一种C20-二萜生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及含N杂环化合物，具体涉及C

背景技术

噁唑环-N-C(20)-O-C(7)-阿替生型生物碱在自然界分布极少，自2001年从翠雀属植物 Delphinium virgatum的全草中分离得到了第一个噁唑环-N-C(20)-O-C(7)-阿替生型生物碱Atisine(Mericli A H,Mericli F,Desai H K.Diterpenoid Alkaloids fromDelphinium virgatum Poiret. Chinese Chemical Letters,Die Pharmazie,2001,32(32):418-419.)。随后从同属植物Delphinium chrysotrichum的全草中也分离得到了两个噁唑环-N-C(20)-O-C(7)-阿替生型生物碱delphatisine A和delphatisine B(YangqingHe,Xiaomei Wei,Yili Han,Liming Gao.Two new diterpene alkaloids fromDelphinium chrysotrichum.Chinese Chemical Letters,2007,18(5):545-547)。二萜生物碱具有重要的生物活性，其中不乏有关附甲素等已被开发成临床药物的典型代表。其复杂结构和显著的生物活性自上世纪60年代便引起了合成化学家们的广泛关注，然而由于二萜生物碱骨架拥挤、刚性较强，取代复杂，手性中心众多，合成极具挑战性，尽管已有超过1200个二萜生物碱被分离鉴定，但实现全合成的化合物不超过30个。上述研究均聚焦在该类化合物的分离鉴定和全合成上，并未有对其生物活性的研究。综上所述，目前有关C

囊距翠雀为毛茛科翠雀属植物囊距翠雀(Delphinium brunonianum Royle)的干燥地上部分，多年生草本植物，分布于中国西北地区，包括西藏自治区、青海和甘肃省，海拔4500-6000 米的高山多石处，具有凉血解毒，祛风止痒的功效，主治流感、各种传染病、肝胆病、皮肤痒疹、蛇咬伤等(中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志[M].科学出版社,1979,27.)。截止目前，国内外学者从囊距翠雀所属的翠雀属植物中分离鉴定出约100个C

有关囊距翠雀的化学研究报道较少，据《藏药志》记载该植物所含化学成分主要为生物碱、有机酸、糖类及粘液质(杨永昌,等.藏药志.第1版[M].西宁:青海人民出版社，1991年)。迄今为止，自囊距翠雀中共分离并鉴定了15个生物碱类成分，分别为C

发明内容

本发明要解决的技术问题提供一种C

本发明要解决上述问题的技术方案是：

一种C

本发明所述的C

本发明所述的C

(1)取囊距翠雀全草(干燥的地上部分)，依次用15和10倍(即乙醇的体积为囊距翠雀重量的倍数。如果囊距翠雀的重量单位便是kg，乙醇的体积单位是L；若囊距翠雀的重量单位则是g，乙醇的体积单位则是ml。)体积浓度为80％的乙醇分别回流提取2h，合并乙醇提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，得总浸膏；

(2)将总浸膏溶解于水中，然后，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，取醋酸乙酯萃取液，减压浓缩，除去溶剂，得醋酸乙酯萃取物；

(3)将醋酸乙酯萃取物拌匀于空白硅胶中，过硅胶柱，依次用二氯甲烷︰甲醇＝100︰1～ 2︰1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；收集二氯甲烷︰甲醇＝10︰1的二氯甲烷-甲醇洗脱液，过Sephadex LH-20的葡聚糖凝胶柱，以体积浓度为80％的甲醇为溶剂洗脱所述的葡聚糖凝胶柱，收集洗脱液，浓缩后得到无色针状结晶，即得所述的C

上述分离方法中所述的囊距翠雀是一种来源于毛茛科翠雀属植物囊距翠雀(Delphinium brunonianum Royle)的干燥地上部分。

本发明所述的C

本发明所述的C

下面通过实验来证明(Ⅰ)式所示C

1.实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，6周龄，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK (粤)2018-0034。

2.试验药物

阳性药：阿托伐他汀钙，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，生产批号：B1419089；给药组药物：实施例3所制备的胶囊；阳性药和给药组药物临用前均用0.3％的羧甲基纤维素钠混悬；高脂饲料，购自北京杰美生物科技有限公司，生产批号：20050104。

3.动物分组

6周龄的雄性C57BL/6小鼠在适应环境4天后，称量体重，随机分为空白组、模型组、给药组和阳性药组，每组6只。

4.小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型的建立方法

本申请采用小鼠给予高脂饲料喂养造模，空白组小鼠给予正常饲料饲养，模型组、给药组和阳性药组给予高脂饲料喂养，造模时长为4个月，除饲料不同外，其余条件均平行。

造模完成后开始灌胃给药，给药组和阳性药组的给药量均按照10mg/kg计，折合成给药体积为0.2ml/10g；空白组和模型组按照同样剂量灌胃超纯水。

5.观察指标

5.1小鼠代谢行为学情况

小鼠称重、灌胃后，单笼单只置于代谢笼中。代谢笼置于温控箱中，内可调节温度、湿度、光照等不同的环境条件，外与外界计算机系统连通，可以实时检测小鼠的耗氧量、二氧化碳排放量、活动率、体温、摄食摄水量等代谢数据。以此评价本发明所述化合物brunodelphinine A对小鼠能量代谢情况的影响。

5.2糖代谢水平评价

5.2.1葡萄糖耐量测试

小鼠于实验前预先禁食12h，正式实验时全程不喂食不喂水。正式实验时，小鼠称重，于尾尖2mm处剪断，轻轻挤出一滴血，滴在已插入微量血糖测试仪的血糖试纸上，读取测试仪读数，记录为0时的血糖值。随后按照2g/kg的剂量，对小鼠腹腔注射葡萄糖溶液(0.4g/ml)，以注射完成时刻为0点，马上开始计时。随后在15、30、60、90、120min时间段分别测定小鼠血糖，测定方法同前，在已有伤口处轻轻挤出血滴即可，不需重复剪尾。记录各小鼠在不同时间点的血糖值。

5.2.2胰岛素耐量测试

小鼠于实验前预先禁食4h，正式实验时全程不喂食不喂水。正式实验时，小鼠称重，按照5ul/g给药量腹腔注射胰岛素溶液(配制方法同1.2)。于给药后0、15、30、60、90、120min 分别检测小鼠的血糖值。取血方法同GTT.

5.3生化指标检测

5.3.1血清生化指标检测

采用试剂盒法对小鼠血清中AST、ALT、TG、TC等指标水平进行测定。

5.3.2肝组织匀浆液炎症因子检测

取各组小鼠肝脏，用预冷的PBS冲洗组织，去除残留血液，于冰上将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS按照1:9的重量体积比(1mg的样本对应9ml的PBS)加入匀浆机中，充分研磨。将研磨所得匀浆液于3500rpm离心10min，取上清液即得。检测时取50ul 肝匀浆上清液，加入4倍量样本稀释液，即得。采用ELISA试剂盒法对肝组织匀浆液中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达水平进行测定。

5.4肝脏病理切片的制作

将各组小鼠的肝组织从10％中性福尔马林中取出，使用带刀柄的切片刀在肝组织上以纵切的方式，从中间开始快速切下4～6mm厚的组织，两侧切口保持平行。将切下的组织放置在包埋盒中，置于脱水机中脱水，使用包埋机包埋，冷冻切片机4μm厚连续切片，切片小心的放置于45℃热水中展片，使组织部分充分展开。使用载玻片贴住展开后的切片，置于烤板机上烘干，HE手动染色，染色完成后用中性树脂封片。于显微镜下观察肝脏组织脂肪性样变、炎性浸润等病理现象。

5.5 RT-PCR检测糖脂代谢相关蛋白基因表达

使用Trizol reagen提取小鼠肝匀浆液，在肝匀浆液中加入氯仿，剧烈振摇，4℃离心10min (12000×g)，转移70％水相(上清液)到无酶EP管中，加入0.5倍体积异丙醇，涡旋15s， 4℃离心10min(12000×g)，弃去上清液。加入75％乙醇(灭活DEPC水+无水乙醇配制)清洗RNA，4℃离心5min(7500×g)，弃去上清液，室温晾干，冰上加RNAase-free水复溶RNA，使用Nanodrop超微量分光光度计测定RNA纯度及浓度。

所得样本RNA用于real-time PCR实验，使用SYBR一步法检测肝组织中糖脂代谢相关蛋白的基因表达变化，操作按照试剂盒说明书进行。具体反应体系如下表，反应条件及程序见图24。

6.实验结果

6.1 brunodelphinine A能够调控小鼠的能量代谢

6.1.1 HFD与给药组小鼠代谢行为观测指标比较

HFD小鼠经brunodelphinine A干预治疗后，与模型组小鼠相比，其呼吸代谢明显增加。给药组小鼠的耗氧量、二氧化碳排放量、RER和产热量都有显著性的改善。这证明小鼠体内的能量代谢确实得到了促进。同时通过RER的数据可以看出，给药组小鼠除有氧呼吸中的糖代谢得以促进外，脂质作为呼吸底物参与代谢的情况也多于模型组小鼠，这证明给药组小鼠的脂质代谢亦得到了促进，结果见附图1。

6.1.2各组小鼠肝脏样本电镜观察

由电镜图可以看出，空白组、给药组小鼠线粒体结构完整，基质均匀，线粒体内有大量嵴存在，细胞质内密布内质网，无明显脂滴存在。HFD小鼠出现线粒体内室肿胀症状，症见线粒体内嵴大量减少，基质稀薄，此外可见内质网明显减少，这一现象与5.1.1中HFD小鼠代谢活动降低现象相符；给药组小鼠线粒体内嵴数量明显增多，提示线粒体内室肿胀情况得到改善，内质网数量回升；证明治疗组小鼠的代谢率下降的病理现象得到了明显的改善，结果见附图2。

此外HFD小鼠胞腔内密布大量脂滴，这是脂肪肝的典型病理现象。给药组胞腔内脂滴明显减少，也证明肝细胞脂肪变性的现象得到了改善。

6.1.3各组小鼠产热相关蛋白的基因表达情况比较

UCP1是参与能量代谢的重要因子，参与棕色脂肪产热功能，可以增加机体产热量和耗氧量；Dio2促进棕色脂肪细胞增加，调控能量消耗；PPargc1a为棕色脂肪标记物，其表达与棕色脂肪产热水平相关；Prdm16(PR domain containing 16；PR结构域16)可以调控成肌细胞前体向棕色脂肪细胞的分化。

HFD小鼠的肝组织匀浆中，四种产热相关的基因均显著性低表达，证明HFD小鼠的产热效率降低，能量代谢受到了抑制。经过brunodelphinine A治疗后，上述基因水平显著性升高，这证实了本发明所述化合物brunodelphinine A可以促进小鼠的产热功能，结果见附图3。

6.1.4各组小鼠棕色脂肪CT结果比较

与HFD组小鼠相比，给药组小鼠的棕色脂肪有所增加，棕色脂肪具有产热的功能，参与能量代谢，它的增加证明HFD小鼠经给药治疗后，能量代谢得到了促进，结果见附图4。

6.2 brunodelphinine A能够改善HFD小鼠的胰岛素抵抗

6.2.1葡萄糖耐量测试结果

HFD小鼠腹腔注射葡萄糖后，其血糖一直维持在一个较高的水平，与空白组有显著性差异。这说明HFD小鼠体内的血糖调节功能受到了一定的抑制。而给药组小鼠的血糖水平与 HFD小鼠相比显著性下调，证实brunodelphinine A对HFD小鼠的血糖调节有一定的回调作用，结果见附图5。

6.2.2胰岛素耐量测试结果

HFD小鼠腹腔注射胰岛素后，其血糖下降程度较低，与空白组有显著性差异。这说明 HFD小鼠发生了胰岛素抵抗。而给药组小鼠的血糖水平与模型组下降程度较高，证实胰岛素抵抗现象得到了改善，结果见附图6。

6.2.3各组小鼠糖代谢相关蛋白基因表达情况的比较

SLC2A4是一种受胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白，负责在胰岛素刺激下，将细胞外环境中的葡萄糖转移到细胞内加以利用；GSK3β可以受胰岛素调节作用，促进糖原合成，降低血液中的游离葡萄糖浓度；PCK1能够调节柠檬酸循环，AKT1可以通过介导胰岛素诱导的SLC2A4/GLUT4葡萄糖转运蛋白转运，调控葡萄糖摄取，阻止胰岛素受体去磷酸化和胰岛素信号的衰减，同时还可以调控GSK3β进行的糖原合成。

在HFD组中，四种糖代谢相关的基因均显著性下调，这证实模型组小鼠的糖代谢过程受到了明显的抑制，葡萄糖的分解与糖原的合成效率降低，胰岛素的调控作用被削弱，发生了胰岛素抵抗现象。而经过brunodelphinine A治疗，四种基因均得到回调，这证明了本发明所述化合物brunodelphinine A改善HFD诱导的胰岛素抵抗，促进HFD小鼠的糖代谢回归稳定，结果见附图7。

6.3 brunodelphinine A能够改善HFD小鼠的脂质累积

6.3.1 brunodelphinine A能够降低模型小鼠的体重和肝脏指数比

实验结果可知，HFD小鼠的肝脏指数显著性高于正常小鼠，证明HFD小鼠肝脏有明显的脂质累积，显示造模成功。经过给药治疗后，小鼠肝重、体重和肝脏指数比与模型组相比，都明显下调(P＜0.05)，结果见附图8。

6.3.2 brunodelphinine A能够缓解脂质在体内蓄积

HFD小鼠血清内的TG、TC显著性升高，经过治疗后，TG水平显著性下降，证明甘油三酯累积情况得到了缓解，结果见附图9。

6.3.3 brunodelphinine A能够下调小鼠Fabp4基因表达水平

Fabp4为脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 4)，能够起到脂肪标记的作用。实验结果显示，HFD小鼠的肝脏中Fabp4显著性高表达，证明HFD小鼠出现了脂肪累积，经过 brunodelphinine A治疗后，小鼠肝脏Fabp4水平显著性下调，证明小鼠肝脏脂肪累积的现象得到了改善，说明brunodelphinine A可以减轻HFD诱导的小鼠脂质累积现象，结果见附图 10。

6.3.4 brunodelphinine A能够促进脂质代谢相关蛋白mRNA的表达

Mgll能够催化单酰基甘油水解，从而使甘油三酯分解效率增加。

HFD小鼠的肝脏中Mgll显著性低表达，证明HFD小鼠的甘油三酯分解过程受到了抑制，经过brunodelphinine A治疗后，小鼠肝脏Mgll水平显著性回调，这证明brunodelphinine A的干预可以促进小鼠体内的甘油三酯分解，结果见附图11。

酰基辅酶A脱氢酶家族(Acadvl、Acadl、Acadm、Acads)和肉碱棕榈酰转移酶家族(Cpt1b、 Cpt2)都与脂肪酸的氧化分解相关，可以促进脂肪酸代谢。

HFD小鼠Acadl、Acadm、Acads均有降低的趋势，且Acadl、Acads为显著性低表达。而经过给药以后，Acadvl、Acadl、Acads均得到了表达上调的调控，且Acadvl、Acadl为显著性回调。可以推测brunodelphinine A对酰基辅酶A脱氢酶家族的调控作用可能与其链长相关，而HFD诱导对酰基辅酶A脱氢酶家族的影响不稳定。此外HFD小鼠Cpt2、Cpt1b基因亦显著性下调，经给药干预后，Cpt1b显著性回调，而Cpt2也有回调的趋势，但没有显著性， P＝0.08，结果见附图12。

综上，模型组小鼠的脂肪酸氧化总体表现出下调，即受到抑制，而brunodelphinine A治疗可以回调脂肪酸氧化过程的发生。

6.4 brunodelphinine A能够减轻HFD小鼠肝脏病理改变

6.4.1各组小鼠病理切片观察

HFD小鼠肝组织汇管区发生了炎症浸润性病变，肝细胞肿胀，导致整体肝组织淡染，同时肝细胞发生脂肪性样变，胞质稀疏，细胞间界限不明，胞间有大量空泡散在。给药组小鼠肝索有明显的恢复，炎症细胞浸润减少，肝细胞脂肪性病变得到改善，细胞肿胀情况消失，胞质均匀，细胞界限出现，胞间脂滴减少。正常给药组小鼠肝脏样本无明显病变情况，证明 brunodelphinine A对给药组小鼠的肝脏不会造成明显的表观性损伤，结果见附图13。

6.4.2各组小鼠血清ALT、AST指标比较

ALT、AST是肝功能考察的重要指标。由上述结果可以看出，HFD小鼠的ALT、AST均显著性上调，证明肝脏功能遭到了破坏。给药治疗后，ALT指标显著性下调，证明小鼠肝脏功能得到了一定的恢复，结果见附图14。

6.4.3各组小鼠肝组织炎症因子及其基因表达情况比较

由实验结果可以看出，HFD小鼠肝组织中的各项炎症因子指标及基因表达均显著性上调，证明肝脏发生了炎性病变。给药治疗后，炎症因子指标显著性下调，肝脏炎症病变得到改善，结果见附图15。

6.4.4各组小鼠脂肪变性基因表达情况比较

Pnpla2是脂肪组织中主要的甘油三酯脂肪酶，能够促进甘油三酯的分解，其缺失与脂肪变性相关；PPP2c可以减轻炎症表达，减少脂肪变性。这两种基因均为蛋白磷酸酶，其负增长能够提示脂肪变性的发生。

HFD小鼠的肝脏中Pnpla2和PPP2ca均呈现显著性低表达，证明HFD小鼠出现了脂肪变性，经过brunodelphinine A治疗后，两种基因水平均显著性回调，这证明小鼠肝脏脂肪变性的现象得到了改善，结果见附图16。

附图说明

图1为本发明所述化合物对小鼠代谢行为影响的48小时连续观测图。

图2为本发明所述化合物对小鼠肝脏脂肪影响的病理切片图；其中，(A)图为空白组； (B)图为模型组；(C)图为给药组；(D)图为阳性药组。

图3为本发明所述化合物对小鼠产热相关蛋白基因表达影响的直方图；其中，(A)图为小鼠UCP1(Uncoupling protein 1)基因表达水平；(B)图为小鼠Dio2(Deiodinaseiodothyronine type II)基因表达水平；(C)图为小鼠PPargc1a(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha)基因表达水平；(D)图为小鼠Prdm16(PR domain containing 16)基因表达水平.；(A)～(D)图中，#：P＜0.05,##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05VS模型组；△:P＜0.05VS阳性药组.。

图4为本发明所述化合物对小鼠棕色脂肪影响的CT图。

图5为本发明所述化合物对小鼠葡萄糖耐量测试影响的效果图；其中，(A)图为小鼠葡萄糖耐量测试(GTT)的曲线图；(B)小鼠时间曲线下面积(AUC)比较的直方图，图中##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05,**：P＜0.01VS模型组；；△△：P＜0.01VS阳性药组。

图6为本发明所述化合物对小鼠胰岛素耐量测试影响的效果图；其中，(A)小鼠胰岛素耐量测试(ITT)的曲线图；(B)小鼠时间曲线下面积(AUC)比较的直方图，图中##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05,**：P＜0.01VS模型组；；△△：P＜0.01VS阳性药组.。

图7为本发明所述化合物对小鼠糖代谢相关蛋白基因表达影响的直方图，其中(A)图为小鼠SLC2A4(Solute carrier family 2(facilitated glucose transporter),member 4)基因表达水平；(B)图为小鼠GSK3β(Glycogen synthase kinase 3beta)基因表达水平；(C)图为小鼠 PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)基因表达水平；(D)图为小鼠AKT1(Thymoma viral proto-oncogene 1)基因表达水平；(A)～(D)图中，#：P＜0.05,##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05VS模型组。

图8为本发明所述化合物对小鼠体重和肝脏指数影响的效果图，其中，(A)图为小鼠体重变化趋势的曲线图；(B)图为小鼠肝脏指数比较的直方图，图中#：P＜0.05,##：P＜0.01VS 空白组；**：P＜0.01VS模型组；△△：P＜0.01VS阳性药组。

图9为本发明所述化合物对小鼠甘油三酯和总胆固醇影响的直方图，其中左图为小鼠甘油三脂(TG)水平；右图为小鼠总胆固醇(TC)水平；左图和右图中，##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05VS模型组。

图10为本发明所述化合物对小鼠Fabp4基因表达影响的直方图，图中#：P＜0.05VS空白组；*：P＜0.05VS模型组。

图11为本发明所述化合物对小鼠白色脂肪影响的CT图。

图12为本发明所述化合物对小鼠脂质代谢相关蛋白的基因表达影响的直方图，其中(A) 图为小鼠Mgll(Monoglyceride lipase)基因表达水平；(B)图为小鼠Acadvl(Acyl-CoA dehydrogenase very long chain)基因表达水平；(C)图为小鼠Acadl(Acyl-CoAdehydrogenase long chain)基因表达水平；(D)图小鼠Acadm(Acyl-CoAdehydrogenase middle chain)基因表达水平；(E)图为小鼠Acads(Acyl-CoAdehydrogenase short chain)基因表达水平；(F) 图为小鼠Cpt2(Carnitinepalmitoyltransferase 2)基因表达水平；(G)图为小鼠Cpt1b(Carnitinepalmitoyltransferase 1B)基因表达水平；(A)～(G)中，#：P＜0.05,##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05VS模型组；△:P＜0.05VS阳性药组。

图13为本发明所述化合物对小鼠肝脏影响的显微照片。

图14为本发明所述化合物对小鼠肝功能影响的直方图，其中(A)图小鼠谷丙转氨酶 (ALT)水平；(B)图为小鼠谷草转氨酶(AST)水平；(A)和(B)图中，#：P＜0.05,##： P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05VS模型组。

图15为本发明所述化合物对小鼠肝组织炎症因子影响的直方图，其中(A1)图为小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平；(A2)图为小鼠TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)基因表达水平；(B1)图为小鼠白介素6(IL-6)水平；(B2)图为小鼠IL-6(Interleukin-6)基因表达水平；(C1)图为小鼠白介素1β(IL-1β)水平；(C2)图为小鼠IL-1β(Interleukin-1 β)基因表达水平；(A1)～C2)图中，#：P＜0.05VS空白组；*：P＜0.05,**：P＜0.01VS 模型组；△△：P＜0.01VS阳性药组。

图16为本发明所述化合物对小鼠脂肪变性基因表达影响的直方图，其中(A)图为小鼠 Pnpla2(Patatin-like phospholipase domain containing 2)基因表达水平；(B)图为小鼠PPP2ca (Protein phosphatase 2catalytic subunit alpha)基因表达水平；(A)～(B)图中，#：P＜0.05, ##：P＜0.01VS空白组；*：P＜0.05,**：P＜0.01VS模型组；△:P＜0.05。

图17为本发明所述化合物的

图18为本发明所述化合物的

图19为本发明所述化合物的DEPT图。

图20为本发明所述化合物的

图21为本发明所述化合物的HSQC二维NMR图。

图22为本发明所述化合物的HMBC二维NMR图。

图23为本发明所述化合物的NOE二维NMR图。

图24为real-time PCR实验的反应程序图。

具体实施方式

下述实验用囊距翠雀(Delphinium brunonianum Royle)采自西藏自治区林芝地区。

例1：

一、化合物的制备

(1)取囊距翠雀5kg，依次用15和10倍体积浓度为80％的乙醇分别浸渍提取，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，得总浸膏746g；

(2)将总浸膏溶解于水中，然后，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，取醋酸乙酯萃取液，减压浓缩至去除溶剂，得醋酸乙酯萃取物72g；

(3)将醋酸乙酯萃取物拌匀于空白硅胶中，过硅胶柱，依次用二氯甲烷-甲醇(100:1→2:1) 梯度洗脱；收集二氯甲烷-甲醇(10:1)洗脱液过Sephadex LH-20的葡聚糖凝胶柱，以体积浓度为80％的甲醇为溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得到无色针状结晶即可。

二、化合物的鉴定

所得到的化合物为白色簇状针晶(MeOH),[α]

通过HSQC,H-H COSY等二维谱分别归属了剩余的3个季碳信号(δ

HMBC谱(见图22)分析：H-5[δ

NOESY谱(见图23)分析：H-20(δ

综合上述分析，鉴定该化合物结构为15β-hydroxy-15-deacetyspiramine，命名为brunodelphinine A，结构式见发明内容部分的式(Ⅰ)，经SCIFinder检索，未见文献报道，初步判断为一新化合物。

表1.化合物brunodelphinine A的

Table 1

例2：(片剂)

取采用上述实施例1所述方法得到的化合物2000mg与HPMC、乳糖及淀粉按1:9:9:12 的比例混合均匀，用95％乙醇20目制粒，50℃以下干燥1小时、16目筛整粒,再加入1％硬脂酸镁混合均匀,压片，制成规格为100mg/片的片剂供口服使用。

例3：(滴丸)

取采用上述实施例1所述方法得到的化合物2000mg与PEG4000及PEG6000按1:20:50 比例混合，熔融，滴入冷却剂甲基硅油中即得滴丸(50mg/粒)。

例4：(胶囊剂)

取采用上述实施例1所述方法得到的化合物3000mg与4000mg微晶纤维素、400mg羧甲基淀粉钠、400mg十二烷基硫酸钠等辅料充分混合，采用辊压法进行干法制粒，再与适量硬脂酸镁混匀，填充入3#空心胶囊，制成规格为100mg/粒的胶囊剂供口服使用。