基于纳米金的适配体比色传感检测马拉硫磷的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种马拉硫磷的纳米金适配体比色传感检测方法及试剂盒。

背景技术

马拉硫磷是高效低毒杀虫、杀螨剂，防治范围广。不仅用于稻、麦、棉，而且因毒性低、残效短，也用于蔬菜、果树、茶叶以及仓库的防虫。马拉硫磷毒性较低，但是长期不合理的使用会导致食品及生态环境中马拉硫磷残留量超标，经食物链的富集进入人体内，通过抑制体内乙酰胆碱酯酶的活性，造成人和动物的肝脏以及中枢神经系统受损，严重的可导致中毒死亡。长时间暴露于含马拉硫磷的环境中也可能引发多种并发症。

目前检测马拉硫磷的方法有液相色谱法、气相色谱法、质谱法和毛细管电泳法、基于抗原抗体反应的免疫学方法等，这些方法可以获得准确和灵敏的结果，但是需要繁琐的样品预处理和专业的人员。此外，昂贵复杂的仪器也限制了这些方法在快速检测中的应用。金纳米粒子（AuNPs）具有特殊的光学特性，在最大吸收波长处具有局部表面等离子体共振（LSPR）效应，因此在电解质溶液（高浓度NaCl）中能引起相应颜色变化，颜色的变化程度与添加靶标的浓度呈正相关。通过表征AuNPs体系颜色变化，可实现对马拉硫磷的快速半定量检测。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供基于纳米金的适配体比色传感检测马拉硫磷的方法，目的二在于提供一种试剂盒，目的三在于提供所述试剂盒在马拉硫磷检测中的应用。本发明方法操作简便，向纳米金溶液中加入马拉硫磷适配体溶液，然后加入待测样品溶液，最后加入氯化钠溶液，通过溶液颜色变化可实现马拉硫磷的半定量检测，同时也可根据吸光度比值进行准确定量检测。基于该方法的试剂盒可应用于现场快速筛查马拉硫磷，检测结果灵敏度高、检测限低，并且现象直观，降低了检测成本，提高了检测的效率，具有良好的实际应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

第一方面，基于纳米金的适配体比色传感检测马拉硫磷的方法，包括如下步骤：

（1）向纳米金溶液中加入马拉硫磷适配体溶液，进行孵育，然后分别加入不同浓度的马拉硫磷标准品溶液，进行孵育，最后加入氯化钠溶液进行孵育，观察溶液颜色变化；用紫外分光光度计测定518nm和620nm处两个紫外吸收峰处的吸光度，以马拉硫磷浓度为横坐标，以对应的紫外吸收峰吸光度比值A

所述马拉硫磷适配体序列如SEQ ID NO：01所示；

所述马拉硫磷适配体溶液的浓度为1~5μmol/L，所述马拉硫磷适配体溶液与纳米金溶液的孵育时间为8~12min；所述氯化钠溶液的浓度为500~1000mmol/L；

（2）将待测的样品粉碎，用Tris-HCl缓冲溶液与其混合，然后离心取上清液，再使用0.22 μm的微孔滤膜过滤上清液，得待检样品溶液；

（3）按照步骤（1）的方式，将马拉硫磷溶液替换为待检样品溶液，观察溶液颜色的变化，得到待测样品的半定量检测结果；

（4）测定并计算待检样品溶液的A

步骤（1）中，纳米金溶液中，金纳米粒子的粒径为10 nm，金纳米粒子的浓度为8.1×10

在本发明的某一具体实施方式中，公开了一种纳米金溶液的制备方法，制备过程如下：

在搅拌下将1 mL 1%的HAuCl

步骤（1）中，添加的马拉硫磷适配体溶液的浓度为1μmol/L。

步骤（1）中，加入氯化钠的浓度为500 mmol/L。

步骤（1）中，每次孵育时，均在室温下孵育10 min。

步骤（3）中，将待测的样品粉碎，取5.0 g样本并加工成均质的匀浆，加入20 mL浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液与其混合，然后置于振荡器上剧烈振荡10 min，之后室温下8000 r/min离心20 min，以除去固体物质；然后使用0.22 μm的微孔滤膜过滤上清液，将过滤后的上清液作为待测液。

步骤（3）中，当观察到溶液颜色由红色变为蓝色，则表示样品中含有马拉硫磷。

第二方面，一种检测马拉硫磷的试剂盒，包含试剂1、试剂2、试剂3和试剂4，所述试剂1为纳米金溶液，所述试剂2为马拉硫磷适配体溶液，所述试剂3为氯化钠溶液，所述试剂4为Tris-HCl缓冲溶液；

所述纳米金溶液中金纳米粒子的粒径为10 nm，浓度为8.1×10

所述马拉硫磷适配体序列如SEQ ID NO：01所示；

所述马拉硫磷适配体溶液的浓度为1~5μmol/L，所述氯化钠溶液的浓度为500~1000mmol/L；

优选地，所述试剂盒还包含连排比色皿、用于观察结果的黑色背景板、比色卡和0.22 μm的微孔滤膜；所述连排比色皿是将多个比色皿排列连接而成，所述连排比色皿的其中一个侧面为白色，其余侧面均透明。

第三方面，上述试剂盒在马拉硫磷检测方面的应用。

本发明方法的原理为：马拉硫磷适配体作为单链寡核苷酸分子，能够通过静电吸附作用与金纳米粒子高效结合，加入NaCl溶液后，可以保护AuNPs不发生聚集，溶液颜色不发生变化，为红色。当待测物中存在靶标时，适配体优先与靶标结合，适配体脱离AuNPs，加NaCl后导致AuNPs聚集，发生明显的表面等离子体共振偏移，溶液颜色由红色变成蓝色；当待测物中没有靶标时，适配体吸附在AuNPs上，加NaCl后不发生聚集，为红色。在检测过程中，当样品中含有马拉硫磷时，肉眼可以看出这一过程中溶液颜色的变化，通过此体系的颜色变化可以直观可视化的实现半定量检测，此外通过紫外分光光度计测定吸光度可以实现准确定量检测。本发明方法具有一定的可推广性，对于其他的有机磷农药，可以采用相同的思路替换成相应的适配体进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 本发明提供一种检测马拉硫磷的试剂盒，包含4种检测试剂，试剂1：纳米金溶液；试剂2：适配体溶液；试剂3：氯化钠溶液；试剂4：Tris-HCl缓冲溶液。以及0.22 μm微孔滤膜，此外还有连排比色皿，其容积约为300 μL，7个连在一起，其中一面为白色背景，其余均为透明面，另外还附有用作观察结果的黑色背景板，这样在进行检测时，可以忽略背景的干扰，使得检测结果更易被肉眼识别，与标准比色卡对比，可使检测结果更加准确。此外，检测结果也可以使用紫外分光光度计进行准确定量检测。

2. 本发明方法简单、快速、现象直观，无需对检测的样品进行复杂的前处理，不需要专业的仪器操作人员，降低了检测成本，提高了检测的效率，可应用于马拉硫磷的现场快速检测分析。

3. 本发明与传统的仪器方法相比，成本低、时间短、操作简单，解决了传统仪器检测方法设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品筛选的问题。

4. 本发明能够简单、快速的得到检测结果，操作简单，具有较高的稳定性和重现性，选取合成成本低、稳定性高、易于修饰等优点的核酸适配体作为主要的识别元件，提升了方法的灵敏度和特异性。

5. 本发明方法为其他有机磷农药的检测提供了一种新的思路，可以实现其他有机磷农药的检测。

附图说明

图1是AuNPs-适配体比色传感法原理图；

图2是AuNPs的紫外表征图；

图3是AuNPs分散状态下的的透射电镜表征图；

图4是AuNPs聚集状态下的的透射电镜表征图；

图5是NaCl的浓度优化结果图；其中，1-8加入的NaCl溶液浓度分别为50、200、350、500、650、800、950 mmol/L；

图6是不同NaCl浓度下A

图7是不同适配体浓度下A

图8是AuNPs与NaCl不同反应时间下A

图9是AuNPs与适配体不同反应时间下A

图10是不同马拉硫磷浓度下A

图11是本发明方法的特异性鉴定结果图；

图12是本发明方法和国标法的加标回收结果对比图。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

若为特别提及，下述实施例中所用试剂均为常规市售试剂，所述方法均为常规技术操作。

实施例

（1）制备金纳米粒子AuNPs

将锥形瓶和磁子用王水浸泡24 h，然后用超纯水清洗干净并烘干，在搅拌下将1mL浓度为1%的HAuCl

金纳米粒子的粒径为10 nm，金纳米粒子的浓度为8.1×10

制备的AuNPs为颜色鲜艳的酒红色胶体溶液，紫外表征发现其特征吸收峰在518nm处，峰形较为尖锐（图2），这表明制备的AuNPs粒径均一，具有较好的性能。用透射电镜对制备的AuNPs的外观形貌进行表征（图3和图4），可以看出AuNPs呈现统一的圆球形，粒径较为均一，约为10 nm。正常情况下为分散状态（图3），而在加入NaCl溶液后会发生聚集（图4）。综上所述，本研究合成的AuNPs在水中呈现胶体状，具有均有的大小和形状，分散性良好，性质稳定。

（2）纳米金适配体比色法检测马拉硫磷

用1×TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，PH 8.0）配制1 μmol/L马拉硫磷适配体溶液，然后将30 μL适配体溶液和150 μL AuNPs充分混匀，孵育10 min，加入30 μL马拉硫磷标准品溶液混匀，孵育10 min，再加入30 μL浓度为500 mmol/L的NaCl溶液充分混匀，反应10 min，裸眼观察溶液的颜色变化，并用UV-2600紫外可见分光光度计扫描350-750 nm的紫外吸收光谱，记录峰值变化，配制不同浓度的马拉硫磷标准溶液（50、100、200、400、600、800、1000 ng/mL），用于绘制标准曲线，所有测定均在室温下进行。

马拉硫磷适配体序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如SEQ IDNO：01所示，具体如下：5’-TGT ACC GTC TGA GCG ATT CGT ACT ATG GTATCC GAG AGGCCTACG GAA TTG TTG TAC AGC CAG TCA GTG TTA AGG AGT GC-3’。

（3）优化NaCl浓度

AuNPs会在高盐环境下发生聚集，随着NaCl浓度的增加，AuNPs的聚集程度也随之增加，AuNPs的颜色发生明显变化，由酒红色逐渐变为蓝紫色。当NaCl的浓度过大时，在没有靶标的情况下AuNPs也可能发生聚集；当NaCl的浓度过小时，AuNPs可能只发生部分聚集从而影响试验的结果，因此本研究对NaCl的浓度进行优化。在AuNPs的最佳反应体积下（150 μL），用超纯水代替适配体和靶标，然后加入30 μL不同浓度（50、200、350、500、650、800、950mmol/L）的NaCl溶液，充分混匀，静置10 min后观察溶液的颜色并使用紫外分光光度计进行吸光度值的测定。

结果如图5所示，当NaCl浓度低于500 mmol/L时，AuNPs呈红色，表明此时的NaCl浓度较低，无法使AuNPs发生聚集；当NaCl浓度为500 mmol/L时，AuNPs发生聚集，颜色由红色变为蓝色。之后随着NaCl浓度的继续增加，AuNPs的颜色不再发生明显变化。但是单以颜色变化不能够准确判定出AuNPs是否已经完成聚集，需要根据紫外吸收光谱的变化来进行判定。由图5可以看出，随着NaCl浓度的增加，AuNPs在518 nm处的吸收峰值逐渐变小，并且在620 nm处出现了一个新的特征吸收峰，这是因为AuNPs发生聚集导致等离子发生了共振变化，使得AuNPs的特征吸收峰向右发生了偏移。因此，需要根据A

（4）优化马拉硫磷适配体浓度

取150μL AuNPs溶液于连排比色皿中，分别加入30 μL各种浓度的马拉硫磷适配体溶液，适配体浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5 μmol/L。室温下孵育10 min，随后，在每个比色皿中加入30 μL浓度为500 mM的NaCl溶液，室温下孵育10 min，首先观察溶液颜色变化，然后在测定吸光度值。

当AuNPs溶液中不存在适配体时，AuNPs在高盐环境下会发生聚集，AuNPs由红色变为蓝紫色；当加入的适配体浓度较低时，通过静电吸附作用，低浓度的适配体可以吸附在AuNPs表面，但因为浓度较低，不能够将AuNPs的表面完全包裹，仍然有一部分AuNPs呈单一分散状态，此时AuNPs溶液会由蓝色变为蓝紫色；当适配体浓度为1 μmol/L时，适配体可以保护AuNPs不发生聚集现象，此时AuNPs溶液呈现酒红色，之后随着适配体浓度的继续增加，不再发生明显变化。如图7所示，当适配体浓度为1 μmol/L时，A

（4）反应时间的优化

AuNPs在高浓度NaCl溶液中的聚集需要一定时间，在达到稳定状态之前，颜色会不断发生变化，与之相应的A

如图9所示，随着AuNPs与适配体孵育时间的增加，A

（5）灵敏性分析

在最佳的实验条件下，150μL AuNPs溶液，加入30μL 1μM马拉硫磷适配体溶液。室温下孵育10min。在每个孔中加入30μL 50-1500 ng/mL马拉硫磷溶液，孵育10min。再加入30μL 500mM NaCl溶液，孵育10min，观察溶液颜色变化，测定620nm和518nm的紫外吸收值，然后得到A

为减弱基质效应影响，采用与实际样品相同的加标条件绘制了基质标准曲线。如图10所示，随着马拉硫磷浓度升高，溶液颜色逐渐由红变蓝，在马拉硫磷浓度范围为50-1500 ng/mL时，A

（6）特异性验证

配制800 ng/mL的马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷溶液，按照AuNPs-适配体比色传感法检测马拉硫磷的步骤，分别进行适配体的特异性鉴定，并取等体积的缓冲液作为阴性对照。

选择马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷考察方法的特异性，结果如图11所示，在体系中加入800 ng/mL的马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷，除马拉硫磷外，加入其他农药时A

（7）实际样品鉴定

粉碎并称取5.0 g具有代表性的果蔬样本并加工成均质的匀浆，加入20 mL浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液与其混合，然后置于振荡器上剧烈振荡10 min，之后室温下8000r/min离心20 min，以除去固体物质。然后使用0.22 μm的微孔滤膜过滤上清液，将过滤后的上清液作为提取液。将马拉硫磷标准品添加到提取液中，制成不同浓度（200、400和800 ng/mL）的加标检测液。

为了验证建立的AuNPs-适配体比色传感法的准确性和可靠性，采用本方法对生菜和苹果样品进行了检测。从本地超市购得生菜和苹果样品中未检出马拉硫磷。使用本方法进行检测，每个样品重复测定三次。结果如表1所示，基于AuNPs-适配体的比色传感法检测马拉硫磷的加标回收率范围分别为98.24%-100.91%和99.48%-101.29%，相对标准偏差分别为0.2-2.2和0.2-2.8。上述结果表明，基于适配体建立的AuNPs-适配体比色传感法具有良好的准确性和可靠性。本方法可用于生菜和苹果中马拉硫磷的快速筛查和现场检测。

表1 马拉硫磷在生菜和苹果中的加标回收结果（本方法）。

参照国家标准方法（GB23200.113—2018），利用气相色谱-质谱联用法对加标样品进行检测，条件如下：色谱柱温度40 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min程序升温至120 ℃，再以5 ℃/min升温至240 ℃，再以12 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min，进样量为1 μL，流速为1.0 mL/min。方法验证的结果如表2所示，将本方法的检测结果与国标法的结果进行对比（图12），结果显示两者的准确度一致，生菜样品和苹果样品的R

表2 马拉硫磷在生菜和苹果中的加标回收结果（国标法）。

本研究以AuNPs为指示剂，马拉硫磷适配体作为识别元件，建立了AuNPs-适配体比色传感法。通过优化溶液浓度，最后得到NaCl最适浓度为500 mmol/L，适配体浓度为1 μmol/L。通过优化孵育时间，最终得到的NaCl与AuNPs最佳反应时间为10 min，马拉硫磷适配体与AuNPs最佳反应时间为10 min。本方法在马拉硫磷浓度为50-1500 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数R²=0.994，根据计算得到本方法的最低检出限为45.54 ng/mL，目测检测限为400 ng/mL。本方法简单快速，易于进行定性和定量分析，具有优异的灵敏性、特异性和准确性。经验证，该方法在实际加标样品中的检测结果与国标法的检测结果高度一致，是一种可行的快速检测食品中马拉硫磷残留的高效方法，可为其他农药的现场快速筛查方法研究提供参考。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。