，提供一种用于疾病或菌感染诊断的信息提供方法，使用所述多核酸检测用结构物。

用于解决问题的手段

这里使用的专业术语仅用于描述特定实施例，而无意于限制本发明。除非明确地表示与此相反的意思，这里使用的单数形式包括复数形式。说明书中使用的“包括”的含义指定特定特性、领域、整数、步骤、操作、要素及/或成分，并不排除存在或添加其他特性、领域、整数、步骤、操作、要素、成分及/或群。

如果没有进行特殊的定义，本说明书中使用的所有术语(包括技术及科学术语)可以作为本发明所属技术领域的具有一般知识的人员能够共同理解的意思来使用。并且，通常使用的在辞典中有定义的术语，在没有进行明确的特殊定义的情况下，不会进行异常或过度解释。

以下，参照附图，对根据本发明的优选实施例的多核酸检测用结构物进行说明。

本发明的疾病或菌感染诊断系统基于纸芯片上实验室(lab-on-paper chip)技术，如果使用本发明的疾病或菌感染诊断系统，即使不单独纯化核酸，也可以在移动到反应垫的同时纯化核酸物质并直接施加于扩增反应，可以通过应用单个样品来同时检测多个靶核酸，并诊断相关疾病。为了实现这一点，本发明的核酸检测用结构物包括样品垫120、第一连接垫131、缓冲垫121、引发垫132、反应垫140、加热垫141、阻挡垫142、第二连接垫150、检测垫160、吸收垫170和壳体110作为构成要素。

以下，对每个构成要素进行详细说明。

样品垫

样品垫120容纳含有核酸物质的样品。所述样品为从人体分离出来的，包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、汗液、尿液、细胞培养液、组织悬液等，但不限于此。所述样品可以与细胞溶解用缓冲液(Lysis buffer)混合，根据需求，在与所述细胞溶解用缓冲液混合后，可以通过离心、过滤、沉淀等公知的方法进一步纯化。优选地，所述样品在与细胞溶解用缓冲液混合后，除了核酸检测用结构物以外，不包括纯化步骤以施加于所述样品垫。

所述细胞溶解用缓冲液(Lysis buffer)可包含5mM至80mM、5mM至50mM或10mM至50mM的Tris(三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane))。具体地，Tris可以是三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，作为用于细胞溶解用缓冲液中的缓冲剂，可以减少突然的pH波动。

所述细胞溶解用缓冲液的pH可以为8.0至9.0。当pH小于8.0时，核酸物质的稳定性可能会降低或者移动速度可能会降低。

所述细胞溶解用缓冲液可包含5mM至50mM、5mM至40mM或10mM至20mM的氯化钾(KCl)。超过50mM的高浓度氯化钾有助于细胞溶解，但降低溶出的核酸物质的水溶性，因此可能需要添加大量的附加缓冲液或者增加移动到反应垫所需的时间。相反地，当氯化钾少于5mM时，细胞可能无法正常溶解。

所述细胞溶解用缓冲液可包含1mM至30mM、1mM至20mM或2mM至16mM的硫酸镁(MgSO

所述细胞溶解用缓冲液可包含5mM至50mM、5mM至40mM或10mM至20mM的硫酸铵((NH

所述细胞溶解用缓冲液可包含0.01mg/ml至0.1mg/ml或0.03mg/ml至0.07mg/ml的蛋白质分解酵素。蛋白质分解酵素通过分解高分子蛋白质，使得高分子蛋白质不阻挡作为核酸移动路径的基板或纸的气孔，并且通过抑制核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性来增加核酸物质的稳定性。所述蛋白质分解酵素可以是蛋白酶K(proteinase K)。

表面活性剂可以是曲拉通X-100或吐温20，基于细胞溶解用缓冲液重量，可包含0.01w/w％至0.2w/w％，优选地，可包含0.05w/w％至0.1w/w％。

所述细胞溶解用缓冲液可以以与样品的体积比为1:1的方式使用。

所述细胞溶解用缓冲液可能不包含甘油。有时会添加甘油以防止蛋白质的沉淀，但甘油增加粘度并减少细胞溶解物的流动性，从而可能干扰核酸物质的移动。

所述细胞溶解用缓冲液可能不包含还原剂。还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇等，有助于使蛋白质变性并增加细胞溶解物的水溶性，但当存在于流入纸芯片的溶液中时，可能会干扰荧光或检测反应。

包括配置在所述样品垫的下部并用于加热所述样品垫的加热垫141。为了通过细胞溶解用缓冲液有效地溶解样品，在60至80℃的温度下加热1分钟至5分钟加热垫，优选为5分钟，从而在样品垫中促进包括病毒和上皮细胞的样品的溶解。

当应用所述细胞溶解用组合物时，在由聚砜膜(例如，Vivid GF)或硝酸纤维素膜制成的样品垫120中促进细胞的溶解，使得更容易地检测核酸。所述聚砜膜和硝酸纤维素膜可以具有两个以上层叠的结构。所述聚砜膜可以是不对称的，聚砜膜和硝酸纤维素膜可以是具有0.5μm至1μm的气孔的多孔材料。所述气孔略大的比较有利，很多生物样品具有粘度，尤其，当用细胞溶解用组合物处理样品时，核酸物质和蛋白质向细胞外溶出的同时，粘度可能会显著增加。因此，样品垫的气孔尺寸优选具有适合快速吸收样品的尺寸。

通过使用所述细胞溶解用缓冲液，可以更容易地以侧流式(lateral flow)检测核酸。术语“侧流式”是指使样品在不使用重力的情况下通过毛细管现象或扩散现象沿水平方向从施加点流到目标点的方式。由于细胞溶解物中含有大量能够分解核酸物质的水解酶，当长时间停留在移动路径时，核酸物质的产量可能会下降。因此，为了施加于侧流式核酸检测用结构物，应具有优异的流度，并且在样品移动时不应沉淀细胞溶解物而阻塞移动路径。另外，不应与核酸物质形成盐而产生沉淀或降低移动速度。本发明的细胞溶解用缓冲液的组合物即使不包括甘油或还原剂，也不会使细胞溶解物或核酸物质沉淀，并且可以以高收率将核酸物质侧向移动到反应垫。

第一连接垫

第一连接垫131与样品垫部分地接触并配置在样品垫的上部，以与样品垫相比宽度较窄的结构物连接样品垫和反应垫。

第一连接垫是由纤维素膜制成的材料，可以具有0.005μm至0.015μm的气孔。

缓冲垫

缓冲垫121作为滴加再水化缓冲液的垫，起到向结构物施加水压的作用。缓冲垫可以配置成与样品垫分开，以最小化如蛋白质的细胞分解残物向反应垫移动，并且在反应完成后施加水压来诱导仅等温扩增反应物向检测垫移动。

应用于缓冲垫的再水化缓冲液为附加缓冲液，例如，可以是包含5mM至80mM的Tris-HCl、20mM至70mM的氯化钾、0.5mM至5mM的硫酸镁、1mM至30mM硫酸铵和0.01w/w％至0.2w/w％的吐温

所述缓冲垫是具有0.5μm至1μm的气孔的多孔材料以能够充分接收再水化缓冲液，可以是棉、绒布、纸、硝酸纤维素，醋酸纤维素、玻璃纤维、聚砜、聚丙烯酸、聚腈、聚哌嗪、聚酰胺、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚乙烯亚胺、聚二甲基硅氧烷或其混合物。

引发(opener)垫

引发垫132配置在缓冲垫的上部，通过与缓冲垫相比宽度相对窄的结构物连接缓冲垫和反应垫。

引发垫由纤维素膜制成，可以具有0.005μm至0.015μm的气孔。与反应垫接触的部分的引发垫可以涂有低熔点琼脂糖或蜡。当涂覆垫时，先阻挡缓冲垫的再水化缓冲液，并在反应垫完成反应时通过加热引发垫来使再水化缓冲液向侧方流动，从而可以使扩增的核酸从反应垫流向检测垫。

用于加热的加热垫141可以配置在所述引发垫下部。如果在等温扩增结束时加热，等温扩增的结果物容易从反应垫移动到检测垫。所述加热可以在60至80℃进行1分钟至5分钟，优选进行2分钟。

反应垫

反应垫是与纸上实验室中的纸芯片相对应的构成要素，固定有等温扩增反应试剂，其包括用于扩增反应的dNTP、DNA聚合酶、逆转录酶、荧光标记物、等温扩增反应缓冲剂等。因此，含有核酸物质的溶液通过施加于样品垫的附加缓冲液渗入并润湿反应垫，当所述等温扩增反应试剂和样品的接触物移动到反应垫，并在反应垫下部通过加热垫以60至70℃的温度加热时，发生等温扩增反应或逆转录等温扩增反应。

具体而言，所述等温扩增反应试剂可包含dNTP(1.4mM，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、等温扩增缓冲剂(1X，20mM的Tris-HCl、10mM的(NH

反应垫140与第一连接垫和引发垫部分地接触，并且可以配置在第一连接垫和引发垫的下部和侧方。为了以可发生等温扩增反应的温度加热，可以将加热垫141配置在所述反应垫140下部。所述加热垫可包括用于加热的加热丝或加热板。所述加热可以在60至70℃，优选为在60至65℃，进行20分钟至1小时，优选为进行20分钟至30分钟。

在所述反应垫中，为了增加等温扩增反应的效率，可以将阻挡垫142配置在反应垫上部，从而起到阻挡作用。一系列配置的垫可以通过层压的阻挡垫来保持等温扩增反应温度，并且阻挡试剂的蒸发来提高反应效率。所述阻挡垫可以是可以从无孔膜或外部空气阻挡反应垫的结构物。

所述反应垫具有多个孔，每个孔固定有正向和反向内引物(inner primer：FIP和BIP，1.6μM)、环引物(loop primer：FL和BL，0.4μM)和外引物(outer primer：F3和B3，0.2μM)作为用于等温扩增反应的引物组。所述引物的浓度是相对于孔体积的浓度，孔中的引物组的浓度可以在保持每个引物之间的浓度比的情况下变更。由于反应垫中存在孔，因此等温扩增反应更集中地发生。具体地，所述孔在底部形成水凝胶层，可以是所述引物组固定在水凝胶层的形式。为了特定靶核酸的集中扩增，特异地结合在彼此不同靶核酸的引物组可以固定在每个孔。

含有所述引物的水凝胶层可以例如以以下方法形成。基于水凝胶溶液总体积，混合20％v/v的可紫外光交联的聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA，Sigma-Aldrich，MW700)、40％v/v的聚(乙二醇)(PEG，Sigma-Aldrich，MW600)和5％v/v光引发剂2-羟基-2-甲基苯丙酮(Sigma-Aldrich)和35％的缓冲剂(PBS缓冲液，pH7.5)，并且通过在这里混合引物组来制备水凝胶溶液。优选包含所述聚(乙二醇)以增加水凝胶微粒的孔隙率。然后，将所述水凝胶溶液涂布在反应垫的每个孔内表面，并在紫外线下暴露1分钟(360nm波长，35mJ/cm

在所述引物组中，正向和反向引物中的任意一种可以用从由Cy3、Cy5、TAMRA、TEX、TYE、HEX、FAM、TET、JOE、MAX、ROX、VIC、Cy3.5、Texas Red、Cy5.5、TYE、BHQ、Iowa Black RQ和IRDye构成的组中选择的一种以上的荧光标记物进行标记。所述荧光标记物可以针对每个靶核酸进行不同标记，以独立地检测靶核酸。

在所述引物组中，正向和反向引物中的另一种可以结合生物素。由于生物素可以与链霉亲和素(streptavidin)结合，因此以结合在扩增的靶核酸的形式存在并通过第二连接垫的同时，在金颗粒的表面与链霉亲和素结合，当在检测垫捕获时，可视化检测结果。生物素可以设计为存在于扩增的靶核酸中与检测物相对的位置，例如，当将检测物结合在正向引物的5'末端时，可以将生物素结合在反向引物的5'末端。

所述反应垫由醋酸纤维素膜材料制成，可以具有0.001μm至0.005μm，优选为0.005μm的气孔尺寸，使得样品和附加缓冲液的流动自由的同时，核酸停留时能够充分地进行等温扩增反应。

所述反应垫可包含40mM至50mM的蔗糖、0.001至0.01％的曲拉通X-100和0.1w/w％至0.3w/w％的甘油。这可以增加等温扩增反应试剂和引物组等暴露于水分或氧气时的其存储稳定性。所述存储稳定性是指，在25℃至30℃下存储3周以上而没有分解物或副产物。

第二连接垫

第二连接垫150与反应垫部分地接触，并且可以配置在反应垫的上部和侧方。第二连接垫150包含金纳米颗粒，所述金纳米颗粒在反应垫与扩增的核酸结合并移动到检测垫。金纳米颗粒可优选为在其表面固定链霉亲和素。第二连接垫为棉、绒布、纸、硝酸纤维素、玻璃纤维、聚砜、聚丙烯酸、聚腈、聚哌嗪、聚酰胺、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚乙烯亚胺、聚二甲基硅氧烷或其混合物的多孔材料，可以具有0.01μm至0.05μm，优选为0.05μm的气孔尺寸，使得扩增的核酸易于移动到检测垫。

第二连接垫可以具有纤维素材料，与反应垫接触的部分的第二连接垫可以涂有低熔点琼脂糖或蜡。当垫被涂布时，阻挡反应垫的等温扩增反应物的移动，当加热第二连接垫时，涂层熔化，等温扩增反应物重新向侧方移动，从而可以防止样品中的未反应遗传物质的丢失。

用于加热的加热垫141可以配置在所述第二连接垫下部。因此，当在等温扩增结束时施加附加缓冲液时，从反应垫等温扩增的结果容易地移动到检测垫。所述加热可以以60至80℃进行1分钟至5分钟，优选为2分钟。

检测垫

检测垫160与第二连接垫部分地接触，可以配置在第二连接垫的下部和侧方。能够与检测物结合的受体固定在检测垫160。所述受体可以是能够特异性结合在检测物的抗体、蛋白质或其片段。

所述检测垫包括多个检测区域，所述检测区域可以分为线或孔的形式。每个受体独立地固定在每个检测区域，例如，在用聚邻苯二酸二烯丙酯成分的墨冲压以创建检测区域后，再次用包含受体的墨冲压或者将包含受体的溶液施加于孔，并可以应用1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺(EDC，1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS，N-hydroxysulfosuccinimide)。在一个反应垫形成数十到数百个以上的检测区域，可以应用单个样品来检测与形成的检测区域相同数量的靶核酸。图5用于详细说明形成在反应垫的检测区域161的结构，并不用于限定数量。

所述检测垫为硝酸纤维素，可以具有0.001μm至0.005μm，优选为0.005μm的气孔尺寸，使得样品侧向移动到吸收垫。

加热垫

加热垫141可以配置在所述样品垫、引发垫、反应垫和第二连接垫的下部。所述加热垫为具有导热性的金属板，可以由铁、不锈钢、铝、银、铜等材料制成。所述加热垫可以通过加热丝连接，每个加热丝独立地连接到所述样品垫、反应垫和第二连接垫下部的加热垫，以控制加热的垫。

所述样品垫、第一连接垫、引发垫、反应垫、第二连接垫、检测垫和吸收垫可以在上下端具有壳体110，使得样品或缓冲液不会丢失，整个结构物可以被能定义为壳体的支撑体或无孔材料的外壳包裹。

所述吸收垫170通过吸收样品和缓冲液等来阻挡逆流，并有助于诱导侧向流动性。吸收垫为多孔材料，可以是棉、绒布、纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维、聚砜、聚丙烯酸、聚腈、聚哌嗪、聚酰胺、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚乙烯亚胺、聚二甲基硅氧烷或其混合物。所述吸收垫优选为玻璃纤维，具有0.1至0.5μm的气孔尺寸。

所述样品垫、第一连接垫、反应垫、第二连接垫、检测垫和吸收垫依次部分地接触并沿侧向配置，并且缓冲垫、引发垫、反应垫、第二连接垫、检测垫和吸收垫依次部分地接触并沿侧向配置。具体而言，样品垫和第一连接垫、缓冲垫和引发垫以反应垫为基准分开，并配置在反应垫的一侧面，第二连接垫、检测垫和吸收垫接着依次配置在反应垫的另一侧面。

本发明的结构物可以根据结构物的每个构成要素的配置和特性，可以通过在样品达到吸收垫的期间过滤除了核酸物质以外的细胞溶解物来纯化核酸物质，可以实现侧向流动性，其中样品的移动方向为与地面平行的方向。在细胞中，核酸以结合组蛋白、聚合酶、核酸酶、转录因子等的蛋白质的形式存在。很多蛋白质由于如细胞溶解组合物的表面活性剂而丢失与核酸的结合，但当通过额外添加的蒸馏水或附加缓冲液达到反应垫时，使得细胞溶解物移动到反应垫，表面活性剂被稀释，从而外部环境可恢复蛋白质的电荷。在这种情况下，蛋白质再次与核酸物质结合，从而可以减少与聚合酶的接触面积或干扰扩增反应。因此，优选地，能够与核酸结合的大部分的细胞构成要素从反应垫中纯化并去除。

以下，对通过使用所述核酸检测用结构物来检测核酸的方法进行说明。

可包括待检测核酸的样品在施加于样品垫之前与细胞溶解用缓冲液混合的步骤。当与细胞溶解用缓冲液混合时，由于可以溶出细胞中存在的核酸物质，从而可以增加样品中可检测的核酸物质的量。

可以将与5mM至80mM的Tris-HCl、5mM至50mM的氯化钾、1mM至30mM的硫酸镁、5mM至50mM的硫酸铵、0.01mg/ml至0.1mg/ml的蛋白质分解酵素、0.01w/w％至0.2w/w％的曲拉通X-100或吐温20、pH8.0至9.0的细胞溶解用缓冲液混合的细胞溶解物滴加到样品垫，通过操作用于加热所述样品垫的样品垫下方的加热垫来提高样品的溶解效率。通过在60至80℃的温度加热处理2分钟加热垫，从而促进包含病毒和上皮细胞的样品在样品垫的溶解。

另外，可以将缓冲液添加到缓冲垫。所述缓冲液起到使核酸物质能够移动到反应垫的同时纯化核酸物质的作用。所述缓冲液起到使核酸物质能够移动到转化垫的同时纯化核酸物质的作用。由于所述缓冲液含有适当量的缓冲成分，因此可以预防添加蒸馏水时可能发生的突然的盐度或pH变化引起的蛋白质或核酸物质的沉淀现象。本发明的核酸检测用结构物的每个垫由具有小的气孔的多孔材料制成，使得核酸向侧方移动的同时可以纯化。因此，如果蛋白质或核酸物质复合或聚集而堵塞气孔，则样品的移动速度可能会降低，并且核酸物质的收率可能会降低。

例如，所述附加缓冲液可以是包含5mM至80mM的Tris-HCl、20mM至70mM的氯化钾、0.5mM至5mM的硫酸镁、1mM至30mM的硫酸铵和0.01w/w％至0.2w/w％的吐温

为了使所述核酸扩增反应顺利进行，将反应垫下部的加热垫加热到60至65℃，保持温度的同时静置20分钟至1小时，优选为20分钟至30分钟。

可以使用所述多核酸检测用结构物诊断的疾病是特定基因为原因或可以用作疾病的指标的疾病，例如，肥胖、高血压、糖尿等代谢疾病、遗传疾病、癌症等，病毒或菌与传染病相关，可引起菌感染的菌包括但不限于细菌、原虫、寄生虫、真菌等。

发明效果

当使用本发明的核酸提取和扩增方法时，即使不单独进行样品的预处理(preparation)、核酸扩增反应(reaction)和检测(detection)，可以通过应用单个样品来一次性进行检测。由于不单独进行每个步骤，整个过程被简化，因此不需要多种样品或装置，即使是非相关技术人员也可以容易地执行。

另外，由于不需要用于进行每个步骤的复杂的装置，因此不受场所的限制，具有易于分布的优点，并且由于可以应用单个样品进行多个核酸检测，因此经济实惠。

附图说明

图1是本发明的多核酸检测用结构物的整体结构的示例。

图2是示意性地示出在检测垫160获得靶核酸的原理的图。

图3是本发明的多核酸检测用结构物的一部分的侧面结构图。

图4是本发明的多核酸检测用结构物的一部分的立体图。

图5是放大检测垫160的结构的结构图。

图6是示出用外壳包裹的本发明的多核酸检测用结构物的外观的示例。

图7是示出从血液样品检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的结果的示例。

附图标记说明

110：壳体

120：样品垫

121：缓冲垫

131：第一连接垫

132：引发垫

140：反应垫

141：加热垫

142：阻挡垫

150：第二连接垫

160：检测垫

170：吸收垫

161：检测区域。

具体实施方式

以下，将基于以下实施例更详细地对本发明进行说明，但这些仅用于说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的任何限制。

制备例1.纸上实验室核酸检测用结构物的制备

为了制备本发明的纸上实验室核酸检测用结构物，准备了0.5μm的聚砜作为样品垫120和缓冲垫121，0.01μm的纤维素作为第一连接垫131或引发垫132，0.005μm的醋酸纤维素作为反应垫140，0.05μm的纤维素作为第二连接垫150，0.005μm的硝酸纤维素作为检测垫160和0.5μm的玻璃纤维材料作为吸收垫170。

反应垫140通过重叠醋酸纤维素膜制成垫，将其浸入包含45mM的蔗糖、0.005w/w％的曲拉通X-100和0.2w/w％的甘油的溶液后，并将其干燥。然后，用细钻形成孔，并在所述孔的底部形成包含引物组的水凝胶层。为了形成所述水凝胶层，首先基于水凝胶溶液总体积，混合20％v/v的可紫外光交联的聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA，Sigma-Aldrich，MW700)、40％v/v的聚(乙二醇)(PEG，Sigma-Aldrich，MW600)和5％v/v的光引发剂2-羟基-2-甲基苯丙酮(Sigma-Aldrich)和35％的缓冲剂(PBS缓冲液，pH7.5)，并且通过在此混合每个引物组来制备水凝胶溶液。优选包含所述聚(乙二醇)以增加水凝胶微粒的孔隙率。然后，将所述水凝胶溶液涂布在反应垫的每个孔内表面，并在紫外线下暴露1分钟(360nm波长，35mJ/cm

然后，在反应垫140的表面涂布含有dNTP(1.4mM，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、等温扩增缓冲剂(1X，20mM的Tris-HCl，10mM的(NH

固定在第二连接垫150的金纳米颗粒为胶体颗粒，如下制备。当0.1％的HAuCl

第二连接垫150如下制备。具体而言，重叠多层纤维素膜并切断，渗入由0.4M的Tris(pH 6.5)、0.2％的吐温-20、1％的酪蛋白酸钠、0.1％的叠氮化钠(sodium azide)和0.05％的Proclin 300制备的溶液并润湿。在与所述溶液相同组成的溶液透析并准备所制备的金缩合体。然后，用所透析的金缩合体处理所述纤维素膜并干燥以完成第二连接垫150。

检测垫160通过用聚邻苯二酸二烯丙酯油墨冲压检测区域来指定，并在其上再次用含有可结合在FAM、HEX和Cy5等的荧光标记物的抗体的溶液冲压后，应用NHS溶液并反应以固定抗体。

所述第二连接垫150在与反应垫接触的部分用5％的低熔点琼脂糖(Lonza，NuSieve GTG Agarose)溶液涂覆。

然后，如图3所示配置每个结构物的构成要素，所述样品垫120、引发垫132、反应垫140和第二连接垫150的下端配置有用加热垫141连接加热丝的铜板，在反应垫的上部配置聚丙烯酸膜作为阻挡垫142。

实验例1.使用血液样品的病毒检测

通过使用本发明的纸上实验室核酸检测用结构物来从血液样品提取核酸，并将其扩增来测量荧光，从而可以容易地测量是否感染如SARS-CoV-2的病毒。

为了检测SARS-CoV-2，可以使用能够选择性地结合SARS-CoV-2的特定N蛋白基因或Rdrp基因的引物组。当使用这种引物组时，每个组的正向引物和反向引物中的任一种引物是例如结合FAM、HEX或Cy5的形式，另一种引物与生物素结合。当样品中存在所述引物组可特异性结合的靶核酸时，在反应垫140扩增，结合在通过第二连接垫150的同时扩增的核酸的生物素与金纳米颗粒的链霉亲和素特异性结合。通过侧向流动与金纳米颗粒结合的扩增的核酸移动到检测垫160，结合在扩增的核酸的另一侧的检测物与受体结合的同时，将检测垫的检测区域的颜色改变成粉色，所述受体可以与固定在所述检测垫160的FAM、HEX或Cy5特异性结合。

将靶核酸结合在检测垫的原理示意性地示出于图2中。

为了提高可靠性，在检测垫形成额外的检测区域后，可以通过引入选择性结合在与SARS-CoV-2交叉检测可能性高的病毒的特定基因的引物组，来一起检测作为阴性对照。

实验例2.使用血液样品的核酸提取和扩增

(1)实验样品和纸芯片的准备

通过使用本发明的纸上实验室核酸检测用结构物来从血液样品提取核酸并将其扩增来确认是否可以显示荧光。

首先，从Innovative research公司(IWB1K2E10ML，USA)购买并准备人血作为全血，作为阳性对照的18S rRNA的引物购自Tocris(#7325，USA)。通过数据表确认使用的全血没有感染任何病毒或细菌。通过将1ul的0.1pg/ul由siTOOLs Biotech公司制造的SARS-CoV-2阳性对照混合到100ul的所述人血来制备一个实验样品。

用于检测混合到血液的SARS-CoV-2的引物组如下表1所示。

[表1]

※F3：正向引物；B3：反向引物；FIP：正向内引物；BIP：反向内引物；FL：正向环引物；BL：反向环引物

在每个所述引物组中，将检测物结合在F3引物的5'末端，将生物素结合在B3引物的5'末端。作为阳性对照的人18s RNA(A)引入FAM作为检测物，并且N基因(B)引入Cy5作为检测物。

(2)样品的核酸检测

分别取50ul的所述实验样品和不混合SARS-CoV-2的阴性对照样品，添加50ul的细胞溶解用缓冲液(20mM的Tris·HCl(pH 8.8)、15mM的MgSO

其结果，如图7所示，在实验样品和阴性对照中都确认到阳性对照(A)条带，从而确认结构物正常操作，在实验样品检测到SARS-CoV-2(B)，而在阴性对照样品中仅观察到阳性对照(A)，从而确认能够通过使用本发明的系统来诊断是否感染多种疾病、病毒或菌。