一种游离核酸提取自动化机台及游离核酸提取试剂盒

技术领域

本发明是涉及一种核酸提取技术，特别是有关于可以用于由大体积的生物检体溶液中提取游离核酸的核酸提取自动化机台及应用于核酸提取自动化机台的游离核酸提取试剂盒。

背景技术

早在1948年，Mandel等人研究发现了外周血中有游离核酸，但在当时因核酸是否是遗传物质还没有被定论，而没有引起人们的关注。然而，随着研究的深入，科学家们意识到游离核酸不仅可以应用于胎儿性别、RHD血型、Y染色体连锁的遗传疾病的诊断与预防，还可以应用于检测肿瘤、癌症的发生以及骨髓移植后嵌合状态的研究。在1989年，Stroun等人研究显示出游离核酸中部份基因具有肿瘤组织基因的类似特征。于几年后。Vasioukhin等人研究于血浆游离核酸中发现了突变的N-ras，进一步为两者之间的相关性提供了依据。据此，游离核酸开始被用作一种预测肿瘤发生的新型生物标记。

近几年，除肿瘤之外的其他疾病也出现了游离核酸的研究报导，如急性(心脑血管疾病)或是恶性疾病(系统性免疫疾病)、需机械通气危重症、中风、脊髓小脑性共济失调、心肌梗塞、急性登革热病等。游离核酸对产前诊断同样具有重要意义。Lo等人的研究认为，在免疫学上胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体，可能在母体血浆中存在游离的胎儿DNA。

在1997年，Lo等人通过实时PCR从一孕男胎妇女血液游离DNA扩增出胎儿Y染色体特异序列，首次证明了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新的研究路径。随后在1998年，Lo等人又发现胎儿游离核酸在妊娠早期便存在于孕妇血液中，且胎儿游离核酸浓度会随着孕周的延长而增加。同年，Lo等人建立了方法，检测孕中期RhD阴性孕妇外周血中是否存在RhD基因，从而揭开了利用母体血浆中游离胎儿DNA进行产前诊断研究的序幕。此外，游离核酸还可用于三体综合症、地中海贫血症、连锁遗传性疾病和早产的产前诊断。

目前提取核酸的方法主要有苯酚-氯仿抽提法，硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。苯酚-氯仿抽提法发展的较早，使用比较广泛。其主要的原理是基于DNA在不同溶剂中的溶解行为的不同来达到分离及纯化DNA的目的，其优点在于提取DNA产率较高及成本低廉，但是主要的缺点在于费时费力，提取出来的DNA纯度不高，大量使用有毒溶剂，难以实现自动化操作。目前市面商品化核酸提取试剂盒大多采用硅膜离心吸柱方法，此方法简单快速，能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但是对于游离核酸提取效率偏低，且成本较高，同时需要高速离心，并不适合临床常规使用和高通量操作。

而磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法，其主要原理是在磁珠(主要为铁氧体)表面通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有－COOH、－NH

此外，目前对于血浆中的游离核酸做自动化提取的缺陷在于，在血浆中的游离核酸量很少，若应用于目前的核酸自动化提取机台需要相当大量的生物检体溶液体积(4ml－5ml)来进行裂解、在裂解之后由于游离核酸的体积量极微量，在后续的清洗、冲脱等纯化步骤又需要更换较小体积的试管及试剂条等设备，使得自动化机台无法实际应用于生物检体溶液中的游离核酸的纯化步骤。

发明内容

根据现有技术的缺陷，本发明主要的目的在于提供一种应用于生物检体溶液内的提取游离核酸的核酸提取自动化机台，在不改变现有核酸自动化提取机台的设备组件的前提下，可以应用于对体积量大的生物检体溶液体积进行游离核酸进行提取的技术，

本发明的再一目的是利用第一阶段的固相载体对生物检体溶液中的游离核酸先进行浓缩，再利用第二阶段的固相载体将浓缩后的游离核酸进行纯化，利用两阶段式固相载体吸附游离核酸的提取率可以高达90％。

本发明的又一目的是利用两阶段不同盐离子浓度的洗脱溶液对带有游离核酸的固相载体进行洗脱，以提高游离核酸的提取率，其中第二阶段的洗脱溶液的盐离子浓度小于第一阶段的洗脱溶液的盐离子浓度，使得在完成第二阶段洗脱之后所提取的具有游离核酸的溶液可以直接进行后续的实验及检测。

本发明的另一目的在于对生物检体溶液中的游离核酸进行提取的过程中，所有的工作溶液不需要调整酸碱值，即可在该工作溶液的本身条件下进行操作，以降低对游离核酸的破坏，而提高游离核酸的提取效率。

根据上述目的，本发明揭露一种游离核酸提取自动化机台，其特征在于，至少包含:预处理试管架、承载槽、多根预处理试管、第一结合溶液槽、纯化试管架、多根纯化试管、第一洗脱溶液槽、裂解液容置槽、第二结合溶液槽、第二洗脱溶液槽、多根配置有枪头的注射活塞、以及磁吸装置，其中，

预处理试管架，预处理试管架设置于工作台上，且预处理试管架设置有多个预处理试管槽；

承载槽，具有多个槽位用以容置多根具有游离核酸的生物检体溶液的检体试管；

多根预处理试管，各预处理试管置放在预处理试管架的各预处理试管槽内，且各预处理试管内具有第一固相载体；

第一结合溶液槽，具有多个槽位，且各槽位内容置有第一结合溶液；

纯化试管架，设置于工作台上，且纯化试管架设置有多个纯化试管槽；

多根纯化试管，各纯化试管置放在纯化试管架的各纯化试管槽内，且各纯化试管内具有第二固相载体；

第一洗脱溶液槽，用以容置第一洗脱溶液；

裂解液容置槽，用以容置裂解液；

第二结合溶液槽，具有多个槽位，且各槽位内容置有第二结合溶液；

第二洗脱溶液槽，用以容置第二洗脱溶液，其中在第一洗脱溶液槽内的第一洗脱溶液的盐离子浓度大于在第二洗脱溶液槽内的第二洗脱浓度的盐离子浓度；

多根配置有枪头的注射活塞，设置于活塞平台，且活塞平台设置在装置本体的机架上；以及

磁吸装置，设置于各预处理试管及各纯化试管的侧边用以吸附在各预处理试管内的第一固相载体及在各纯化试管内的第二固相载体；

其中，注射活塞透过枪头由第一结合溶液槽内吸取第一结合溶液并容置于具有第一固相载体的预处理试管内，再由检体试管中抽吸具有游离核酸的生物检体溶液的所需体积，并且将抽吸后的具有游离核酸的生物检体溶液置放于具有第一固相载体及结合溶液的各预处理试管中，使得具有游离核酸的生物检体溶液与第一固相载体及第一结合溶液混合，当磁吸装置设置在各预处理试管的管壁，磁吸装置吸附在各预处理试管内的第一固相载体，注射活塞透过枪头将各预处理试管内的第一残留溶液抽吸以排出于各预处理试管，据此注射活塞透过枪头重复由第一结合溶液槽内吸取第一结合溶液并容置于具有第一固相载体的预处理试管内，再由检体试管中抽吸所需体积的具有游离核酸的生物检体溶液，并且将抽吸后的具有游离核酸的生物检体溶液置放于具有第一固相载体及第一结合溶液的各预处理试管中，使得具有游离核酸的生物检体溶液与第一固相载体及第一结合溶液混合，当磁吸装置设置在各预处理试管的管壁以吸附在各预处理试管内的第一固相载体，注射活塞透过枪头将各预处理试管内的第一残留溶液抽吸以排出于各预处理试管直到生物检体溶液都与第一结合溶液混合并且在生物检体溶液内的游离核酸都被第一固相载体吸附，使得第一固性载体吸附所有在生物检体溶液中的游离核酸为止，且各注射活塞透过枪头由第一洗脱溶液槽内吸取第一洗脱溶液并容置于具有第一固相载体的各预处理试管内，使得第一洗脱溶液将游离核酸由第一固相载体上脱附并溶于第一洗脱溶液以形成第一混合溶液；注射活塞透过枪头吸取第一混合溶液后移至具有第二固相载体的各纯化试管内，注射活塞透过枪头分别由裂解液容置槽吸取裂解液及由第二结合溶液槽吸取第二结合溶液并容置于具有第二固相载体及第一混合溶液的各纯化试管内，使得裂解液、第二结合溶液与第一混合溶液进行结合，并使游离核酸被第二固相载体吸附，注射活塞透过枪头吸取第二洗脱溶液对带有游离核酸的第二固相载体进行洗脱，磁吸装置设置在各纯化试管的管壁以吸附第二固相载体，具有枪头的注射活塞吸取在各纯化试管内的第二残留溶液，其中第二残留溶液为具有游离核酸的提取溶液。

本发明还揭露一种用于核酸提取自动化机台的游离核酸提取试剂盒，其特征在于，游离核酸提取试剂盒包含：用于与具有游离核酸的生物检体溶液结合的第一结合溶液、表面具有季铵盐的第一固相载体、具有盐离子浓度范围为0.6M－1.4M的第一洗脱液、裂解液、第二结合溶液、第二固相载体、以及第二洗脱溶液，其中，表面具有季铵盐的第一固相载体用以与具有游离核酸的生物检体及第一结合溶液结合，使得第一固相载体吸附被季铵盐包覆的游离核酸；第一洗脱溶液用以对带有游离核酸的第一固相载体进行洗脱以得到第一混合液；裂解液及第二结合溶液与第一混合液结合以形成第二混合液；第二固相载体，用以与第二混合液混合，使得在第二混合液中的游离核酸被第二固相载体吸附；以及第二洗脱溶液，用以对带有游离核酸的第二固相载体进行洗脱，使得游离核酸溶于第二洗脱溶液中以得到第三混合溶液，其中第一洗脱溶液的盐离子浓度大于第二洗脱溶液的盐离子浓度。

附图说明

图1是根据本发明所揭露的技术，表示游离核酸提取自动化机台的方块图。

图2根据本发明所揭露的技术，表示游离核酸提取试剂盒的方块图。

图3是根据本发明所揭露的技术，表示游离核酸提取自动化机台的操作方法的步骤流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，在此配合所附的图式、具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举较佳实施例进一步说明。以下文中所对照的图式，为表达与本发明特征有关的示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制。而关于本案实施方式的说明中涉及本领域技术人员所熟知的技术内容，亦不再加以陈述。

由于在生物检体溶液中的游离核酸的量极其微少，为了在后续有足够的游离核酸的量来进行的分析及/或诊断，因此要进行游离核酸提取的生物检体溶液的体积就要相对的提高，一般来说需要4ml-5ml体积容量，若利用现有的核酸提取机台来做游离核酸的提取，则需要针对大体积的生物检体溶液来更换零件，或是另外再添购适用于大体积检体溶液的核酸提取机台，对于使用者来说是相当耗成本的一件事情。因此，在本发明中，揭露了可以应用于大体积的生物检体溶液的核酸提取机台，让使用者可以不需要更改任何零件就可以针对大体积的生物检体溶液来进行提取程序，降低用户器材成本，同时在游离核酸的提取过程中依然可以采取自动化的方式来完成。

首先请参考图1。图1是表示核酸提取自动化机台的方块示意图。在图1中，核酸提取自动化机台1至少包括预处理试管架10、承载槽12、第一结合溶液槽14、纯化试管架16、第一洗脱溶液槽18、裂解液容置槽20、第二结合溶液槽15、第二洗脱溶液槽22、多根配置有枪头242的注射活塞24、以及磁吸装置26，以上述组件均设置在核酸提取自动化机台1的工作平台(未在图中表示)上，由于本发明的游离核酸提取的方式是直接可以适用于现有的核酸提取自动化机台，因此其各组件之间的位置均与现有技术中的核酸提取机台的设计是相同的，所以在本发明中上述各组件之间的位置关系并不做详细说明，仅在以下陈述各组件在本发明中的功能。

预处理试管架10，设置有多个预处理试管槽(未在图中表示)，每一个预处理试管槽用以容置预处理试管102，且在预处理试管102内具有第一固相载体30，在本发明的实施例中，第一固相载体30为阴离子交换磁珠，较优选的是，阴离子交换磁珠的表面具有季铵盐。

承载槽12，具有多个槽位(未在图中表示)用以容置多根具有游离核酸的生物检体溶液的检体试管122，在此生物检体溶液可以是血液或是血浆。

第一结合溶液槽14，具有多个槽位(未在图中表示)，每一个槽位内容置有第一结合溶液142，在本发明中第一结合溶液142为具有Tris-HCl100mM:0.1M及盐溶液500mM:0.5M的结合溶液142，其中盐溶液可以是氯化钠(NaCl)或是氯化钾(KCl)。

纯化式管架16，具有多个纯化试管槽位(未在图中表示)，用以容置纯化试管162，且在每一根纯化试管162内置放有第二固相载体32，其中第二固相载体32为羧基改质的磁珠。

第一洗脱溶液槽18，用以容置第一洗脱溶液，其中第一洗脱溶液为具有盐离子浓度范围为0.8M-1.6M的洗脱溶液。在本发明较优选的实施例中，盐离子可以是氯化钠或是氯化钾。

裂解液溶置槽20，用以容置裂解液。在本发明的实施例中，所使用的裂解液可以是SDS、盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾；裂解液的其他成分包括：曲拉通(Triton X-100)，壬基酚聚氧乙烯醚(ΝΡ-40)，吐温-20(Tween-20)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)及乙二胺四乙酸(EDTA)。

第二结合溶液槽15，具有多个槽位(未在图中表示)，每一个槽位内容置有第二结合溶液152，其中第二结合溶液可以是盐酸胍或者异硫氰酸胍，20％_40％(v/v)异丙醇或者是无水乙醇，5mM-20mM EDTA。

第二洗脱溶液槽22，用以容置第二洗脱溶液。在本发明较优选的实施例中，第二洗脫溶液的离子濃度小于第一洗脫溶液的离子濃度。

多根配置有枪头242的注射活塞24，注射活塞24是透过枪头242在整个游离核酸提取程序中吸取工作溶液例如生物检体溶液、第一结合溶液142、第一洗脱溶液、裂解液、第二结合溶液152以及第二洗脱溶液，并将这些工作溶液置放在预处理试管102及/或纯化试管162内以进行游离核酸提取程序，对于上述吸取工作溶液及置放工作溶液进行游离核酸提取的详细程序在后续说明。

磁吸装置26，设置于各预处理试管及各纯化试管的管壁，用以在游离核酸提取的过程中，以吸附在预处理试管102的第一固相载体30及在纯化试管162内的第二固相载体32。

在此，要再对多根配置有枪头242的注射活塞24在本发明的游离核酸提取自动化机台1的操作做进一步的说明。注射活塞24透过枪头242由第一结合溶液槽14内吸取第一结合溶液142，并将第一结合溶液142容置于具有第一固相载体30的预处理试管102内。接着，再由检体试管122中抽吸具有游离核酸的生物检体溶液的所需体积，并且将抽吸后且具有游离核酸的生物检体溶液置放于具有第一固相载体30及已经置放有第一结合溶液142的每一根预处理试管102中，使得具有游离核酸的生物检体溶液与第一固相载体30及结合溶液142进行混合，由于第一结合溶液142为具有Tris-HCl100mM:0.1M及盐溶液500mM:0.5M的结合溶液，其盐溶液中的盐离子会包覆生物检体溶液中的游离核酸，此步骤可视为对游离核酸的浓缩，又由于本发明中所使用的第一固相载体30为表面具有季铵盐的阴离子交换磁珠，可利用此阴离子交换磁珠表面的季铵盐吸附被盐离子包覆的的游离核酸，使得游离核酸可以由生物检体溶液中的提取(或称为纯化)出来。

接着，将磁吸装置26靠近设置在每一根预处理试管102的管壁，特别是管柱的底部(即溶液与第一固相载体存在的位置)，利用磁吸装置26吸附在每一根预处理试管102内的第一固相载体30，使得具有被盐离子包覆的游离核酸的第一固相载体30由第一结合溶液142与生物检体溶液的混合溶液中分离出来，具体来说，第一固相载体30是借由磁吸装置26被吸附在预处理试管102的管壁(未在图中表示)上。接着，注射活塞24透过枪头242将每一根预处理试管102内的混合溶液(亦可称为残留溶液)抽吸以排出于各预处理试管102。接着，再经由具有枪头242的注射活塞24重复由第一结合溶液槽14内再吸取第一结合溶液142并容置于具有第一固相载体30的预处理试管102内，再由检体试管122中抽吸所需体积的具有游离核酸的生物检体溶液，并且将抽吸后的具有游离核酸的生物检体溶液置放于具有第一固相载体及第一结合溶液142的各预处理试管102中，使得具有游离核酸的生物检体溶液与第一固相载体及第一结合溶液142混合。在此步骤中，由于游离核酸在生物检体溶液中的量很少，因此需要相当大量的生物检体溶液体积例如4ml-5ml来做为提取游离核酸的工作溶液，然而大体积的工作溶液并不能适用于现有核酸提取自动化机台，因此在本发明中，注射活塞24透过枪头242吸取检体试管122的生物检体溶液的量每一次为1ml，因此在提取游离核酸的过程中，注射活塞24透过枪头242每一次吸取1ml的生物检体溶液与第一结合溶液142混合，并由第一固相载体30吸附生物检体溶液内的游离核酸，据此，重复上述步骤，可以将大体积的生物检体溶液分次的与结合溶液142结合而被盐离子所包覆，并可透过第一固相载体30批次的吸附这些游离核酸，因此在重复上述步骤之后，第一固相载体30所吸附的游离核酸可以视为在生物检体溶液中的游离核酸的总量。根据上述，本发明不需要改变现有核酸提取自动化机台的任何组件，只需要在核酸提取自动化机台1的工作台或是装置本体(未在图中表示)增加一个置放有生物检体溶液的检体试管122的承载槽12即可。

接着，注射活塞24透过枪头242由第一洗脱溶液槽18内吸取第一洗脱溶液，并容置于具有第一固相载体30的各预处理试管102内，使得第一洗脱溶液对带有游离核酸的第一固相载体30进行洗脱，使得被洗脱的游离核酸溶于第一洗脱溶液以形成第一混合溶液；接着再利用具有枪头242的注射活塞24吸取上述第一混合溶液后移至具有第二固相载体32的纯化试管162内，并且注射活塞24透过枪头242由裂解液容置槽20内吸取裂解液及由第二结合溶液槽15内吸取第二结合溶液152，并将裂解液及第二结合溶液152容置于具有第二固相载体32及第一混合溶液的各纯化试管162内，裂解液、第二结合溶液152与第一混合溶液及第二固相载体32混合，此时由于第一洗脱溶液的盐离子浓度范围为0.8M-1.6M的盐类溶液可以将先前被盐离子所包覆的游离核酸被洗脱出来，而被第二固相载体32吸附。同样的利用磁吸装置26设置靠近在各纯化试管162的管壁以吸附纯化试管162内的第二固相载体32，使得带有游离核酸的第二固相载体32由上述的混合溶液中分离出来。同样地，再利用注射活塞24透过枪头242将残留在纯化试管162内的混合溶液抽吸以将混合溶液排出纯化试管162，仅保留带有游离核酸的第二固相载体32。接着，具有枪头242的注射活塞24由第二洗脱溶液槽22中吸取第二洗脱溶液，并对带有游离核酸的第二固相载体32进行洗脱，使得游离核酸由第二固相载体32上洗脱下来并溶于第二洗脱溶液中。最后，再利用磁吸装置26将第二固相载体32予以吸附于纯化试管162的管壁上，在移除第二固相载体32之后，即得到具有游离核酸的第二混合溶液。第二洗脱溶液的目的是脱盐洗涤，其洗涤次数可以视需要而设计，至少1-4次，较佳的是1-2次，借由第二洗脱溶液所洗脱得到具有游离核酸的第二混合溶液，且其游离核酸的提取率可高达90％，此第二混合溶液亦可以直接供应下游进行检测。

接着，请参考图2，图2表示游离核酸提取试剂盒的方块图。在图2中，游离核酸提取试剂盒5是用于前面所述的核酸提取自动化机台1以对生物检体溶液中的游离核酸进行提取，其游离核酸提取试剂盒5包括有:结合溶液52、表面具有季铵盐的第一固相载体54、第一洗脱溶液56、裂解液58、第二结合溶液60、第二固相载体62以及第二洗脱溶液64，其中，第一结合溶液52用于与具有游离核酸的生物检体溶液结合，其为具有Tris-HCl100mM:0.1M及盐溶液500mM:0.5M的结合溶液；表面具有季铵盐的第一固相载体54，用以与具有游离核酸的生物检体溶液及第一结合溶液52结合，使得第一固相载体表面的季铵盐可以吸附已经被第一结合溶液52中的盐离子所包覆的游离核酸；第一洗脱液56则是对带有游离核酸的第一固相载体54进行洗脱，使得游离核酸由第一固相载体54上洗脱下来并溶于第一结合溶液及第一洗脱溶液56所混合的第一混合液中。在本发明中，第一洗脱溶液56为具有盐离子浓度范围为0.8M－1.6M的洗脱溶液；裂解液58及第二结合溶液60与前述的第一混合液结合以形成第二混合液；第二固相载体62，用以与前述的第二混合液结合，使得在第二混合液中的游离核酸可以被第二固相载体62吸附，其中第二固相载体62为表面具有羧基改质的磁珠；以及第二洗脱溶液64，用以对带有游离核酸的第二固相载体62进行冲洗，使得游离核酸被第二洗脱溶液64由第二固相载体62上洗脱下来而溶于第二洗脱溶液64中，其中第二洗脱溶液64的盐离子浓度小于第一洗脱溶液56的盐离子浓度，在本发明中，先利用第一阶段中低盐的第一固相载体与游离核酸结合，再利用含盐离子浓度较高的第一洗脱溶液56对被盐离子结合的游离核酸进行洗脱而由生物检体溶液中提取出来，此步骤可视为浓缩的概念。第二阶段则是利用含有高盐的第二固相载体结合，但是利用含盐离子浓度较低的第二洗脱溶液62对于在第二固相载体60上的游离核酸进行脱盐洗涤，因此，经过上述两个阶段所提取得到的游离核酸的提取率可高达80％。而在上述的游离核酸提取试剂盒5中的还可以包括核酸辅助剂用以增加结合效率，其中核酸辅助剂可以是carrier RNA。

因此，根据上述的游离核酸提取机台1及游离核酸提取试剂盒5，本发明还揭露一种游离核酸提取自动化的步骤流程图，请参考图3。图3是表示使用本发明的应用于游离核酸提取自动化机台的游离核酸提取自动化方法的步骤流程图，在说明图3时也一并配合图1来进行说明以并能容易理解本发明的技术。

在图3中，步骤70：提供生物检体溶液。于此步骤中，生物检体溶液为具有游离核酸的溶液，例如血液，血浆或是血清，如果是针对胎儿的诊断亦可以是怀孕母亲的羊水。在本发明的较优选的实施例中，则是以血液作为提取游离核酸的生物检体溶液。在此步骤中，生物检体溶液是置放在如图1中所示的承载槽12的检体试管122内，在本发明的实施例中，其生物检体溶液的工作体积为4ml－5ml。

步骤72:吸取1ml的生物检体溶液并置放在具有第一固相载体及第一结合溶液的预处理试管内。在此步骤中，利用注射活塞24透过枪头242吸取体积为1ml的生物检体溶液至置放在预处理试管架10、且具有第一固相载体32及第一结合溶液142的预处理试管102内，由于游离核酸提取自动化机台1是使用一般的核酸提取自动化机台，其处理的工作溶液的体积(或是容积)不大，大多都是小于1ml，但是由于游离核酸在生物检体溶液中的量极微少，因此需要较大体积的生物检体溶液才能够取得一定量的游离核酸来做后续的分析，但是大体积的生物检体溶液无法直接应用于现有的核酸提取自动化机台，因此在本发明中，利用多次吸取与一般进行核酸提取方法的相同量的生物检体溶液来进行游离核酸的提取。此外，第一结合溶液为浓度为具有Tris-HCl 100mM:0.1M及盐溶液500mM:0.5M的结合溶液，第一固相载体32为表面具有季铵盐的第一固相载体，其第一固相载体为阴离子交换磁珠，在本实施例中，利用第一结合溶液与生物检体溶液混合，游离核酸被做为第一固相载体的表面具有季铵盐的阴离子交换磁珠表面来吸附，使得游离核酸可以由生物检体溶液中被分离出来。于本发明的另一较优选的实施例中，在此步骤中还可以加入结合辅助剂，例如Carrier RNA，使得即使小于500bp的游离核酸片段也能有超过90％的提取率。

步骤74：将第一固相载体与溶液分离，保留带有游离核酸的第一固相载体。在此步骤中，即利用磁吸装置26靠近在预处理试管102的管壁以利用磁力将带有游离核酸的第一固相载体30由步骤72的溶液中分离出来，并且利用注射活塞24的枪头242将这些溶液(残留溶液)吸取并排出，仅保留带有游离核酸的第一固相载体30在预处理试管102内。

要说明的是，在步骤70－步骤74的过程中，带有游离核酸的第一固相载体30不经过洗涤步骤。

步骤76:重复步骤72－步骤74，直至所有工作体积的生物检体溶液都与第一固相载体及第一结合溶液结合，且在所有工作体积的生物检体溶液中的游离核酸都被第一固相载体所吸附。在此要说明的是，如同前述，由于游离核酸提取自动化机台1是使用一般的核酸提取自动化机台，其处理的工作溶液的体积(或是容积)不大，大多都是小于1ml，但是由于游离核酸在生物检体溶液中的量极微少，因此需要较大体积的生物检体溶液才能够取得一定量的游离核酸来做后续的分析，但是大体积的生物检体溶液无法直接应用于现有的核酸提取自动化机台，因此在本发明中，利用多次吸取与一般进行核酸提取方法的相同量的生物检体溶液来进行游离核酸的提取。所以在利用注射活塞24透过枪头242吸取1ml的生物检体溶液与第一固相载体30及第一结合溶液142混合，并将带有游离核酸的第一固相载体30与溶液分离之后，再重复吸取1ml的生物检体溶液及第一结合溶液142置放在具有第一固相载体30的预处理试管102内，此时的第一固相载体30已带有游离核酸，再与后续置放在预处理试管102内的生物检体溶液及第一结合溶液142混合，让第一固相载体30再吸附新加进来的生物检体溶液中的游离核酸。因此，最后第一固相载体30带有游离核酸的量应该是相同或近似于进行游离核酸提取的生物检体溶液的工作体积中所包含的游离核酸的量。之后，再将带有游离核酸的第一固相载体30与溶液分离。并且重复上述步骤，直到所有工作体积的生物检体溶液都与第一结合溶液142及第一固相载体30混合，且在大的工作体积的生物检体溶液中的游离核酸可以经由批式的混合及吸附而使得游离核酸的提取率可以提高。

接着步骤78:将带有游离核酸的第一固相载体与第一洗脱溶液混合，并将第一固相载体移除以得到具有游离核酸的第一混合溶液。在此步骤中，将带有游离核酸的第一固相载体30与第一洗脱液混合，让具有盐离子浓度为0.8M－1.6M的第一洗脱溶液对带有游离核酸的第一固相载体30进行洗脱，使得在第一固相载体30上的被盐包覆的游离核酸因与高盐离子浓度的第一洗脱溶液混合而被盐离子由第一固相载体30上洗脱下来，而溶于第一洗脱溶液中。接着，利用磁吸装置26靠近在预处理试管102的管壁上，使得第一固相载体30(此时第一固相载体30已不再带有游离核酸)。再利用注射活塞24经由枪头242将具有游离核酸的第一洗脱溶液的混合溶液由预处理试管102吸取并移至纯化试管162进行下一阶段游离核酸提取步骤。

步骤80：将步骤78得到的混合溶液(具有第一洗脱液与游离核酸)与、裂解液、第二结合溶液及第二固相载体结合，利用第二固相载体吸附溶液中的游离核酸。在此步骤中，纯化试管162内置放有裂解液、第二结合溶液152及第二固相载体32，利用第二固相载体32吸附前述混合溶液中的游离核酸，在此阶段所使用的第二固相载体32与前述的第一固相载体30不同，第二固相载体32为表面具有羧基改质的磁珠，此磁珠的特性是利用亲疏水性的特性来结合核酸，所以可以简单利用疏水性的介质来造成游离核酸和磁珠的结合，例如乙醇、异丙醇、PEG等，然后再利用亲水介质(例如:水)来将游离核酸从磁珠上脱离，这样提取的游离核酸就可以直接被下游检测使用。要说明的是，若是一开始就利用表面具有羧基改质的磁珠32来吸附游离核酸，一旦生物检体溶液中的游离核酸样品浓度太低会造成游离核酸的提取很差，所以在本发明中，是将此种磁珠应用在第二阶段的游离核酸提取的步骤中，而不是直接使用在游离核酸的生物检体溶液。另外，在此步骤中为了要增加结合效率，可以加入核酸辅助剂，例如carrier RNA。

步骤82：对带有游离核酸的第二固相载体进行脱盐洗涤以得到具有游离核酸的提取溶液。在此步骤中，先将在前述带有游离核酸的第二固相载体32同样利用磁吸装置26靠近纯化试管162的管壁而将第二固相载体32由溶液(残留溶液)中分离出来，再利用注射活塞24经由枪头242将残留溶液由纯化试管162吸取并且排出，保留带有游离核酸的第二固相载体32。再利用第二洗脱溶液对带有游离核酸的第二固相载体32进行脱盐洗涤，使得游离核酸由第二固相载体32上洗脱下来溶在第二洗脱溶液里。在此步骤中，第二洗脱溶液的盐离子浓度低于第一洗脱溶液，其目的是要将被盐包覆的游离核酸进行脱盐，因此游离核酸从第二固相载体上脱离之后，所提取到的游离核酸就可以直接给予下游检测使用。

根据上述可以得知，在本发明中，生物检体溶液或是工作溶液都不需要经过酸碱值的调控，即游离核酸的提取率不会受到酸碱值的影响，而是与盐类离子浓度有关。

因此，根据上述，本发明是利用两种不同的固相载体来提取在生物检体溶液中的游离核酸，其中第一固相载体为低盐结合，高盐洗脱；第二套磁珠为高盐结合，低盐洗脱。第一固相载体的优点在于即使生物检体溶液中的游离核酸浓度很低都具有很高的核酸结合力，提取率高达90％。然而，由于需要高盐来洗脱在第一固相载体上的游离核酸，无法将洗脱后的游离核酸直接应用于下游的检测，因此使用第一固相载体的目的是将生物检体溶液中的游离核酸予以浓缩。接着利用第二固相载体是在低盐或甚至于无盐的状况下来进行洗脱，所以经由洗脱后的游离核酸的提取率高达80％以上，且提取后的游离核酸可以直接进行下游的检测，因此第一固相载体是用于浓缩，第二固相载体则是进行对游离核酸进行一般的纯化步骤(亦或称为提取)，再搭配自动化就可以在自动化的状况且不需要改变任何自动化设备的前提就可以达到游离核酸提取的目的。

以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明之权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域之专门人士应可明了及实施，因此其他未脱离本发明所揭示之精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在申请专利范围中。