一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用

技术领域

本发明属于生物技术与缺血性脑卒中领域，具体涉及一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。

背景技术

缺血性脑卒中是由多种因素诱发颅内血管狭窄或闭塞、供血障碍，最终导 致脑组织坏死、神经系统功能紊乱的多发性疾病。血脑屏障损伤是急性缺血性 脑卒中的常见症状，同时也是导致缺血性脑卒中出血转化的原因之一。缺血性 脑卒中出血转化是指患者在早期诊断未出血，但随着病程自然进程或治疗后， 出现颅内出血的现象。大量研究证实，缺血性脑卒中形成的缺血缺氧微环境， 可促使血脑屏障功能紊乱或细胞凋亡，导致外周血渗透到中枢神经系统，造成 患者认知与运动功能障碍。相反，在缺血性脑卒中后，维持血脑屏障完整性， 则有助于预防急性缺血性脑卒中后出血转化，提升患者预后。

环状RNA(circRNA)是一类由mRNA前体在成熟过程中通过反向剪切形 成的单链、闭合RNA分子，具有性质稳定、物种保守性强，疾病特异性的特点， 在生理、病理过程中扮演分子标签与调控因子的角色。由于circRNA没有5’和 3’端结构，因而不易被RNase R酶降解，在生物体内具有相对稳定的特点。此 外，circRNA通过竞争性富集miRNA(或RNA结合蛋白)，调控靶基因转录， 翻译等，从而参与糖尿病、肿瘤等疾病的发生、发展过程(Dan Lu,etal.Front Genet 2016,7:53)。因而，circRNA被认为有可能成为部分疾病的生物标记物，在病理过程中发挥重要的调控作用。

Circ-FoxO3在人与小鼠物种中高度保守，为FoxO3基因的第2个外显子经 反向剪切而成，并通过与miRNA(或RNA结合蛋白)相互作用，参与细胞周 期，增殖与分化等基础生理过程，维持细胞内环境稳态(William W.Du,et al.EUR HEART J 2017,38:1402-1412；Zhe Kong,et al.J Cell Mol Med 2020, 24(1):799-813；William W.Du,et al.NucleicAcids Research 2016, 44(6):2846-2858.)。然而，circ-FoxO3与缺血性脑卒中病理变化的相关性，及其 应用未见报道。

目前临床上主要基于影像学方法及临床经验，评估急性缺血性脑卒中后出 血转化的风险及治疗技术方案。但由于缺血性脑卒中病理机制复杂，以及缺乏 可靠治疗靶位点，因而，限制了患者的预后。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种环状 RNAcirc-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用；

所述的circ-FoxO3为小鼠源circ-FoxO3或人源circ-FoxO3；

所述的小鼠源circ-FoxO3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；

所述的人源circ-FoxO3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2；

所述的circ-FoxO3在制备缺血性脑卒中靶向产品中的应用；

所述的circ-FoxO3在制备防治脑缺血再灌注损伤产品中的应用；

所述的circ-FoxO3在制备保护血脑屏障产品中的应用；

所述的circ-FoxO3在制备降低或改善缺血性脑卒中后出血转化产品中的应 用；

所述的circ-FoxO3在制备神经血管保护剂中的应用；

所述的circ-FoxO3在制备评估缺血性脑卒中出血转化产品中的应用；

所述的评估缺血性脑卒中出血转化产品优选为检测circ-FoxO3的引物或包 含检测circ-FoxO3的引物的试剂盒；

所述的检测circ-FoxO3的引物为检测小鼠源circ-FoxO3的引物或检测人源circ-FoxO3的引物；

所述的检测小鼠源circ-FoxO3的引物，优选为qPCR-circ-FoxO3(M)-F和 qPCR-circ-FoxO3(M)-R，其核苷酸序列如下所示：

上游引物qPCR-circ-FoxO3(M)-F(SEQ ID NO:3)：

5’-CTGGTGCTAAGCAGGCCTCA-3’；

下游引物qPCR-circ-FoxO3(M)-R(SEQ ID NO:4)：

5’-GCCTTCATTCTGAACGCGCA-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(M)-F(SEQ ID NO:5)：

5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(M)-R(SEQ ID NO:6)：

5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；

所述的检测人源circ-FoxO3的引物，优选为qPCR-circ-FoxO3(H)-F和 qPCR-circ-FoxO3(H)-R，其核苷酸序列如下所示：

上游引物qPCR-circ-FoxO3(H)-F(SEQ ID NO:7)：

5’-ATGGATGCTGATGGGTTGGA-3’；

下游引物qPCR-circ-FoxO3(H)-R(SEQ ID NO:8)：

5’-AGGTTGTGCCGGATGGAGTT-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(H)-F(SEQ ID NO:9)：

5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(H)-R(SEQ ID NO:10)：

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；

Circ-FoxO3的反向剪切位点为：GGGCAAAGCAG/(splice junction)AACTCCATCCGGCACA(SEQ ID NO:11)；

一种敲低circ-FoxO3的干扰RNA序列，其核苷酸序列如下所示：

正义链：5’-GGGCAAAGCAGAACUCCAUUU-3’(SEQ ID NO:12)；

反义链：5’-AUGGAGUUCUGCUUUGCCCUU-3’(SEQ ID NO:13)；

对照序列的正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO:14)；

对照序列的反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO:15)；

本发明的原理：

(1)本发明采用RT-qPCR、免疫荧光、荧光原位杂交(FISH)等检测方法， 分析了circ-FoxO3在缺血再灌注后小鼠脑微血管中的定位与表达水平。

(2)本发明以脑微血管内皮细胞系(bEnd.3，HBMEC)为研究对象，在体 外建立血脑屏障模型，通过敲低或过表达circ-FoxO3的方式，探讨了circ-FoxO3 对氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后血脑屏障功能的影响，及对内皮细胞凋亡的作 用。

本发明阐明了circ-FoxO3与缺血性脑卒中的相关性，及其在保护血脑屏障 中的应用；提供了一种有关缺血性脑卒中后出血转化风险评估新方案，以及开 发保护神经血管产品的潜在靶点。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过qPCR检测方法，确定circ-FoxO3在缺血再灌注后小鼠脑 组织，以及经OGD/R处理的内皮细胞系(HBMEC，bEnd.3)中高表达；免疫 荧光联合FISH技术证实circ-FoxO3与CD31标记的脑血管内皮细胞存在共定位。 这些结果提示circ-FoxO3可作为缺血性脑卒中生物标记物。

(2)本发明发现：敲低circ-FoxO3加剧内皮屏障损伤过程(屏障的通透性 增强，内皮细胞凋亡增加)，而适当的高表达则有效减缓这种损伤。该结果表 明circ-FoxO3是缺血性脑卒中后血脑屏障损伤的潜在保护性靶位点；维持适当 的circ-FoxO3表达水平可保护血脑屏障完整性，从而降低缺血性脑卒中后出血 转化的概率。

(3)本发明证实circ-FoxO3在MCAO/R小鼠脑血管内皮细胞中，以及经 OGD/R处理的脑血管内皮细胞系(小鼠源bEnd.3，人源HBMEC)中高表达， 且与内皮细胞存在共定位；敲低circ-FoxO3后加剧了OGD/R对内皮屏障的损伤 进程，而通过过表达circ-FoxO3，则显示其对经OGD/R处理的内皮屏障，具有 一定的保护作用。本发明为预防急性缺血性脑卒中后出血转化提供了新思路， 为开发神经血管保护剂提供了新的靶点。

附图说明

图1是circ-FoxO3来源、剪切位点及其在小鼠缺血再灌注后表达水平的结 果分析图；其中，A：circ-FoxO3来源示意与剪切位点，E为外显子；B：小鼠 脑组织取材示意图，小鼠经脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R，闭塞3h，再灌注 3h)；C：circ-FoxO3在脑梗区(strokecore)与缺血半暗带(ischemic border) 中的表达水平。

图2是bEnd.3和HBMEC脑血管内皮细胞系经OGD处理3h后，circ-FoxO3 在不同复氧时间点(3，6，9，12h)表达水平的结果分析图，其中，N＝3。

图3是circ-FoxO3在小鼠脑微血管中表达定位的结果分析图；其中，A： C57BL/6小鼠(雌雄各半，8周，25±2g)经MCAO处理3h后再灌注3h，然 后取脑组织，切片后经免疫荧光与FISH检测内皮细胞标记物CD31与 circ-FoxO3，白色箭头指示CD31与circ-FoxO3共定位，标尺为50μm；B： circ-FoxO3相对表达量统计结果，N＝6；C：circ-FoxO3与CD31共定位的统计 结果，N＝6。

图4是circ-FoxO3在内皮细胞系中表达定位的结果分析图；其中，A：bEnd.3 中circ-FoxO3表达定位(白色箭头)；B：HBMEC中circ-FoxO3表达定位(白 色箭头)；C：circ-FoxO3相对表达量；标尺为10μm，N＝4。

图5是检测circ-FoxO3表达水平的结果分析图；A：过表达载体 pCD513B-1-circ-FoxO3(由上海生工生物工程公司提供)；B：在内皮细胞(bEnd.3 或HBMEC)中转染siRNA(SEQID NO:12～15)或慢病毒包装的circ-FoxO3载 体后检测circ-FoxO3的表达水平，其中，Ctrl组：未进行任何处理，OGD/R组： 仅进行OGD/R处理，siNC+OGD/R组：以干扰RNA对照序列转染内皮细胞并 进行OGD/R处理，sicirc-FoxO3+OGD/R组：以敲低circ-FoxO3的干扰RNA序列转染内皮细胞并进行OGD/R处理，circNC+OGD/R组：以慢病毒空载转染内 皮细胞并进行OGD/R处理，circ-FoxO3+OGD/R：以circ-FoxO3慢病毒载体转 染内皮细胞并进行OGD/R处理，N＝3。

图6是circ-FoxO3保护内皮屏障功能的结果分析图；其中，将内皮细胞 (bEnd.3或HBMEC)以3×10

图7是circ-FoxO3抑制内皮内皮细胞凋亡的结果分析图；其中，siNC组： 以干扰RNA对照序列转染内皮细胞并进行OGD/R处理，sicirc-FoxO3组：以敲 低circ-FoxO3的干扰RNA序列转染内皮细胞并进行OGD/R处理，circNC组： 以慢病毒空载转染内皮细胞并进行OGD/R处理，circ-FoxO3组：以circ-FoxO3 慢病毒载体转染内皮细胞并进行OGD/R处理；以各组细胞为研究对象，采用 Annexin V-FITC/PI法，经流式细胞术，检测内皮细胞bEnd.3和HBMEC凋亡， N＝5。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

PCR试剂PrimeSTAR(DR010A)、Taq酶(DR001B)、dNTP(DR001B)、 5×Buffer(DR001B)等均购自Takara。

实施例1 circ-FoxO3在脑血管内皮细胞中的表达水平

1、Circ-FoxO3信息简介

该环状RNA高度保守，在人或小鼠来源的物种中均是由FoxO3基因的第二 个外显子在转录时候，经反向剪切生成的环状RNA。其中：

小鼠来源的circ-FoxO3又称为mmu_circ_0002207，长度为1436bp，其对应 的亲本基因位于chr10:41916271-41917707，其反向剪切位点为 GGGCAAAGCAG/(splicejunction)AACTCCATCCGGCACA(SEQ ID NO:11)。

人源的circ-FoxO3又称为hsa_circ_0006404，长度为1435bp；其对应的亲 本基因位于chr6：108984657-108986092，其反向剪切位点同样为SEQ ID NO:11 (图1A)。

小鼠来源的circ-FoxO3(SEQ ID NO:1)：

AACTCCATCCGGCACAACCTGTCCCTGCACAGCCGCTTCATGCGCGTT CAGAATGAAGGCACGGGCAAGAGCTCTTGGTGGATCATCAACCCCGATGG GGGAAAGAGCGGGAAGGCCCCCCGGCGGCGTGCGGTCTCCATGGACAAC AGCAACAAGTACACCAAGAGCCGAGGCCGGGCAGCCAAGAAGAAGGCG GCCCTGCAGGCTGCCCCAGAGTCGGCAGACGACAGTCCTTCCCAGCTCTC CAAGTGGCCTGGCAGCCCCACGTCCCGCAGCAGCGACGAGCTGGATGCGT GGACCGACTTCCGCTCGCGCACCAATTCCAACGCCAGCACCGTGAGCGGC CGCCTGTCGCCCATCCTGGCAAGCACGGAGCTGGATGACGTCCAGGATGA TGATGGACCCCTGTCCCCCATGCTGTACAGCAGCTCTGCCAGCCTGTCGCC CTCCGTGAGCAAGCCGTGTACTGTGGAGCTTCCGCGGCTGACGGACATGG CCGGCACCATGAATCTGAATGATGGGCTGGCCGAGAACCTCATGGACGAC CTGCTGGATAACATCGCGCTCCCGCCATCGCAGCCATCGCCTCCTGGCGGG CTTATGCAGCGGGGCTCCAGCTTCCCATATACCGCCAAGAGCTCCGGCCTG GGCTCCCCAACCGGCTCCTTCAACAGTACCGTGTTTGGACCTTCGTCTCTG AACTCCTTGCGTCAGTCACCCATGCAGACTATCCAGGAGAACAGACCAGC CACCTTCTCTTCCGTGTCACACTACGGCAACCAGACACTCCAAGACCTGCT TGCTTCAGACTCACTCAGCCACAGCGACGTCATGATGACCCAGTCGGACC CCTTGATGTCTCAGGCTAGCACCGCCGTGTCCGCCCAGAATGCCCGCCGG AACGTGATGCTTCGCAACGATCCAATGATGTCCTTTGCTGCCCAGCCTACC CAGGGGAGTTTGGTCAATCAGAACTTGCTCCACCACCAGCACCAAACCCA GGGCGCTCTTGGTGGCAGCCGTGCCTTGTCAAATTCTGTCAGCAACATGG GCTTGAGTGACTCCAGCAGCCTTGGCTCAGCCAAACACCAGCAGCAGTCT CCCGCCAGCCAGTCTATGCAAACCCTCTCGGACTCTCTCTCAGGCTCCTCA CTGTATTCAGCTAGTGCAAACCTTCCCGTCATGGGCCACGATAAGTTCCCC AGTGACTTGGACCTGGACATGTTCAATGGGAGCTTGGAATGTGACATGGA GTCCATCATCCGTAGTGAACTCATGGATGCTGACGGGTTGGATTTTAACTTT GACTCCCTCATCTCCACACAGAACGTTGTTGGTTTGAATGTGGGGAACTTC ACTGGTGCTAAGCAGGCCTCATCTCAAAGCTGGGTACCAGGCTGAAGGATCACTGAGGAAAGGGGAAATGGGCAAAGCAG

人源的circ-FoxO3(SEQ ID NO:2)：

AACTCCATCCGGCACAACCTGTCACTGCATAGTCGATTCATGCGGGTC CAGAATGAGGGAACTGGCAAGAGCTCTTGGTGGATCATCAACCCTGATGG GGGGAAGAGCGGAAAAGCCCCCCGGCGGCGGGCTGTCTCCATGGACAAT AGCAACAAGTATACCAAGAGCCGTGGCCGCGCAGCCAAGAAGAAGGCAG CCCTGCAGACAGCCCCCGAATCAGCTGACGACAGTCCCTCCCAGCTCTCC AAGTGGCCTGGCAGCCCCACGTCACGCAGCAGTGATGAGCTGGATGCGTG GACGGACTTCCGTTCACGCACCAATTCTAACGCCAGCACAGTCAGTGGCC GCCTGTCGCCCATCATGGCAAGCACAGAGTTGGATGAAGTCCAGGACGAT GATGCGCCTCTCTCGCCCATGCTCTACAGCAGCTCAGCCAGCCTGTCACCT TCAGTAAGCAAGCCGTGCACGGTGGAACTGCCACGGCTGACTGATATGGC AGGCACCATGAATCTGAATGATGGGCTGACTGAAAACCTCATGGACGACC TGCTGGATAACATCACGCTCCCGCCATCCCAGCCATCGCCCACTGGGGGAC TCATGCAGCGGAGCTCTAGCTTCCCGTATACCACCAAGGGCTCGGGCCTGG GCTCCCCAACCAGCTCCTTTAACAGCACGGTGTTCGGACCTTCATCTCTGA ACTCCCTACGCCAGTCTCCCATGCAGACCATCCAAGAGAACAAGCCAGCT ACCTTCTCTTCCATGTCACACTATGGTAACCAGACACTCCAGGACCTGCTC ACTTCGGACTCACTTAGCCACAGCGATGTCATGATGACACAGTCGGACCCC TTGATGTCTCAGGCCAGCACCGCTGTGTCTGCCCAGAATTCCCGCCGGAAC GTGATGCTTCGCAATGATCCGATGATGTCCTTTGCTGCCCAGCCTAACCAG GGAAGTTTGGTCAATCAGAACTTGCTCCACCACCAGCACCAAACCCAGGG CGCTCTTGGTGGCAGCCGTGCCTTGTCGAATTCTGTCAGCAACATGGGCTT GAGTGAGTCCAGCAGCCTTGGGTCAGCCAAACACCAGCAGCAGTCTCCTG TCAGCCAGTCTATGCAAACCCTCTCGGACTCTCTCTCAGGCTCCTCCTTGT ACTCAACTAGTGCAAACCTGCCCGTCATGGGCCATGAGAAGTTCCCCAGC GACTTGGACCTGGACATGTTCAATGGGAGCTTGGAATGTGACATGGAGTC CATTATCCGTAGTGAACTCATGGATGCTGATGGGTTGGATTTTAACTTTGAT TCCCTCATCTCCACACAGAATGTTGTTGGTTTGAACGTGGGGAACTTCACT GGTGCTAAGCAGGCCTCATCTCAGAGCTGGGTGCCAGGCTGAAGGATCACTGAGGAAGGGGAAGTGGGCAAAGCAG

2、Circ-FoxO3(mmu_circ_0002207)在MCAO/R小鼠脑组织中的表达水 平

(1)MCAO/R实验

选择体重为25±2g的C57BL/6小鼠(雌雄各半，由南方医科大学实验动物 中心提供)，分为Sham组与MCAO/R组，每组各6只。具体方法如下：

①采用7％(体积分数)的水合氯醛并按0.05mL/10g的剂量进行腹腔注射；

②将麻醉后的小鼠仰卧位固定于操作台上，并进行颈部脱毛；

③碘酒消毒皮肤后，在颈部正中处从头到尾方向切3cm切口，用镊子分离 皮下各层结缔组织与肌肉组织，暴露右侧粗大、在搏动的粉红的颈总动脉 (Common carotidartery，CCA)；

④分离出CCA后，向上分离(远心端)外颈动脉(external carotid artery， ECA)，在CCA与ECA交叉处用3-0线结扎CCA，在ECA远心端与近心端用 6-0线进行结扎；在ECA两线之间切个小口，将栓线从上往下插入血管内(有 远心端到近心端)，然后用5-0线绑住栓线；解开ECA近心端与远心端的6-0 线，然后将线栓经CCA与ECA交叉处进入内颈动脉(internalcarotid artery， ICA)，注意避免进入翼腭动脉；当栓线进入ICA大概1cm左右后，感觉有阻力时则为阻断大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)入口，最后解开CCA 远心端的3-0线；

⑤将小鼠放回温室饲养3h，然后拔出栓线进行再灌注3h；再灌注后将小 鼠进行Longa评分，具体评分标准如下：

0分：神经功能无缺损，运动弄能正常；1分：提尾时左前肢前伸困难；2 分向左侧转圈；3分：向左侧倒斜；4分：无自主运动，无意识反应。

⑥将1到3分的小鼠进行脱颈处死，在正中矢状位切开头皮，用镊子剥去 露骨组织，获取脑组织。

(2)OGD/R实验

bEnd.3或者HBMEC细胞(由中国科学院上海生命科学院细胞资源中心提 供)在形成单细胞层后，采用无糖培养基，在94％N

(3)获取cDNA：MCAO/R实验或OGD/R实验完成后采用Thermo Fisher 公司生产的TRIZOL试剂从每个样品提取5μg的总RNA，然后按照TAKARA 逆转录试剂盒(货号为RR047A)说明书使用方法获得cDNA。

(4)qPCR检测小鼠脑梗区，缺血半暗带等脑组织以及内皮细胞(bEnd.3 或HBMEC)中的circ-FoxO3，具体引物序列如下所示：

检测小鼠源circ-FoxO3的引物：

上游引物qPCR-circ-FoxO3(M)-F(SEQ ID NO:3)：

5’-CTGGTGCTAAGCAGGCCTCA-3’；

下游引物qPCR-circ-FoxO3(M)-R(SEQ ID NO:4)：

5’-GCCTTCATTCTGAACGCGCA-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(M)-F(SEQ ID NO:5)：

5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(M)-R(SEQ ID NO:6)：

5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；

检测人源circ-FoxO3的引物：

上游引物qPCR-circ-FoxO3(H)-F(SEQ ID NO:7)：

5’-ATGGATGCTGATGGGTTGGA-3’；

下游引物qPCR-circ-FoxO3(H)-R(SEQ ID NO:8)：

5’-AGGTTGTGCCGGATGGAGTT-3’；

内参上游引物qPCR-β-actin(H)-F(SEQ ID NO:9)：

5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；

内参下游引物qPCR-β-actin(H)-R(SEQ ID NO:10)：

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’；

qPCR反应体系如表1所示：

表1 qPCR反应体系

qPCR反应条件为：cycle 1(1×)预变性：95℃，30s；cycle 2(40×)变 性95℃，5s；退火延伸：60℃，10s。

(5)结果分析

经MCAO/R处理后，小鼠脑组织中circ-FoxO3表达水平上升(图1B-C)； 内皮细胞经OGD/R处理后，circ-FoxO3表达水平上升(见图2)。结果说明 circ-FoxO3可作为急性脑卒中生物标记物，为该疾病的诊断与治疗提供靶位点。

实施例2 circ-FoxO3在脑血管内皮细胞中的定位

(1)为检测circ-FoxO3在脑血管内皮细胞中的定位，本发明采用FISH与 免疫荧光实验。此部分所用一抗为anti-Rabbit-CD31(Abcam,ab28364)，所用 二抗为Goat anti-Rabbit IgG,Alexa Fluor Plus 488(Invitrogen,A32731)，所用 circ-FoxO3探针为CY5-TGTGCCGGATGGAGTTCTGCTTTGCCCACTTC(SEQ ID NO:16)，对照探针由上海生工生物工程公司提供。具体方法如下：

小鼠体内实验：C57BL/6小鼠(雌雄各3只，8周，25±2g，由南方医科大 学实验动物中心提供)经MCAO处理3h后再灌注3h(具体方法同实施例1 MCAO/R实验)，然后取脑组织，切片后经免疫荧光与FISH检测内皮细胞标记 物CD31与circ-FoxO3。具体步骤如下：

①在室温条件下，用质量体积百分数为4％的PFA(用DEPC水配制的PBS 配制4％PFA)固定切片20min后，PBS(DEPC水配制)清洗2次，每次5min；

②在质量体积百分数为0.25％的triton-×-100溶液通透15min后，用2×SSC 清洗2次，每次15min；

③在37℃下，用杂交液孵育切片1h(预杂交)；

④将探针溶于杂交液中至浓度为10nmol/L，然后置于65℃水浴中变性5min (探针变性)；

⑤用溶解探针的杂交液孵育切片，37℃避光过夜(杂交)；

⑥在42℃条件下，用2×SSC避光清洗切片3次，每次20min；

⑦在42℃条件下，用0.2×SSC避光清洗切片2次，每次20min；

⑧在室温条件下，用封闭液(1％BSA+3％NGS溶于PBS)避光封闭1h；

⑨孵育一抗(CD31，1:100)，在湿盒中，4℃避光过夜；

⑩在室温条件下，用TBS避光清洗切片2次，每次2min；

体外内皮细胞实验：脑微血管内皮细胞系(bEnd.3或HBMEC)经OGD处 理3h后再复氧3h(具体方法同实施例1中OGD/R实验)，然后FISH检测 circ-FoxO3表达定位。具体步骤如下：

①在室温条件下，用质量体积百分数为4％的PFA(用DEPC水配制的PBS 配制4％PFA)固定细胞爬片20min后，然后，PBS(DEPC水配制)清洗2次， 每次5min；

②在质量体积百分数为0.25％的triton-×-100溶液打孔15min后，用2×SSC 清洗2次，每次15min；

③在37℃下，用杂交液孵育爬片1h(预杂交)；

④将探针溶于杂交液中至浓度为10nmol/L，然后置于65℃水浴中变性5min (探针变性)；

⑤用溶解探针的杂交液孵育爬片，37℃避光过夜(杂交)；

⑥在42℃条件下，用2×SSC避光清洗爬片3次，每次20min；

⑦在42℃条件下，用0.2×SSC避光清洗爬片2次，每次20min；

⑧DAPI避光孵育5min；

⑨滴加抗猝灭剂，封片。

(2)结果分析

C57BL/6小鼠(8周，25±2g，雌雄各3只)经MCAO处理3h后再灌注3 h，然后取脑组织，切片后经免疫荧光与FISH检测内皮细胞标记物CD31与 circ-FoxO3，结果显示：在MCAO/R小鼠模型脑组织中，circ-FoxO3表达上调， 且与CD31标记的血管内皮细胞存在共定位(图3中白色箭头)；

脑微血管内皮细胞系(bEnd.3，HBMEC)经OGD处理3h后再复氧3h， 然后FISH检测circ-FoxO3表达定位，结果显示：circ-FoxO3在经OGD/R处理 的小鼠源或人源的内皮细胞系(bEnd.3或HBMEC)中存在高表达(图4)。这 些结果提示，circ-FoxO3可作为急性缺血性脑卒中的生物标记物。

实施例3在内皮细胞系中敲低或过表达circ-FoxO3并检测其在OGD/R条 件下的表达水平

(一)敲低circ-FoxO3

以bEnd.3和HBMEC为研究对象，采用Invitrogen生产的Lipofectamine

敲低circ-FoxO3的干扰RNA序列，其核苷酸序列如下所示：

正义链：5’-GGGCAAAGCAGAACUCCAUUU-3’(SEQ ID NO:12)；

反义链：5’-AUGGAGUUCUGCUUUGCCCUU-3’(SEQ ID NO:13)；

对照序列的正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO:14)；

对照序列的反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO:15)；

具体实验过程如下：

①将对数生长期的bEnd.3或HBMEC细胞以3×10

②取一支灭菌后的1.5ml EP管，标记为A，并向其中加入500μl Opti-MEM 及2μg的转染干扰序列(SEQ ID NO:12～13或SEQ ID NO:14～15)，轻轻吹打 混匀后静止5min，为A液。

③另取一支1.5ml EP管，标记为B，并向其中加入500μl Opti-MEM及5μlLipofectamine

④将A液和B液混匀后，于室温下避光静止10min。然后将混合液分别转 移至bEnd.3或HBMEC细胞中，于37℃、5％CO

⑤于6h后更换正常培养基，并继续培养24h后收集细胞。

⑥将步骤⑤获得细胞参照实施例1进行OGD/R实验，然后提取RNA，逆 转录cDNA，qPCR验证circ-FoxO3表达水平。

结果如图5B，经转染干扰序列(SEQ ID NO:12～13)后，circ-FoxO3表达 水平下降。

(二)过表达circ-FoxO3

通过构建circ-FoxO3慢病毒载体，转染bEnd.3或HBMEC，经puromycin 药物筛选，以获得稳定表达circ-FoxO3的细胞系。然后通过qPCR验证。具体 实验过程如下：

①构建circ-FoxO3慢病毒载体：由上海生工生物工程公司构建，另以空载 作为对照，具体方法为：将circ-FoxO3全长通过多克隆位点插入到pCD513B-1 载体中，以获得circ-FoxO3慢病毒载体pCD513B-1-circ-FoxO3。

②慢病毒包装：以293T细胞(由中国科学院上海生命科学院细胞资源中心 提供)为研究对象，在直径为6cm的培养皿中培养；待其汇合度为80％左右后， 更换无血清培养基。在灭菌后的离心管中，加入步骤①中构建好的circ-FoxO3 慢病毒载体(5μg)及1.5mlOpti-MEM；在另一支离心管中加入50μl Lipofectamine

③病毒的收获及浓缩：收集48h后293T细胞的上清液，并于4℃、4000g 离心，以去除细胞碎片。然后将上清液过滤离心(0.45μm滤器)，获得病毒粗 提液。接着，将病毒粗提液在过滤器中离心(5000g，15min)，以获得所需病 毒浓缩液。

④慢病毒感染细胞：待6孔板细胞汇合度为50％左右后，更换无血清培养 基。然后每孔加入2×10

⑤将步骤④获得的细胞参照实施例1进行OGD/R实验，然后提取RNA， 逆转录cDNA，qPCR验证circ-FoxO3表达水平。

结果如图5B，经转染circ-FoxO3慢病毒载体后，circ-FoxO3表达水平显著 上升。

实施例4分析circ-FoxO3对内皮细胞屏障的作用

本实施例通过体外内皮细胞通透性检测，分析circ-FoxO3对内皮细胞屏障 功能的作用，具体方法如下：

(1)制备FITC-Dextram(分子量10kDa，25mg，Molecular Probes，USA) 标准曲线：按表2溶液成分在494nm波长处检测吸光值，并绘制标准曲线。

表2标准FITC-Dextran溶液组成

(2)将敲低或过表达circ-FoxO3的内皮细胞(bEnd.3或HBMEC)以 3×10

其中，dQ/dt：单位时间内FITC-Dextran的渗透量(ng/min)

A：Tranwell板膜的面积

C

60：是分钟到秒的转换比例

在敲低或高表达circ-FoxO3后，内皮细胞(bEnd.3或HBMEC)屏障在OGD/R (OGD3h，R 3h)条件下，对FITC-Dextran(10kDa)的通透性结果如图6 所示，敲低circ-FoxO3能增强FITC-Dextran渗透作用，相反，高表达circ-FoxO3 则能抑制FITC-Dextran渗透作用。该结果证实在缺血再灌注的体外细胞模型 (OGD/R)中circ-FoxO3能保护血脑屏障完整性。

实施例5检测circ-FoxO3对内皮细胞凋亡的作用

为探讨circ-FoxO3对内皮细胞凋亡的作用，本发明首先在敲低或者过表达 circ-FoxO3(参考实施例3)的内皮细胞(bEnd.3与HBMEC)中，经氧糖剥夺 处理3h，然后在含10％FBS正常培养基中再复氧3h后(参考实施例1)，采 用Annexin V-FITC/PI法，检测内皮细胞凋亡。具体步骤如下：

(1)分别收集各组细胞中的培养基到15ml离心管中(培养基中可能存在 凋亡细胞)。

(2)预冷的PBS洗涤两次，并收集到各组对应的离心管中。

(3)胰蛋白酶消化各组细胞，终止消化后转移到各组对应的离心管中。

(4)1000g离心5min，收集细胞。

(5)PBS重悬，清洗细胞，并于1000g离心5min，收集细胞。

(6)加入195μl Binding buffer并重悬细胞

(7)再加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI

(8)室温避光孵育15min。

(9)上机检测。

敲低或高表达circ-FoxO3的内皮细胞(bEnd.3或HBMEC)，在氧糖剥夺 (OGD)3h，再复氧(R)3h后(参考实施例1)，经流式仪检测细胞凋亡， 最后统计分析circ-FoxO3对内皮细胞凋亡的作用。其结果如图7所示。在 MCAO/R条件下，敲低circ-FoxO3后加速凋亡，而过表达circ-FoxO3则能抑制凋 亡。该结果提示，适当维持circ-FoxO3表达水平，有助于脑血管内皮细胞存活。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学附属第一院（广州华侨医院）

<120> 一种环状RNA circ-FoxO3在制备防治缺血性脑卒中产品中的应用

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 小鼠来源的circ-FoxO3

<400> 1

aactccatcc ggcacaacct gtccctgcac agccgcttca tgcgcgttca gaatgaaggc 60

acgggcaaga gctcttggtg gatcatcaac cccgatgggg gaaagagcgg gaaggccccc 120

cggcggcgtg cggtctccat ggacaacagc aacaagtaca ccaagagccg aggccgggca 180

gccaagaaga aggcggccct gcaggctgcc ccagagtcgg cagacgacag tccttcccag 240

ctctccaagt ggcctggcag ccccacgtcc cgcagcagcg acgagctgga tgcgtggacc 300

gacttccgct cgcgcaccaa ttccaacgcc agcaccgtga gcggccgcct gtcgcccatc 360

ctggcaagca cggagctgga tgacgtccag gatgatgatg gacccctgtc ccccatgctg 420

tacagcagct ctgccagcct gtcgccctcc gtgagcaagc cgtgtactgt ggagcttccg 480

cggctgacgg acatggccgg caccatgaat ctgaatgatg ggctggccga gaacctcatg 540

gacgacctgc tggataacat cgcgctcccg ccatcgcagc catcgcctcc tggcgggctt 600

atgcagcggg gctccagctt cccatatacc gccaagagct ccggcctggg ctccccaacc 660

ggctccttca acagtaccgt gtttggacct tcgtctctga actccttgcg tcagtcaccc 720

atgcagacta tccaggagaa cagaccagcc accttctctt ccgtgtcaca ctacggcaac 780

cagacactcc aagacctgct tgcttcagac tcactcagcc acagcgacgt catgatgacc 840

cagtcggacc ccttgatgtc tcaggctagc accgccgtgt ccgcccagaa tgcccgccgg 900

aacgtgatgc ttcgcaacga tccaatgatg tcctttgctg cccagcctac ccaggggagt 960

ttggtcaatc agaacttgct ccaccaccag caccaaaccc agggcgctct tggtggcagc 1020

cgtgccttgt caaattctgt cagcaacatg ggcttgagtg actccagcag ccttggctca 1080

gccaaacacc agcagcagtc tcccgccagc cagtctatgc aaaccctctc ggactctctc 1140

tcaggctcct cactgtattc agctagtgca aaccttcccg tcatgggcca cgataagttc 1200

cccagtgact tggacctgga catgttcaat gggagcttgg aatgtgacat ggagtccatc 1260

atccgtagtg aactcatgga tgctgacggg ttggatttta actttgactc cctcatctcc 1320

acacagaacg ttgttggttt gaatgtgggg aacttcactg gtgctaagca ggcctcatct 1380

caaagctggg taccaggctg aaggatcact gaggaaaggg gaaatgggca aagcag 1436

<210> 2

<211> 1435

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人源的circ-FoxO3

<400> 2

aactccatcc ggcacaacct gtcactgcat agtcgattca tgcgggtcca gaatgaggga 60

actggcaaga gctcttggtg gatcatcaac cctgatgggg ggaagagcgg aaaagccccc 120

cggcggcggg ctgtctccat ggacaatagc aacaagtata ccaagagccg tggccgcgca 180

gccaagaaga aggcagccct gcagacagcc cccgaatcag ctgacgacag tccctcccag 240

ctctccaagt ggcctggcag ccccacgtca cgcagcagtg atgagctgga tgcgtggacg 300

gacttccgtt cacgcaccaa ttctaacgcc agcacagtca gtggccgcct gtcgcccatc 360

atggcaagca cagagttgga tgaagtccag gacgatgatg cgcctctctc gcccatgctc 420

tacagcagct cagccagcct gtcaccttca gtaagcaagc cgtgcacggt ggaactgcca 480

cggctgactg atatggcagg caccatgaat ctgaatgatg ggctgactga aaacctcatg 540

gacgacctgc tggataacat cacgctcccg ccatcccagc catcgcccac tgggggactc 600

atgcagcgga gctctagctt cccgtatacc accaagggct cgggcctggg ctccccaacc 660

agctccttta acagcacggt gttcggacct tcatctctga actccctacg ccagtctccc 720

atgcagacca tccaagagaa caagccagct accttctctt ccatgtcaca ctatggtaac 780

cagacactcc aggacctgct cacttcggac tcacttagcc acagcgatgt catgatgaca 840

cagtcggacc ccttgatgtc tcaggccagc accgctgtgt ctgcccagaa ttcccgccgg 900

aacgtgatgc ttcgcaatga tccgatgatg tcctttgctg cccagcctaa ccagggaagt 960

ttggtcaatc agaacttgct ccaccaccag caccaaaccc agggcgctct tggtggcagc 1020

cgtgccttgt cgaattctgt cagcaacatg ggcttgagtg agtccagcag ccttgggtca 1080

gccaaacacc agcagcagtc tcctgtcagc cagtctatgc aaaccctctc ggactctctc 1140

tcaggctcct ccttgtactc aactagtgca aacctgcccg tcatgggcca tgagaagttc 1200

cccagcgact tggacctgga catgttcaat gggagcttgg aatgtgacat ggagtccatt 1260

atccgtagtg aactcatgga tgctgatggg ttggatttta actttgattc cctcatctcc 1320

acacagaatg ttgttggttt gaacgtgggg aacttcactg gtgctaagca ggcctcatct 1380

cagagctggg tgccaggctg aaggatcact gaggaagggg aagtgggcaa agcag 1435

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物qPCR-circ-FoxO3（M）-F

<400> 3

ctggtgctaa gcaggcctca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物qPCR-circ-FoxO3（M）-R

<400> 4

gccttcattc tgaacgcgca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 内参上游引物qPCR-β-actin（M）-F

<400> 5

cgttgacatc cgtaaagacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 内参下游引物qPCR-β-actin（M）-R

<400> 6

aacagtccgc ctagaagcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物qPCR-circ-FoxO3（H）-F

<400> 7

atggatgctg atgggttgga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物qPCR-circ-FoxO3（H）-R

<400> 8

aggttgtgcc ggatggagtt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 内参上游引物qPCR-β-actin（H）-F

<400> 9

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 内参下游引物qPCR-β-actin（H）-R

<400> 10

ctccttaatg tcacgcacga t 21

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Circ-FoxO3的反向剪切位点

<400> 11

gggcaaagca gaactccatc cggcaca 27

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> 敲低circ-FoxO3的正义链

<400> 12

gggcaaagca gaacuccauu u 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> 敲低circ-FoxO3的反义链

<400> 13

auggaguucu gcuuugcccu u 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 对照序列的正义链

<400> 14

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 对照序列的反义链

<400> 15

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> circ-FoxO3探针

<220>

<221> CY5标记

<222> (1)..(1)

<400> 16

tgtgccggat ggagttctgc tttgcccact tc 32