一种烯还原酶突变体、编码基因、工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种烯还原酶突变体，具体涉及一种烯还原酶突变体CtOYE-Mut及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该烯还原酶突变体CtOYE-Mut在不对称合成手性化合物(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用。

(二)背景技术

(2R,5R)-二氢香芹酮是一种可以用于合成不同化合物的有趣分子，如(+)-decipienin A、(-)-thujopsene，或作为昆虫拒食剂ketone decalin的衍生物、作为具有抗疟活性化合物1,2,4,5-tetraoxane的前体、以及聚合形成形状记忆聚合物单萜内酯衍生物(+)-二氢碳化物((+)-DHCD)的前体。

(2R,5R)二氢香芹酮可由(R)-香芹酮还原可得，化学合成中常用到硼氢化钠、环氧柠檬烯、三氟乙烯和金属锌等还原剂进行不对称还原反应，如何钟林等人通过金属锌和氢氧化钾体系还原法还原生成(2R,5R)-二氢香芹酮，但此法需要过量的锌粉作为还原剂，后续处理繁琐且会产生大量的固液和废液。而通过烯还原酶不对称还原得到(2R,5R)-二氢香芹酮，方法简单无污染，例如，Powell等人通过OYE1、OYE3和PeTnR对合成二氢香芹酮的dep值分别为97％(2R,5R)、75％(2R,5R)和93％(2R,5R)。(R)-香芹酮和(S)-香芹酮的不对称还原生成非对映体，因此这两种构型的香芹酮在不同烯还原酶的不对称还原中可能有不一样的利用率。

相比于化学合成法使用高温及价格较为昂贵的金属催化剂等，生物酶催化操作简单，对映体选择性高，收率高，成本低，安全环保，解决了化学法能耗高、污染大、操作繁琐等问题。但是野生型的烯还原酶在工业应用上还存在对应体选择性差和酶不高的问题，因此，需要对现有的烯还原酶进行改进，以提高其催化活性和/或稳定性，进而改善现有技术中生产成本高等问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高立体选择性的烯醇还原酶突变体CtOYE-Mut、编码基因、工程菌及其在催化不对称还原(5R)-香芹酮合成高光学纯度(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用，本发明通过对源自热绿球藻(cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis)的烯醇还原酶CtOYE的分子改造，成功获得了高转化率和高对映体选择性的烯还原酶突变体CtOYE-Mut，并运用于不对称还原(5R)-香芹酮合成(2R,5R)-二氢香芹酮，产物e.e.值和转化率都达到了99％以上，相较于未经改造的野生型烯醇还原酶CtOYE86.4％的对映体选择性来说得到了明显的提升。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种烯还原酶突变体(CtOYE-Mut)，所述烯还原酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第103位、351位或237位进行定点突变获得的，优选所述烯还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第103位色氨酸突变为苯丙氨酸，记为CtOYE-Mut(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。

本发明还提供一种所述烯还原酶突变体编码基因，含所述烯还原酶突变体编码基因的重组载体以及所述重组载体构建的重组基因工程菌。本发明所述重组载体优选pET-28a+载体为基础载体，所述重组基因工程菌优选以E.coli BL21(DE3)为宿主菌；所述重组载体是将烯还原酶突变体编码基因插入pET-28a+载体的NdeI和BamHI之间获得的；所述重组基因工程菌以重组质粒pET-28a+-CtOYE为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向PCR扩增全质粒，得到的PCR产物经DpnⅠ酶消化甲基化的模板，酶切产物转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，即可得到所述含烯醇还原酶突变体CtOYE-Mut基因的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-CtOYE-Mut。

本发明还提供一种所述烯还原酶突变体在催化(5R)-香芹酮制备手性化合物(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用，同样能够用于催化α,β-不饱和醛酮类化合物制备手性化合物。

优选的，所述的应用为：将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，取破碎混合液离心后的上清液(即粗酶液)或上清液提取的纯酶液为催化剂，以(5R)-香芹酮为底物，以NAD(P)

所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.1-5mg/mL(优选1mg/mL)，所述底物加入终浓度2-10mM(优选5mM)，所述NAD(P)

所述反应体系优选为：以含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以(5R)-香芹酮为底物，以NAD(P)

优选的，所述湿菌体按如下方法制备：将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌平板单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养15-20h；再将菌液以体积浓度1％的接种量接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养至OD

优选的，所述粗酶液按如下方法制备：将湿菌体用50mM、pH 8.0的PBS缓冲液悬浮后于4℃低温冰水浴下超声波破碎菌体，超声波破碎条件为，功率400W，3s开，4s关，温度为4℃，有效破碎时间为8min；超声波破碎混合液经12,000rpm离心10min后再将上清经12000转离心20min得到上清液，吸取上清，获得含有目的烯还原酶突变体的粗酶液。

进一步，所述纯酶液按如下方法制备：采用Ni-NTA金属螯合亲和层析，将上述所得的粗酶液通过层析仪转移到已经平衡好的Ni

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述立体选择性专一的烯醇还原酶突变体CtOYE-Mut与烯醇还原酶CtOYE相比，在生物酶法不对称合成(2R,5R)-二氢香芹酮中具有更高的立体选择性。利用突变体CtOYE-Mut为生物催化剂，以NADP

(四)附图说明

图1为重组质粒pET28a-CtOYE-Mut的结构示意图。

图2为烯还原酶催化(5R)-香芹酮(Ⅰ)不对称加氢生产(2R,5R)-二氢香芹酮(Ⅱ)示意图。

图3为重组质粒pET28a-CtOYE的琼脂糖凝胶电泳图，M为标准蛋白mark，L1为重组质粒pET28a-CtOYE。

图4为标准品底物(5R)-香芹酮(Ⅰ)和产物(2R,5R)-二氢香芹酮(Ⅱ)及副产物(2S,5R)-二氢香芹酮的GC分析图谱。

图5为pET28a-CtOYE-W103F的粗酶液和纯化过后的SDS-PAGE凝胶电泳图；目标蛋白大小为42.0kDa，L1为突变体CtOYE-W103F粗酶液的电泳条带，L2为标准蛋白mark，L3为突变体CtOYE-W103F纯化酶的电泳条带。

图6为烯还原酶突变体CtOYE-Mut催化底物(5R)-香芹酮(Ⅰ)制备产物(2R,5R)-二氢香芹酮(Ⅱ)的GC分析图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用试验材料和试剂：

1、酶类及其它生化试剂：质粒小提试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2X)和Dpn I甲基化消化酶均购自Takara；ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；AxyPrep DNA agarose gel extraciton kit购自Axygen；超滤管购自Millipore。其他试剂皆为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

2、培养基：

LB液体培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 6.8～7.0。LB固体培养基在LB液体培养基的基础上加30g/L琼脂。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《生物化学技术实验指导》(化学工业出版社)孙培龙，吴石金主编一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtOYE的构建

将Genbank中源自热绿球藻(cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis)的基因片段(Chro_0590，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)由杭州冠楠生物技术有限公司进行密码子优化，密码子优化后的基因片段记为CtOYE基因，人工合成CtOYE基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。经人工合成后的CtOYE基因插入pET28a的NdeI和BamHI之间，得到重组表达质粒pET28a-CtOYE，电泳图见图3所示。

将合成的重组表达质粒pET28a-CtOYE取出6μL加入到30μL的E.coli BL21(DE3)感受态中，轻弹管壁混匀，冰上放置30min。42℃水浴热击1min，立即置于冰上2min。向管中加入1mL的LB液体培养基，37℃摇床培养1.5h。将培养液8000rpm离心4min，弃上清。用剩下的培养基将菌体悬浮，取出100μL涂在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养箱过夜培养12-14h，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtOYE，并提取质粒pET28a-CtOYE。

SEQ ID NO.1

5’-ATGAACACCAATATCGATCTGTTTAGTCCGGTTCGCCTGGGTCGTTATGAACTGCCGAATCGTATGGTTATGGCACCGCTGACCCGCAATCGCGCCGGTGAAGGTAATGTTCCGCGCGAACTGAATGCAGAATATTATGCCCAGCGTGTGAGTGCCGGCCTGATTATTACCGAAGCAACCCAGGTGAGTCCGCAGGGTCTGGGTTATCCGTTTACCCCGGGTATTCATAGCCAGGAACAGGTGGAAGGTTGGCGTCTGGTGACCAAAGCAGTGCATGATCGTGGCGGTAAAATTTTTCTGCAGCTGTGGCATGTTGGCCGCATTAGCCATCCGGATCTGCAGGTGGATGGTGCCCTGCCGGTTGCACCGAGTGCAATTGCACCGAGCGAAGGCATGGCAGCAACCTATGAAGGCGAAAAACCGTATGTGACCCCGCGCGCACTGGAAACCGCCGAAATTCCGGGTATTGTGGAACAGTATCGCCAGGGCGCCAAAAATGCACTGGCCGCAGGCTTTGATGGCGTTGAAATTCATAGCGCCAATGGTTATCTGCTGGATCAGTTTCTGCATGATGGTAGCAATCATCGTACCGATGAATATGGCGGTAGTATTGAAAATCGTGCCCGTCTGCTGATGGAAGTGACCGAAGCAGTGGTGAGCGTTTGGGGCGCAGATCGTGTTGGTGTGCGTCTGAGCCCGAGTGGTACCTTTGGCAGCGTGTATGATAGCGATCTGAAAGCACTGTTTACCTATGTTGTTGATGCACTGAATCAGTTTGAACTGGCATATCTGCATCTGGTTGAACCGCGCGTTGCCGGCAATGAAACCGTGGAAAATCCGACCAGCGAACTGAGTAGCAAATATTTTCGCCCGATTTATAAAGGCACCCTGATTAGCGCCGGCGGTTATGATCGTGAAAGCGGCAATGCAGTGCTGGCAAGCGGTGATGCAGATCTGGTGGCATACGGTCGCCTGTTTATTAGTAATCCGGATCTGCCGCAGCGCTTTGCCCTGAATGCACAGCTGAATCCGTATGATCGCAGTAGTTTTTATGGCGGCGATAAACGTGGTTATACCGATTATCCGAGTCTGGAACTGCAGGCCGCAGGTTAA-3’。

SEQ ID NO.2

MNTNIDLFSPVRLGRYELPNRMVMAPLTRNRAGEGNVPRELNAEYYAQRVSAGLIITEATQVSPQGLGYPFTPGIHSQEQVEGWRLVTKAVHDRGGKIFLQLWHVGRISHPDLQVDGALPVAPSAIAPSEGMAATYEGEKPYVTPRALETAEIPGIVEQYRQGAKNALAAGFDGVEIHSANGYLLDQFLHDGSNHRTDEYGGSIENRARLLMEVTEAVVSVWGADRVGVRLSPSGTFGSVYDSDLKALFTYVVDALNQFELAYLHLVEPRVAGNETVENPTSELSSKYFRPIYKGTLISAGGYDRESGNAVLASGDADLVAYGRLFISNPDLPQRFALNAQLNPYDRSSFYGGDKRGYTDYPSLELQ AAG*。

实施例2：重组表达质粒pET28a-CtOYE-Mut与基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CtOYE-Mut的构建

1、突变引物设计

根据烯还原酶CtOYE的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)设计定点突变引物pET28a-CtOYE-A-X-f和pET28a-CtOYE-A-X-r，A代表选取的几个突变的氨基酸以及具体位置，X代表除原氨基酸以外的其余19种氨基酸，具体如表1所示。

表1：pET28a-CtOYE-A-X定点突变上下游引物

2.定点突变PCR

按照Takara的Prime STAR Max Premix(2X)试剂盒说明书，以实施例1获得的重组表达质粒pET28a-CtOYE为模板，分别用表1中的引物，采用表2反应体系，在表3反应条件下进行单个位点的定点突变PCR。

表2：定点突变PCR反应体系

表3：定点突变PCR反应条件

将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测正确后进行下面步骤。

3、定点突变PCR产物处理

根据Takara的Dpn I甲基化消化酶说明书，对突变PCR的产物进行处理，按照表4反应体系，在37℃/2h下消化甲基化的模板DNA。反应结束后，使用AxyPrep的DNA纯化试剂盒AxyPrep DNA agarose gel extraciton kit纯化PCR产物。

表4：DpnⅠ消化模板反应体系

根据诺唯赞的

表5：线性化PCR产物体外环化反应体系

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将外环化的PCR产物转化E.coli BL21(DE3)，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基，经37℃过夜培养，挑取单菌落接于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，于37℃，180rpm振荡培养16-20h后，菌液为含烯还原酶突变体CtOYE-X的重组大肠杆菌，记为E.coliBL21(DE3)-pET28a-CtOYE-X，转移至终浓度为15％(v/v)的甘油水溶液中，混匀后于-80℃保存。

实施例3：烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-X的诱导表达及分离纯化

1.菌体诱导培养

将实施例1构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a-CtOYE和实施例2定点突变获得的各个突变体E.coli BL21(DE3)-pET28a-CtOYE-X，分别接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养16-20h。再将菌液以体积浓度1％的接种量接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养至OD

2.粗酶液制备

将步骤1的菌体悬浮液于4℃低温冰水浴下超声波破碎，超声波破碎条件为：功率400W，3s开，4s关，温度为4℃，有效破碎时间为8min。超声波破碎混合液经12,000rpm离心30min后，吸取上清，即获得含有目的烯还原酶的粗酶液。

3.酶的纯化

按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取步骤2的粗酶液上样至预平衡Ni

洗脱液组成：300mM氯化钠，溶剂为50mM的PBS缓冲液，pH 8.0。

对上述所得纯酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳，其中烯还原酶突变体CtOYE-W103F的蛋白电泳结果见图5。

实施例4：烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-X的化学选择性和立体选择性的分析

反应体系0.5mL：以实施例3方法制备的粗酶液(烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体GsOYE-X)为催化剂，添加量以蛋白含量计为1mg/mL，终浓度0.1μM的NAD(P)

气相色谱检测条件：通过配备FID检测器和手性毛细管色谱柱的2010-GC测定；FID检测温度250℃，进样器250℃；柱入口压力60kPa；作为载气的N

表6：GsOYE和突变体GsOYE-X不对称还原(5R)-香芹酮

[a]

结果分析可得，烯醇还原酶突变体CtOYE-W103F表现出优越的立体选择性和化学选择性，非对映体选择性de

实施例5：烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-Mut的活性分析

反应体系2mL：在30℃环境下，向2mL的PBS(50mM、pH 8.0)缓冲液中加入10mM底物(5R)-香芹酮，0.1mM的NADPH，最后分别加入上述实施例3方法制备的以蛋白含量计0.06mg的烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-Mut的纯酶液(以蛋白含量计，使光吸收值随时间的变化曲线保持线性的最小酶量)后，立即测定340nm下2min内吸光度的变化，以不加纯酶为空白对照。

酶活性的一个单位定义为去除背景吸收后每分钟催化1μmol NADPH氧化(或NADP

比酶活计算公式：比活力(U/mg)＝ΔA×V/ε·m；

ΔA：1min内340nm下吸光度的变化；

V：反应液体积，本实验为0.2mL；

ε：NADPH在340nm下摩尔吸光系数，本实验中为6.22mM

m：反应液中添加的酶量，本实验为0.06mg；

对烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-Mut进行酶活分析，酶液添加量为0.06mg，得到GsOYE的比活力为0.680U/mg，烯还原酶突变体CtOYE-Mut的比活力为0.8U/mg。

实施例6：烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-Mut纯酶催化(5R)-香芹酮制备(2R,5R)-二氢香芹酮的立体选择性

反应体系0.5mL：以实施例3方法制备的纯酶液(烯还原酶CtOYE和烯还原酶突变体CtOYE-Mut)为催化剂，添加量以蛋白含量计均为1mg/mL，终浓度0.1μM的NAD(P)+为辅因子，终浓度0.5U/mL的葡萄糖脱氢酶(购自阿拉丁)为辅酶，终浓度40mM葡萄糖为辅助底物，终浓度5mM的(5R)-香芹酮为底物，以50mM、pH8.0的PBS缓冲液为反应介质构成反应体系0.5mL；在30℃，200rpm转速的摇床中反应24h。反应结束后，反应液加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，上层有机相经无水MgSO

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。