精油作为菌丝体和蘑菇的生物刺激剂的用途

本发明涉及精油作为生物刺激剂在菌丝体生产和蘑菇栽培中的用途。更具体地，本发明涉及使用特定的萜烯或主要由所述特定的萜烯组成的精油在刺激菌丝体和食用蘑菇的发育和生长中的用途。

食用蘑菇主要因其食用品质或药用价值而长期以来供人类使用。蘑菇的品种很多，但世界上栽培最多的是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、侧耳(平菇(Pleurotusostreaus)、杏孢菇(Pleurotus eryngii)等)和香菇(Lentinula edodes)。仅双孢蘑菇就占全球市场的40％以上，平菇占25％，香菇占15％。全球规模市场的主要参与者是中国(产量50％)、美国和欧洲。

工业规模的蘑菇生产方法可以分为两个步骤：第一步骤涉及获得菌丝体接种物，第二步骤涉及利用第一步骤过程中获得的菌丝体进行蘑菇的实际栽培。这两个步骤可以由不同的参与者独立执行，第一个参与者是菌丝体生产者，第二个参与者是蘑菇种植者，或者由唯一的同一个参与者，即蘑菇种植者执行。

菌丝体接种物的获得始于利用孢子或接种物块对经灭菌的培养基接种。培养基可以是琼脂，如马铃薯葡萄糖琼脂(PDA、Potato Dextrose Agar)、液体培养基，如马铃薯葡萄糖肉汤(PDB、Potato Dextrose Broth)、或任何其他含有或不含胶凝剂的营养液。菌丝体在其培养基上的发育和生长是可变的，但通常持续7到28天之间，这取决于蘑菇的菌株。一旦菌丝体完全定植到培养基中，则取一块培养基进行定植基质的接种。适当的定植基质可以是合成的，或者最常见的是由谷物组成，通常为黑麦、黍米、高粱、小麦、大麦、大米或燕麦，事先经过灭菌并包装在培养罐或培养袋中。

然后将由此获得的菌丝体接种物用于蘑菇的栽培和生产。因此，接种物用于对出菇基质接种。

双孢蘑菇的情况下，出菇基质通常是由稻草和动物粪便组成的堆肥，对其大量浇水以确保在两到三周成熟。然后对出菇基质巴氏杀菌数天，其中温度从60至降至40℃。出菇基质经巴氏杀菌后，通过将其定植基质中所含的接种物与出菇基质混合，利用例如猪油对出菇基质进行接种。接下来是孵育期，在此期间，经接种的出菇基质被放置在密闭房间内，在两周期间对房间内的在温度、湿度和氧气进行控制。温度保持在22至25℃。下一步骤是覆土，包括用适当的土壤层覆盖出菇基质。例如，覆土的土壤是粉碎并消毒的砂质白垩和园艺泥炭的混合物。温度受控下降后，第一批蘑菇头从出菇基质中冒出，然后可以开始采收并持续两到三周。

因此，获得接种物和生产蘑菇的这些方法需要持续数周，这主要是因为不同菌丝体的菌株在其基质中定植所需的时间。另外菌丝体的发育和生长也会受到各种因素的干扰，例如栽培条件参数的变化。因此，菌丝体的生长速度可能成为限制因素，该限制因素延长生产者生产接种物所需的时间和/或延长蘑菇种植者采收蘑菇所需的时间。因此，整个蘑菇生产链都会受到影响。

生物刺激剂在农业生产方法中的使用正在迅速发展中。生物刺激剂是能够刺激植物或蘑菇的新陈代谢及其营养吸收的自然过程的物质。更具体地，欧洲议会和理事会于2019年6月5日颁发并于2022年7月22日生效的2019/1009号条例(EU)将生物刺激剂定义为“一种刺激植物营养摄入过程的产品，其独立于其所含的营养元素，目的是改善植物或其根际的以下一个或多个特征：

a)营养元素的利用效率

b)对非生物应激的耐受性

c)定性特征

d)土壤或根际中所含的营养元素的利用度。

因此，本发明的目的是确定和提出在生产菌丝体接种物的方法中和利用菌丝体接种物栽培蘑菇的方法中的有效生物刺激剂。特别地，根据本发明的生物刺激剂应允许缩短菌丝体接种物的生产时间和蘑菇的栽培时间，或者至少是避免这些时间的延长。最后，根据本发明的生物刺激剂应该可用于常规的接种物生产和蘑菇生产的方法。

为此，本发明涉及至少一种β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯化学型精油，或它们的其中一种混合物在刺激菌丝体或蘑菇的发育和生长中的用途。

众所周知，精油的化学型(或chimiotype)表明精油的化学成分的主要组分。该成分的含量通常大于其化学分析时使用的总体积的20％。

作为使用根据本发明选定的精油的可替代方式，可以从精油的化学成分中提取一种或多种生物刺激剂化合物并使用。

因此，本发明还涉及至少一种萜烯用于刺激菌丝体或蘑菇的发育和生长的用途，所述萜烯选自β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯或它们的其中一种混合物。

申请人公司发现，某些萜烯或主要由它们组成的精油，对菌丝体和蘑菇的发育和生长具有惊人的生物刺激能力，特别是当它们被添加到菌丝体和蘑菇的培养基或基质中时，并因此可用于获得接种物或蘑菇培养物的过程和方法中。

天然生物刺激剂的用途是蘑菇生产中真正的创新。使用具有生物刺激剂作用的产品对菌丝体和蘑菇的产生有重大影响。接种物生产者的主要局限性在于其快速生产、储存菌丝体并将菌丝体分销售给蘑菇生产商的能力。使用根据本发明的生物刺激剂的允许缩短生产开始和分销之间的时间，从而提高生产者的生产能力。同样地，在蘑菇生产阶段中，向培养基质中添加生物刺激剂可以提高菌丝体在基质上的定植速度，并因此开始出菇并更快地促进蘑菇采收，从而提高蘑菇种植者的产量。生物刺激剂的添加可以在接种的各阶段执行，直到出菇。

因此，在对堆肥进行测试的过程中，可观察到，用根据本发明选定的化合物和精油刺激的菌丝体的栽培产率提高，每个蘑菇平均质量增加，并且通常采收的蘑菇质量提高。

在本发明的背景下选定的化合物和精油具有在大浓度范围内表现出强烈生物刺激剂作用的特点，因此在过量的情况下没有抑制作用的风险。

选定的化合物和精油也可以互换，例如在其中一种短缺的情况下。

在某些情况下，选定的化合物和精油也可以进行组合，从而获得协同效应和增强的弹性。

选定的化合物和精油也允许在比正常条件更为不利的条件下对菌丝体和蘑菇的生长产生影响，例如在孵育温度降低1或2℃或存在老化作用的条件下。

根据本发明的实施例，所述精油选自西黄松(Pinus ponderosa)精油、矮赤松(Pinus mugo)精油、花旗松(Pseudotsuga menziesii)精油、香脂冷杉(Abies balsamea)精油、欧洲冷杉(Abies alba)精油、白云杉(Picea glauca)精油、欧白芷(Angelicaarchangelica)精油和白松香(Ferula gummosa)精油。

根据本发明的实施例，菌丝体或蘑菇选自担子菌，特别是双孢蘑菇、侧耳和香菇，更具体地是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、平菇(Pleurotus ostreaus)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)和香菇(Lentinula edodes)。

当菌丝体或蘑菇是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)时，所使用的精油优选地是β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯化学型，优选β-蒎烯。作为使用精油的可替代方式，所使用的萜烯优选地是β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯。

特别是，当菌丝体或蘑菇是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)时，所使用的精油优选地选自西黄松(Pinus ponderosa)精油、矮赤松(Pinus mugo)精油、花旗松(Pseudotsugamenziesii)精油、香脂冷杉(Abies balsamea)精油、欧洲冷杉(Abies alba)精油、白云杉精油(Picea glauca)精油、欧白芷(Angelica archangelica)精油和白松香(Ferulagummosa)精油。

当菌丝体或蘑菇是平菇(APleurotus ostreaus)时，所使用的精油优选地是β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯化学型，优选β-蒎烯。作为使用精油的可替代方式，所使用的萜烯优选地是β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯。

特别是，当菌丝体或蘑菇是平菇(APleurotus ostreaus)时，所使用的精油优选地选自西黄松(Pinus ponderosa)精油、矮赤松(Pinus mugo)精油、花旗松(Pseudotsugamenziesii)精油、香脂冷杉(Abies balsamea)精油、欧洲冷杉(Abies alba)精油、白云杉(Picea glauca)精油、欧白芷(Angelica archangelica)精油和白松香(Ferula gummosa)精油。

当菌丝体或蘑菇是杏鲍菇(Pleurotus eryngii)时，所使用的精油优选地是β-蒎烯或β-水芹烯化学型，优选β-水芹烯。作为使用精油的可替代方式，所使用的萜烯优选地是β-蒎烯或β-水芹烯。

特别是，当菌丝体或蘑菇为杏鲍菇(Pleurotus eryngii)时，所使用的精油优选地选自欧白芷(Angelica archangelica)精油和白松香(Ferula gummosa)精油。

当菌丝体或蘑菇是香菇(Lentinula edodes)时，所使用的精油优选地是β-蒎烯。作为使用精油的可替代方式，所使用的萜烯优选地是β-蒎烯。

特别是，当菌丝体或蘑菇是香菇(Lentinula edodes)时，所使用的精油优选地选自花旗松(Pseudotsuga menziesii)精油、香脂冷杉(Abies balsamea)精油、欧洲冷杉(Abies alba)精油、白云杉(Picea glauca)精油和白松香(Ferula gummosa)精油。

本发明还涉及一种生物刺激菌丝体或蘑菇的发育和生长的组合物，其特征在于，该组合物包括：

液体溶液，

至少一种萜烯，选自δ-3-蒈烯和β-水芹烯，或至少一种β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯化学型精油，或它们的其中一种混合物，

至少一种表面活性剂，能够将萜烯或精油溶解在液体溶液中。

根据液体溶液的水性或其他性质，本领域技术人员将能够从已知的表面活性剂中选择能够将萜烯或精油溶解在液体溶液中的那些。

优选地，萜烯或精油与表面活性剂的比为1。

有利地，根据本发明的组合物由至少50％的萜烯和50％的黑色皂液构成，所述萜烯选自δ-3-蒈烯或β-水芹烯，或至少一种β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯化学型精油，或它们的其中一种混合物。

优选地，该组合物包括，作为油精，至少一种精油，选自西黄松(Pinus ponderosa)精油、矮赤松(Pinus mugo)精油、花旗松(Pseudotsuga menziesii)精油、香脂冷杉(Abiesbalsamea)精油、欧洲冷杉(Abies alba)精油、白云杉(Picea glauca)精油、欧白芷(Angelica archangelica)精油和白松香(Ferula gummosa)精油。

在本发明的背景下，选定的精油及其萜烯，可以以简单且有效的方式用于常规的接种物生产和蘑菇生产方法，而无需使这些方法复杂化。

因此，本发明还涉及一种获得菌丝体接种物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

制备培养基，

在培养基中加入至少一种β-蒎烯、δ-3-蒈烯和β-水芹烯化学型精油，或至少一种萜烯，所述萜烯选自β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯或它们的其中一种混合物，或上述定义的组合物，

用孢子或接种物接种培养基，

可选地，使菌丝体生长，

用菌丝体接种定植基质，

获得菌丝体接种物，

包装接种物。

优选地，在根据本发明的方法中，将精油、萜烯或组合物添加到培养基中，使得精油的浓度或萜烯的浓度在20和300μL/L培养基之间。

使用的培养基是菌丝体生产中使用的常规培养基。特别是液体或琼脂培养基，例如马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。众所周知，培养基在液态下经过灭菌。培养基灭菌后，加入根据本发明的组合物，然后将培养基以液体形式保存或倒入培养盒中(如果它含有胶凝剂)。然后用固体孢子或接种物对液体溶液或培养盒接种，然后以常规方式继续进行该方法。

相比常规方法，根据本发明的方法允许生产者获得可销售的接种物、菌丝体或蘑菇所需的时间缩短数天。与在常规方法中获得的生长相比，即不使用本发明中选定的萜烯或精油的方法，根据本发明方法的生长可受到刺激并提高50％甚至80％以上。可通过测量菌丝体在给定时刻T的大小或质量来计算与对照组相比的生长刺激。

本发明还涉及一种利用菌丝体接种物栽培蘑菇的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

制备出菇基质，

可选地，对出菇基质浸渍、添加、喷洒或喷雾，使用的是至少一种β-蒎烯、δ-3-蒈烯和β-水芹烯化学型精油，或至少一种萜烯，所述萜烯选自β-蒎烯、δ-3-蒈烯或β-水芹烯或它们的其中一种混合物，或上述定义的组合物，

用优选地根据本发明的方法获得的菌丝体接种物，对出菇培养基接种，

对出菇基质孵育，可选地通过喷洒或喷雾并使用至少一种精油，或至少一种萜烯，或上述定义的组合物，

出菇，

采收，

根据本发明的实施例，菌丝体或蘑菇选自担子菌，特别是双孢蘑菇、侧耳和香菇，更具体地是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、平菇(Pleurotus ostreaus)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)和香菇(Lentinula edodes)。

通过阅读下面对实施例的描述，可以更加清楚地理解本发明的上述特征以及其他特征，所述描述是结合附图来完成的，其中：

图1是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的菌丝体在添加有西黄松(Pinusponderosa)精油的培养基上的生长模拟的图示。

图2是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的菌丝体在添加有矮赤松(Pinus mugo)精油的培养基上的生长模拟的图示。

图3是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的菌丝体在添加有花旗松(Pseudotsugamenziesii)精油的培养基上的生长模拟的图示。

图4、图5和图6是三种双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌株的菌丝体在添加有纯化β-蒎烯的培养基上的生长模拟的图示。

图7是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的菌丝体在添加有纯化α-蒎烯的培养基上的生长抑制的图示。

实施例1：双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体生长的生物刺激的评价

1.1实验方案

制备根据本发明的生物刺激剂组合物

-在无菌容器中，将根据本发明选择的精油或萜烯与表面活性剂等量混合：

-总共制备200μL，以获得100μL精油或萜烯/1升溶液的浓度。

制备培养基

-根据供应商的说明，在单独的容器中制备2份PDA，每份1升。

-在高压蒸汽灭菌器中，在121℃下同时对两份溶液灭菌15分钟。

向培养基中加入根据本发明的生物刺激剂组合物

-等待两种溶液温度下降至40℃左右。

-均质化，然后将生物刺激剂组合物倒入两个容器的其中一个中。

-将所使用的等体积的表面活性剂倒入第二个容器中。

-搅拌，然后将2升溶液倒入带标识的培养盒中。

-将培养盒置于温度23℃±1℃、湿度80％的孵育器中。

对培养基接种

-用选定的蘑菇菌株对所有培养盒接种。

-再将培养盒置于温度23℃±1℃、湿度80％的孵育器中。

测定菌丝体的生长刺激作用

-7天后，用细记号笔在培养盒底部描绘菌丝体的轮廓。

-接种后14天和21天再次描绘菌丝体的轮廓。

-在每个培养盒的彼此相隔90°的4个轴上测量其生长情况，直至0.5mm左右。

-计算测得的平均生长值，然后测定相对于对照组的抑制或生物刺激百分比，所述对照组仅包含表面活性剂，而不使用精油或萜烯。

1.2结果

经过测试并且可以刺激双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体的发育和生长的精油如下表1所示。还指出了所获得的刺激百分比以及每种精油的化学型。

使用美国Amycel公司提供的Heirloom品牌的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体，对每种受试精油进行了40次重复操作。

[表1]

发现对菌丝体生长的刺激作用比对照组高35％。特别是，西黄松(Pinusponderosa)、欧白芷(Angelico archangelica)和矮赤松(Pinus mugo)的精油已被证明非常有效，其生长刺激率分别为82％、75％和67％。这些精油是β-蒎烯、β-水芹烯和δ-3-蒈烯化学型的。

图1、图2和图3示出了双孢蘑菇(d'Agaricus bisporus)菌丝体在添加有西黄松(Pinus ponderosa)(图1)、矮赤松(Pinus mugo)(图2)和花旗松(Pseudotsuga menziesii)(图3)的精油的培养基上的平均生长情况。

作为比较，表2中列出的精油对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体的生长有抑制作用，或未显示出明显作用。

[表2]

实施例2：平菇(Pleurotus ostreaus)菌丝体生长的生物刺激的评价

2.1实验方案

该实验方案与实施例1的实验方案相同。

2.2结果

经过测试并且可以刺激平菇(Pleurotus ostr菌丝体发育和生长的精油如下eaus)菌丝体的发育和生长的精油如下表3所示。还指出了所获得的刺激百分比以及每种精油的化学型。

使用奥地利Glückspilze公司提供的平菇(Pleurotus ostreaus)菌丝体，对每种受试精油进行了4次重复操作。

[表3]

发现对菌丝体生长的刺激作用比对照组高30％。特别是，西黄松(Pinusponderosa)、矮赤松(Pinus mugo)和花旗松(Pseudotsuga menziesii)的精油已被证明非常有效，其生长刺激率分别为61％、52％和48％。这些精油是β-蒎烯、δ-3-蒈烯和β-水芹烯化学型的。

实施例3：杏鲍菇(Pleurotuseryngii)菌丝体生长的生物刺激的评价

3.1实验方案

该实验方案与实施例1的实验方案相同。

3.2结果

经过测试并且可以杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌丝体的发育和生长的精油如下表4所示。还指出了所获得的刺激百分比以及每种精油的化学型。

使用奥地利Glückspilze公司提供的杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌丝体，对每种受试精油进行了4次重复操作。

[表4]

发现对菌丝体生长的刺激作用比对照组高35％。特别是，欧白芷(Angelicaarchangelica)和白松香(Ferula gummosa)的精油已被证明非常有效，其生长刺激率分别为54％和35％。这些精油是β-水芹烯或β-蒎烯化学型的。

作为对照，对百里酚化学型的印度藏茴香(Trachyspermum ammi)精油和甲基茶酚化学型的宽裂龙蒿(Artemisia dracunculus)精油进行了测试，并且它们表现出对杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌丝体的生长有抑制作用。

实施例4：香菇(Lentinulaedodes)菌丝体生长的生物刺激的评价

4.1实验方案

该实验方案与实施例1的实验方案相同。

4.2结果

经过测试并且可以刺激香菇(Lentinula edodes)菌丝体的发育和生长的精油如下表5所示。还指出了所获得的刺激百分比以及每种精油的化学型。

使用奥地利Glückspilze公司提供的香菇(Lentinula edodes)菌丝体，对每种受试精油进行了4次重复操作。

[表5]

发现对菌丝体生长的刺激作用比对照组高10％。特别是，花旗松(Pseudotsugamenziesii)和白松香(Ferula gummosa)的精油已被证明非常有效，其生长刺激率分别为20％和18％。这些精油全部是β-蒎烯化学型的。

实施例5：β-蒎烯对双孢蘑菇(Agaricusbisporus)菌丝体生长的生物刺激的评价

5.1实验方案

该实验方案与实施例1的实验方案相同。

用纯化萜烯，即β-蒎烯对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的三种菌株(来自Amycel公司的Heirloom和TripleX品牌，Sylvan公司的Tuscan品牌)进行了测试。

5.2结果

图4、5和6示出了Heirloom品牌(图4)的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、TripleX品牌(图5)的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、Tuscan品牌(图6)的双孢蘑菇(Agaricusbisporus)的菌丝体在添加有纯化β-蒎烯的培养基上的平均生长情况，其中用于Heirloom和TripleX品牌的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的β蒎烯浓度为40或80μL/L，用于Tuscan品牌的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的β蒎烯浓度为80或100μL/L。

在双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的三种菌株中，β-蒎烯对受到生物刺激的菌丝体生长的生物刺激作用非常显着，这种作用通过提高β-蒎烯的浓度得到增强。

实施例6：β-蒎烯和α-蒎烯对双孢蘑菇(Agaricusbisporus)的菌丝体生长的作用

6.1实验方案

该实验方案与实施例1的实验方案相同。

用纯化萜烯，即浓度40μL/L的β-蒎烯和α-蒎烯对来自Amycel公司的TripleX品牌的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的菌株进行了测试。

6.2结果

结果如图5和图7所示。

该测定证明了这两种萜烯对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体生长的拮抗作用。事实上，α-蒎烯对菌丝体的生长产生抑制作用，而β-蒎烯对菌丝体的生长产生生物刺激作用，如实施例5所示。