一种药用级间充质干细胞及其培养方法

技术领域

本申请涉及细胞扩增培养的技术领域，更具体地说，涉及一种药用级间充质干细胞及其培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem/Stromal cell，MSCs)是一种具有自我更新能力、且具有多向分化潜能的原始细胞，来源于发育早期的中胚层。研究表明，间充质干细胞可从骨髓、脐带、脐血、胎盘以及脂肪等组织中提取获得。通过体外扩增培养，可分化为成骨细胞、成软骨细胞以及成脂肪细胞等多种细胞，是组织工程和干细胞治疗的理想种子细胞。临床上的应用包括：改善骨关节炎预后、治疗心梗、修复肺损伤、治疗神经系统疾病和改善高血糖等。

因此，在体外对间充质干细胞进行大规模培养以获得足够数量且高质量的细胞，对于满足临床方面的需求具有重要的意义。传统的体外培养方法主要为2D培养，即使用培养瓶进行培养，细胞贴壁的面积仅为培养瓶的内壁所提供的面积，可供细胞贴壁的面积较小，故在细胞的培养过程中，往往需要消耗的培养瓶数量多、占地面积大，并且需要众多的人力物力，操作繁琐，污染风险大，并且难以保证细胞的一致性及细胞质量。

间充质干细胞呈纤维状，具有贴壁生长的特性。微载体是一种

细胞体外大规模扩增培养需要营养均一和条件可控的生长环境。目前，应用较为广泛的生物反应器包括搅拌罐式生物反应器、波浪式生物反应器、中空纤维式生物反应器和固定床生物反应器。搅拌罐式反应器可以充分传质、传热，使培养液营养成分分布均匀，能够进行过程控制与监测。除了温度(T)、溶解氧(DO)、pH和搅拌速度等控制参数外，使用生物反应器还具有附加的称重功能，还可以使用反应器自带的蠕动泵进行料液转移等操作。这些功能都能促使规模化细胞培养的操作简化，也可以按照需求更改培养工艺。

采用传统的细胞体外大规模扩增培养技术，可以在短期内获得大量的细胞，但不同生产批次细胞的生理代谢水平存在一定的差异，且难以满足药用级细胞的要求，无法直接在临床上应用。

发明内容

为了在短期内获得大量符合药用级要求的间充质干细胞，本申请提供一种药用级间充质干细胞的培养方法及其应用。本申请通过微载体和生物反应器的结合利用，为细胞提供了类似于人体内的生长环境，可以在维持细胞生长速度的同时保证细胞的表型及分化功能正常；进一步对培养过程中的参数进行优化，获得的间充质干细胞可以达到药用级，能够安全地应用于临床的研究及治疗中。

第一方面，本申请提供一种药用级间充质干细胞的培养方法，采用如下的技术方案：

将密度为(4-6)×10

所述间歇式搅拌方式为：以20～40rpm的转速搅拌5～10min，停止50～55min，搅拌循环次数为1～5次；所述持续性搅拌方式为：以30rpm的转速搅拌至培养结束。

本申请中，联合使用微载体以及生物反应器，可以快速高效地扩增间充质干细胞。其中，微载体可以为细胞提供更高的比表面积，促进细胞的贴壁及生长。生物反应器可以实现细胞增殖的级联放大，从而在短时间内获得大量细胞。此外，使用生物反应器可以严格控制并实时监测工艺参数，实现全封闭、自动化、智能式操作，并且能够减少人为操作，控制污染风险。另外还具有占地面积小、总体成本更低的优点。

本申请中，采用间歇式搅拌的方式，可以帮助间充质干细胞在微载体表面均匀分布并贴壁。搅拌时，微载体及接种的间充质干细胞悬浮在培养液中，便于未贴壁细胞贴合在微载体表面；停止时，已经结合的间充质干细胞可以通过表达的细胞外基质以及黏附因子，更加紧密地黏附在微载体表面，避免细胞在后续的搅拌过程中脱落。再配合后续的持续性搅拌培养，可以使间充质干细胞在接近人体的生理状态下培养，细胞分裂速度快，培养结束后细胞数量可增长10倍以上；细胞生理状态好，细胞活性在90％以上，流式检测结果符合间充质干细胞的表型特征，且具有成骨、成软骨和成脂肪的三系分化潜能，符合药用级细胞的标准。

本申请中，间歇式搅拌培养的搅拌及停止时间影响间充质干细胞在微载体表面的分布及贴壁。若搅拌的时间较短，则间充质干细胞在微载体表面的分布不够均匀；若搅拌的时间过长，会使已经贴壁的细胞脱落，甚至可能造成细胞的损伤与死亡，不利于后续的培养。若静止的时间较短，则会导致间充质干细胞贴壁不牢，容易在后续的搅拌中脱落下来；若静止的时间较长，则不利于间充质干细胞与培养基进行物质交流，影响细胞的生长状态。

本申请中，间充质干细胞的接种终密度直接影响最终培养获得的间充质干细胞的生理状态。若细胞的接种终密度较小，则会影响细胞之间进行物质及信息交流，影响细胞的生长状态；若细胞的接种终密度较大，则部分间充质干细胞无法顺利黏附在微载体表面，从而导致细胞的脱落及死亡，造成原料浪费的同时，死亡的细胞还会向培养液中分泌死亡因子以及细胞内容物，对其他细胞的生长产生不利影响。

在一些具体的实施方案中，所述间充质干细胞的接种终密度为(4-5)×10

在一些具体的实施方案中，所述转速为20～25rpm、20～30rpm、20～35rpm、25～30rpm、25～35rpm、25～40rpm、30～35rpm、30～40rpm或35～40rpm等。在一个具体的实施方案中，所述转速为20rpm、25rpm、30rpm、35rpm或40rpm等。

在一些具体的实施方案中，所述搅拌的时间为5～6min、5～7min、5～8min、5～9min、6～7min、6～8min、6～9min、6～10min、7～8min、7～9min、7～10min、8～9min、8～10min或9～10min等。在一个具体的实施方案中，所述搅拌的时间为5min、6min、7min、8min、9min或10min等。

在一些具体的实施方案中，所述停止的时间为50～51min、50～52min、50～53min、50～54min、51～52min、51～53min、51～54min、51～55min、52～53min、52～54min、52～55min、53～54min、53～55min或54～55min等。在一个具体的实施方案中，所述停止的时间为50min、51min、52min、53min、54min或55min等。

在一些具体的实施方案中，所述循环的次数为1～5次。在一个具体的实施方案中，所述循环的次数为3次或4次。

优选地，所述持续性搅拌培养的培养条件为：温度为37℃、pH为7.4、溶解氧为20％～30％以及搅拌转速为30rpm。

本申请中，对持续性搅拌培养的条件进行优化，模拟了人体内的培养情况，从而使间充质干细胞在更接近正常生理状态的环境下生长和分裂，提高细胞的分裂速度，改善细胞活性，最终获得的间充质干细胞符合药用级细胞的要求，具有成骨、成软骨和成脂肪的分化潜能，可应用于临床的相关研究及治疗中，安全性好，应用价值高。

在一些具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的溶解氧为20％～25％、20％～30％等。在一个具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的溶解氧为20％、25％、30％等。

在一些具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的搅拌转速为20～25rpm、20～30rpm等。在一个具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的搅拌转速为20rpm、25rpm、30rpm等。

优选地，所述持续性搅拌培养的时间为5～7天。

本申请中，持续性搅拌培养仅5～7天后，细胞的增长数量可达10倍，细胞的增殖速度远高于传统的培养方式，且细胞的生理状态良好，应用价值高。

在一些具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的时间为5～5.5天、5～6天、5～6.5天、5.5～6天、5.5～6.5天、5.5～7天、6～6.5天、6～7天或6.5～7天等。在一个具体的实施方案中，所述持续性搅拌培养的时间为5天、5.5天、6天、6.5天或7天等。

优选地，所述溶胀后的微载体通过将微载体干粉溶胀的方法获得。

优选地，将微载体干粉溶胀的方法，具体步骤包括：按1～3g/L的比例，将微载体干粉与培养液混合，在温度为35～37℃、搅拌转速为20～40rpm的条件下，溶胀2～4h。

本申请中，使用的微载体以冻干粉的形式保存，因此溶胀效果直接影响细胞的贴壁效果。微载体干粉与培养液的比例、溶胀的温度以及搅拌的转速直接影响微载体的溶胀效果。

微载体干粉与培养液的比例对于微载体的溶胀效果有一定的影响。若微载体干粉的加入量过多，则会因溶胀不充分而使微载体的比表面积减小，不利于细胞的贴壁；若微载体干粉的加入量较少，则会因溶胀过快而影响微载体表面的结构，同样会对细胞的贴壁造成影响，且还会造成培养液的浪费。

溶胀的温度以及搅拌转速直接影响微载体干粉溶胀的速度以及溶胀后的形状。若溶胀时的温度较低或搅拌转速较小，则溶胀的速度较慢，微载体溶胀不充分，比表面积较小，为细胞提供的生长表面积较小，不利于细胞的贴壁及生长；若溶胀时的温度较高或搅拌转速较大，则会因溶胀速度过快而破坏微载体表面的结构，影响细胞的贴壁，进而影响后续培养得到的细胞的数量及生理状态。

在一些具体的实施方案中，所述微载体干粉与培养液混合的比例为1～1.5g/L、1～2g/L、1～2.5g/L、1.5～2g/L、1.5～2.5g/L、1.5～3g/L、2～2.5g/L、2～3g/L或2.5～3g/L等。在一个具体的实施方案中，所述微载体干粉与培养液混合的比例为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L等。

在一些具体的实施方案中，所述溶胀的温度为35～36℃、35～37℃、36～37℃、36～38℃或37～38℃等。在一个具体的实施方案中，所述溶胀的温度为35℃、36℃、37℃或38℃等。

在一些具体的实施方案中，所述溶胀的搅拌转速为20～25rpm、20～30rpm、20～35rpm、25～30rpm、25～35rpm、25～40rpm、30～35rpm、30～40rpm或35～40rpm等。在一个具体的实施方案中，所述溶胀的搅拌转速为20rpm、25rpm、30rpm、35rpm或40rpm等。

在一些具体的实施方案中，所述溶胀的时间为2～2.5h、2～3h、2～3.5h、2.5～3h、2.5～3.5h、2.5～4h、3～3.5h、3～4h或3.5～4h等。在一个具体的实施方案中，所述溶胀的时间为2h、2.5h、3h、3.5h或4h等。

本申请中，溶胀使用的培养液的pH为7.2～7.6。

本申请中，使用pH为7.2～7.6的培养液溶胀微载体，可以使溶胀后的微载体的酸碱性接近间充质干细胞正常的生长环境，有利于细胞的贴壁及后续生长。

在一些具体的实施方案中，溶胀使用的培养液的pH为7.2～7.3、7.2～7.4、7.2～7.5、7.3～7.4、7.3～7.5、7.3～7.6、7.4～7.5、7.4～7.6或7.5～7.6等。在一个具体的实施方案中，溶胀使用的培养液的pH为7.2、7.3、7.4、7.5或7.6等。

本申请中，所述的微载体干粉通过如下方法进行制备：

(1)制球：将浓度为1％～2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％～3％的氯化钙溶液中，反应生成海藻酸钙微胶珠，所述纳米化海藻酸钠溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:(3～5)；

(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤1次；

(3)包被：将浓度为0.05％～5％的明胶溶液和浓度为0.3％～1％的戊二醛溶液等比例混合均匀制成混合液，将所述海藻酸钙微胶珠浸泡在所述混合液中反应，所述混合液与步骤(1)中所用的纳米化海藻酸钠溶液的体积比为(1～3):1；

(4)洗涤：待所述包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤3次；

(5)中和：加入浓度为0.5％～2％的甘氨酸溶液反应，所述甘氨酸溶液的体积与步骤(3)所述的混合液体积相同；

(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤3次；

(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1～3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5～2mol/L的DEAE-HCl溶液搅拌；所述海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:(1～3):(1～3)；

(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸和无Ca

(9)冻干：将步骤(8)所得到的湿润微载体冻干，得到微载体干粉。

优选地，所述间充质干细胞的扩增倍数达到10倍以上，细胞活性达到90％以上。

优选地，所述生物反应器选择500mL生物反应器、5L生物反应器和12.5L生物反应器。

在一个具体的实施方式中，所述5L生物反应器中，所述持续性搅拌方式为：以35rpm的转速搅拌至培养结束；

在一个具体的实施方式中，所述12.5L生物反应器中，所述持续性搅拌方式为：以40rpm的转速搅拌至培养结束。

在一个具体的实施方式中，所述生物反应器为级联放大培养体系，所述级联放大培养体系包括依次并列设置的500mL生物反应器、5L生物反应器和12.5L生物反应器；所述5L生物反应器中，所述持续性搅拌方式为：以35rpm的转速搅拌至培养结束；所述12.5L生物反应器中，所述持续性搅拌方式为：以40rpm的转速搅拌至培养结束。

优选地，经过所述级联放大培养体系培养后，所述间充质干细胞的扩增倍数达到1000倍以上。

优选地，所述生物反应器包括设置于生物反应器内部的搅拌桨；所述搅拌桨包括沿其轴线方向周向设置的浆叶；所述桨叶沿搅拌桨的轴向方向倾斜设置，倾斜角为30°，数量为8个。

通过采用上述技术方案，本申请将搅拌转速设置为20-40rpm，可以降低搅拌桨速度过快带给细胞的剪切力。同时，将生物反应器内的搅拌桨设置为8个桨叶，桨叶形状为方形，每个桨叶倾斜度为30°，浆叶的结构产生的剪切力较小，可以有效降低对细胞的损伤，提高间充质干细胞的扩增倍数，提高细胞活性。

优选地，所述生物反应器中，通过向所述生物反应器内通入空气和氧气来调控培养体系内的溶氧浓度。

优选地，所述生物反应器中，通过向所述生物反应器内通入二氧化碳气体、酸液或碱液来调控培养体系内的pH。

第二方面，本申请提供一种间充质干细胞，采用如下技术方案：

一种间充质干细胞，所述间充质干细胞通过第一方面所述的药用级间充质干细胞的培养方法培养得到。

本申请中，利用上述培养方法培养获得的间充质干细胞可以满足药用级间充质干细胞的标准，具有良好的生理状态，符合间充质干细胞的表型特征，且具有向其他细胞分化的潜能。

优选地，所述间充质干细胞的活性在90％以上。在一些具体的实施方案中，所述间充质干细胞的活性为92％～94％、92％～96％、92％～98％、94％～96％、94％～98％或96％～98％等。在一个具体的实施方案中，所述间充质干细胞的活性为92％、94％、96％或98％等。

优选地，所述间充质干细胞的流式检测结果中，CD73、CD90和CD105的表达量均在99％以上，CD19和HLA-DR不表达。

本申请中，采用上述培养方法获得的间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD19和HLA-DR，符合间充质干细胞的表型特征。

优选地，所述间充质干细胞具有成骨、成软骨和成脂肪的三系分化潜能。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请将微载体与生物反应器联合使用，可以对间充质干细胞进行高效的扩增培养。其中，微载体可以为细胞提供较高的比表面积，从而促进细胞的贴壁及生长。采用生物反应器可以实现细胞的级联放大培养，提供利于细胞生长的生理环境；细胞扩增全程均在封闭的条件下进行，可以降低细胞被病原体污染的风险。上述培养方法还具有操作简单、对操作人员的要求低的优点。

2.本申请通过对培养过程中的参数进行优化，进一步提高了细胞的增殖速度以及培养获得的细胞的生理代谢水平。通过对微载体的溶胀条件进行优化，使微载体达到良好的溶胀状态，从而为间充质干细胞的贴壁提供较高的比表面积以及良好的表面结构。通过间歇式搅拌培养的方式、并对间歇式搅拌培养的参数进行优化，促进间充质干细胞在微载体表面的均匀分布以及贴壁，进而促进后续的细胞分裂及生长。再对持续性搅拌培养的条件进行优化，模拟了人体内的培养情况，进一步提高细胞的分裂增殖速度，改善细胞活性，对于间充质干细胞的大规模培养具有重要的意义。

3.本申请通过对培养过程中的反应器的工艺控制参数进行优化，进一步提高了细胞的增殖速度以及细胞活性。

4.通过设定温度T为37℃，pH为7.2-7.4，溶氧浓度为20-30％，搅拌转速为间歇搅拌与持续性搅拌方式相结合。溶解氧的浓度通过向反应器中通入空气和氧气(99.999％)调控。pH控制方法为：当pH偏碱性时，向培养体系中通入二氧化碳(99.9％)；当pH偏酸性时，通过蠕动泵向体系中泵入碱液(7.5％碳酸钠溶液)。生物反应器内部的搅拌桨为8个桨叶，桨叶为方形，每个桨叶倾斜度为30°，此结构在搅拌过程中产生的剪切力较小，可以降低对细胞的损伤。培养过程中搅拌转速设置为20-40rpm。

5.通过上述方法培养获得的间充质干细胞的增殖速度极快，培养5～7天，细胞数量即可增加10倍；上述间充质干细胞还具有良好的生理代谢水平，细胞活率在90％以上，流式检测表型符合间充质干细胞的表型特征，且具有成骨、成软骨以及成脂肪的潜能，符合药用级间充质干细胞的标准，可以应用于实验研究、生产或临床，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中复苏后的间充质干细胞在T-flask中的贴壁图片(放大倍数为40倍)。

图2为实施例1中间充质干细胞贴壁微载体生长的图片(放大倍数为400倍)。

图3为实施例1中生物反应器的参数控制趋势图片。

图4为实施例1中间充质干细胞在生物反应器中的培养图片。

图5为实施例2中培养获得的间充质干细胞的生长曲线：活细胞密度以及细胞活率的测定结果图片。

图6为实施例2中培养获得的间充质干细胞的细胞表型检测结果(分别为CD73+andCD90+、CD90+and CD105+、CD19+/HLA-DR以及上述三种情况重合时的结果)。

图7为实施例2中培养获得的间充质干细胞的成骨分化潜能的验证结果图片(放大倍数为40倍)。

图8为实施例2中培养获得的间充质干细胞的成软骨分化潜能的验证结果图片(放大倍数为400倍)。

图9为实施例2中培养获得的间充质干细胞的成脂肪分化潜能的验证结果图片(放大倍数为40倍)。

图10为pH、DO分别与活细胞密度的主效应图。

图11为pH、DO与活细胞密度的交互作用图。

图12为pH、DO分别与细胞活性的主效应图。

图13为pH、DO与细胞活性的交互作用图。

图14为搅拌转速、培养天数分别与活细胞密度的主效应图。

图15为搅拌转速、培养天数与活细胞密度的交互作用图。

图16为搅拌转速、培养天数分别与细胞活性的主效应图。

图17为搅拌转速、培养天数与细胞活性的交互作用图。

图18为实施例1、实施例14、实施例15中不同规模反应器中间充质干细胞的生长曲线。

图19为本申请提供的生物反应器的示意图((A)为生物反应器的前视图；(B)为生物反应器的俯视图；(C)为生物反应器的后视图)。

图20为生物反应器内搅拌浆的图片。

具体实施方式

本申请提供一种药用级间充质干细胞的培养方法，所述药用级间充质干细胞的培养方法包括：

1.微载体干粉溶胀：

称量微载体干粉1～3g，置于生物反应器玻璃罐体中，加入1LpH值为7.2～7.6的新鲜培养液混合，在温度为35～37℃、搅拌转速为20～40rpm的条件下，溶胀2～4h。

其中，新鲜培养液的配方及制备方法如下：氯化钠称量60.9g，EDTA称量26.9g，溶于480mL超纯水中，搅拌均匀至溶液透明。

其中，上述的微载体干粉通过如下方法进行制备：

(1)制球：将浓度为1％～2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％～3％的氯化钙溶液中，反应生成海藻酸钙微胶珠，所述纳米化海藻酸钠溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:(3～5)；

(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤1次；

(3)包被：将浓度为0.05％～5％的明胶溶液和浓度为0.3％～1％的戊二醛溶液等比例混合均匀制成混合液，将所述海藻酸钙微胶珠浸泡在所述混合液中反应，所述混合液与步骤(1)中所用的纳米化海藻酸钠溶液的体积比为(1～3):1；

(4)洗涤：待所述包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤3次；

(5)中和：加入浓度为0.5％～2％的甘氨酸溶液反应，所述甘氨酸溶液的体积与步骤(3)所述的混合液体积相同；

(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤3次；

(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1～3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5～2mol/L的DEAE-HCl溶液搅拌；所述海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:(1～3):(1～3)；

(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸和无Ca

(9)冻干：将步骤(8)所得到的湿润微载体冻干，得到微载体干粉。

2.接种细胞：复苏间充质干细胞，接种于175cm

3.间歇式搅拌培养：接种细胞后，设置生物反应器的搅拌参数为：在温度为35～37℃、pH为7.2～7.6、溶解氧为20％～40％的条件下，以20～40rpm的转速搅拌5～10min，停止50～55min。上述过程循环1～5次。

4.持续性搅拌培养：在温度为37℃、pH为7.2～7.6、溶解氧为20％～40％以及搅拌转速为20～40rpm的条件下，持续性搅拌培养5～7天，再使用胰酶替代物TrypLE(1×)消化并收获培养的间充质干细胞。

通过上述培养方法获得的间充质干细胞可以进行冻存或者直接使用，或者转移到更大规模的生物反应器中，继续扩大细胞规模进行培养。

本申请还提供了利用上述药用级间充质干细胞的培养方法培养得到的间充质干细胞，所述间充质干细胞的活性在90％以上；流式检测结果中，CD73、CD90和CD105的表达量均在99％以上，CD19和HLA-DR不表达；所述间充质干细胞具有成骨、成软骨和成脂肪的三系分化潜能。

以下结合实施例1～16、对比例1～18以及附图1～20对本申请的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种药用级间充质干细胞的培养方法。生物反应器中罐体的体积为500mL。

具体包括以下步骤：

1.微载体干粉溶胀：

称量微载体干粉1g，置于生物反应器玻璃罐体中，加入0.5LpH值为7.2的新鲜培养液混合，在温度为37℃、搅拌转速为30rpm的条件下，溶胀3h。

其中，新鲜培养液的配方及制备方法如下：氯化钠称量60.9g，EDTA称量26.9g，溶于480mL超纯水中，搅拌均匀至溶液透明。

其中，上述的微载体干粉通过如下方法进行制备：

(1)制球：将浓度为1％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为1.5％的氯化钙溶液中，反应生成海藻酸钙微胶珠，所述纳米化海藻酸钠溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:4；

(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤1次；

(3)包被：将浓度为2％的明胶溶液和浓度为0.5％的戊二醛溶液等比例混合均匀制成混合液，将所述海藻酸钙微胶珠浸泡在所述混合液中，进行包被反应，所述混合液与步骤(1)中所用的纳米化海藻酸钠溶液的体积比为2:1；

(4)洗涤：待所述包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤3次；

(5)中和：加入浓度为1％的甘氨酸溶液反应，所述甘氨酸溶液的体积与步骤(3)所述的混合液体积相同；

(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤3次；

(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为2mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为1mol/L的DEAE-HCl溶液搅拌；所述海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1:2；

(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca

(9)冻干：将步骤(8)所得到的湿润微载体冻干，得到微载体干粉。

2.接种细胞：

复苏间充质干细胞，接种于175cm

待细胞汇合度为85％～95％时，使用PBS(无钙镁离子)清洗2次，加入胰酶替代物TrypLE(1×)，在37℃下孵育3min，将细胞消化为单细胞悬液，再使用完全培养基终止消化，1200rpm下离心5min，使用完全培养基重悬沉淀，然后按照5×10

其中，完全培养基为人脐带间充质干细胞无血清基础培养基+人脐带间充质干细胞添加剂，均购自上海埃泽思生物科技有限公司。

3.间歇式搅拌培养：

接种细胞后，设置生物反应器的搅拌参数为：

在温度为37℃、pH为7.4、溶解氧为30％的条件下，以30rpm的转速搅拌10min，停止50min。上述过程循环3次。

吸取搅拌后的培养液，置于显微镜下观察，如图2所示。

图2为间充质干细胞贴壁微载体生长的图片。

由图2可以看出，培养过程中间充质干细胞均匀分布在微载体表面。微载体为细胞提供了较大的生长表面积，从而实现了细胞的级联放大培养，加快了细胞的扩增速度。

4.持续性搅拌培养：

设置生物反应器的参数为：在温度为37℃、pH为7.4、溶解氧为30％(实际波动范围在20-30％均可以)以及搅拌转速为30rpm的条件下，持续性搅拌培养6天。细胞培养过程中，生物反应器的参数控制趋势图如图3所示，间充质干细胞在生物反应器中的培养图片如图4所示。

最后使用胰酶替代物TrypLE(1×)消化并收获培养的间充质干细胞。

实施例2

本实施例对实施例1中培养获得的间充质干细胞进行活细胞密度及细胞活率的测定，同时使用流式细胞仪检测细胞表型，并对其分化潜能进行验证。

活细胞密度及细胞活率的测定

在持续性搅拌培养阶段，每天从生物反应器中吸取5mL细胞悬液，使用AO/PI双染试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，参照说明书上的方法对细胞进行染色以及细胞计数，并进行活细胞密度以及细胞活率的测定。

图5为培养获得的间充质干细胞的活细胞密度以及细胞活率的测定结果图片。

由图5可以看出，在间充质干细胞培养过程中，第1～2天细胞处于贴壁微载体状态，活细胞数量没有明显的增加；第3天开始，间充质干细胞的活细胞数量逐渐增多；培养至第5天，活细胞密度达到最高，约为初始细胞数量的10倍，此时细胞活率也较高，细胞活率在90％以上。培养至第6天细胞活率开始明显下降，下降至约80％，活细胞数量也减少。说明采用本申请中的培养方法，培养至第5天时是较为合适的收获时机，此时的活细胞数量最多，细胞活率高，细胞的活性也较好。

细胞表型检测

取培养至第5天的间充质干细胞，滤掉微载体后，调整细胞密度为1×10

图6为培养获得的间充质干细胞的细胞表型检测结果(分别为CD73+and CD90+、CD90+and CD105+、CD19+/HLA-DR以及上述三种情况重合时的结果)。

由图6可以看出，使用生物反应器扩增培养获得的间充质干细胞高表达CD90、CD105和CD73，表达率可达99％以上，不表达CD19和HLA-DR，符合间充质干细胞的表型特征。

分化潜能验证

对培养获得的间充质干细胞的成骨、成软骨以及成脂肪的分化潜能进行验证。

取培养至第5天的间充质干细胞，滤掉微载体后，使用PBS溶液清洗1次，在1200rpm下离心5min。使用完全培养基重悬沉淀，按5×10

培养结束后，通过茜素红染色法鉴定成骨细胞的形成情况，通过阿利新蓝染色法鉴定软骨细胞的形成情况，通过油红染色法鉴定脂肪滴的形成情况。

图7为培养获得的间充质干细胞的成骨分化潜能的验证结果图片(40×)。

图8为培养获得的间充质干细胞的成软骨分化潜能的验证结果图片(400×)。

图9为培养获得的间充质干细胞的成脂肪分化潜能的验证结果图片(40×)。

上述结果显示，培养获得的间充质干细胞保持有良好的成骨、成软骨、成脂肪分化潜能。

综合上述结果，可以看出，采用本申请上述的培养方法培养获得的间充质干细胞的生理代谢水平好，细胞增殖速度快，细胞活率高，符合间充质干细胞的表型特征，且具有良好的成骨、成软骨以及成脂肪的分化潜能，符合药用级间充质干细胞的标准，可应用于相关的临床研究以及治疗中。

实施例3～10

实施例3～10分别提供了一种药用级间充质干细胞的培养方法。

与实施例1的区别仅在于，实施例3～10中微载体干粉的溶胀条件不同，具体参数参见表1。其余步骤均与实施例1相同。

表1实施例1、实施例3～10的微载体干粉的溶胀条件

实施例11

本实施例提供一种药用级间充质干细胞的培养方法。与实施例1的区别仅在于，本实施例中间充质干细胞的接种终密度为4×10

实施例12

本实施例提供一种药用级间充质干细胞的培养方法。与实施例1的区别仅在于，本实施例中间充质干细胞的接种终密度为6×10

对比例1-10

对比例1-10分别提供了一种药用级间充质干细胞的培养方法。

与实施例1的区别仅在于，对比例1～10中持续性搅拌培养的条件不同，具体参数参见表2。其余步骤均与实施例1相同。

表2实施例1、对比例1～10的持续性搅拌培养的条件

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实施例13

本实施例探究了持续性搅拌培养条件的参数范围对细胞生长的影响。探究的参数包括pH、DO、搅拌转速和培养天数。

具体包括以下步骤：

1.微载体干粉溶胀——同实施例1。

2.接种细胞——同实施例1。

3.间歇式搅拌培养——同实施例1。

4.持续性搅拌培养

通过DoE方法设计持续性搅拌培养的条件。其中，温度设置为37℃；pH设置为7.2、7.4、7.6；DO设置为20％、30％、40％；搅拌转速设置20rpm、30rpm、40rpm；培养天数设置为5d、6d、7d。

通过DoE方法设计18个实验组。通过Minitab软件中的DoE因子设计方法设置实验分组测试pH和DO的9个实验组(搅拌转速为30rpm，培养天数为6天)，具体如表3所示；通过Minitab软件中的DoE因子设计方法设置实验分组测试搅拌转速和培养天数的9个实验组(pH为7.4，DO为30％)，具体如表4所示。

5.测定活细胞密度以及细胞活率。

检测方法如下：分别取实验组培养获得的细胞悬液5mL，使用AO/PI双染试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，参照说明书上的方法对细胞进行染色以及细胞计数，并进行活细胞密度以及细胞活率的测定。

检测结果分别如表3和表4所示。

表3测试pH和DO的实验组设计及活细胞密度、细胞活率的检测结果

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通过Minitab软件分析结果。

(1)关于pH-DO与活细胞密度的分析

图10为pH、DO分别与活细胞密度的主效应图(例如，横坐标pH为7.2时，纵坐标活细胞密度为DO分别为20％、30％、40％时的活细胞密度的平均值；横坐标DO为20％时，纵坐标活细胞密度为pH分别为7.2、7.4、7.6时的活细胞密度的平均值)。

图11为pH、DO与活细胞密度的交互作用图(例如，横坐标pH为7.2时，纵坐标活细胞密度为DO分别为20％、30％、40％时的活细胞密度)。

由图10可知，当pH＝7.4时，活细胞密度最大；当pH高于7.4，活细胞密度迅速降低；当pH低于7.4，活细胞密度同样减少。当DO＝20％时，活细胞密度最大；随着DO浓度升高，活细胞密度降低，DO超过30％后，活细胞密度下降迅速。

由图11可知，当pH＝7.2，同时DO＝20％时，活细胞密度最大；在pH＝7.4，同时DO＝30％时，活细胞密度达到52.5×10

(2)关于pH-DO与细胞活性的分析

图12为pH、DO分别与细胞活性的主效应图(例如，横坐标pH为7.2时，纵坐标细胞活性为DO分别为20％、30％、40％时的细胞活性的平均值；横坐标DO为20％时，纵坐标细胞活性为pH分别为7.2、7.4、7.6时的细胞活性的平均值)。

图13为pH、DO与细胞活性的交互作用图(例如，横坐标pH为7.2时，纵坐标细胞活性为DO分别为20％、30％、40％时的细胞活性)。

由图12可知，当pH＝7.4时，细胞活性最大；当pH升高或降低，细胞活性均减少。当DO＝20％时，细胞活性最大；随着DO浓度升高，细胞活性降低。

由图13可知，当pH＝7.4，同时DO＝20％时，细胞活性达到95％；在pH＝7.4，同时DO＝30％时，细胞活性达到94％，与pH＝7.4，同时DO＝20％时的细胞活性接近。

基于上述，综合考虑活细胞密度和细胞活性，选择将持续性搅拌培养时的pH设置为7.4，同时DO可设置为30％，波动范围可在20-30％之间。

利用软件拟合活细胞密度和细胞活性，分析获得的回归方程如下：

活细胞密度＝45.00+0.000000pH_7.2+0.8333pH_7.4-0.8333pH_7.6+5.833DO_20+5.000DO_30-10.83DO_40+4.167pH*DO_7.220-2.500pH*DO_7.230-1.667pH*DO_7.240-4.167pH*DO_7.420+1.667pH*DO_7.430+2.500pH*DO_7.440+0.000000pH*DO_7.620+0.8333pH*DO_7.630-0.8333pH*DO_7.640。

细胞活性＝0.8700-0.01000pH_7.2+0.01000pH_7.4+0.000000pH_7.6+0.06333DO_20+0.01000DO_30-0.07333DO_40+0.006667pH*DO_7.220-0.06000pH*DO_7.230+0.05333pH*DO_7.240+0.006667pH*DO_7.420+0.05000pH*DO_7.430-0.05667pH*DO_7.440-0.01333pH*DO_7.620+0.01000pH*DO_7.630+0.003333pH*DO_7.640。

通过上述回归方程分别拟合活细胞密度和细胞活性。当pH＝7.4，同时DO＝30％时，利用活细胞密度的回归方程拟合获得的结果为52.5×10

表4测试搅拌转速和培养天数的实验组设计及活细胞密度、细胞活率的检测结果

通过Minitab软件分析结果。

(1)关于搅拌转速-培养天数与活细胞密度的分析

图14为搅拌转速、培养天数分别与活细胞密度的主效应图(例如，横坐标搅拌转速为20rpm时，纵坐标活细胞密度为培养天数分别为5d、6d、7d时的活细胞密度的平均值；横坐标培养天数为5d时，纵坐标活细胞密度为搅拌转速分别为20rpm、30rpm、40rpm时的活细胞密度的平均值)。

图15为搅拌转速、培养天数与活细胞密度的交互作用图(例如，横坐标搅拌转速为20rpm时，纵坐标活细胞密度为培养天数分别为5d、6d、7d时的活细胞密度)。

由图14可知，当搅拌转速为20rpm时，活细胞密度最大；随着搅拌转速越大，活细胞密度迅速降低。当培养天数为5d时，活细胞密度最大；随着培养天数增加，活细胞密度降低。

由图15可知，当搅拌转速为30rpm，同时培养天数为5d时，活细胞密度最大。

(2)关于搅拌转速-培养天数与细胞活性的分析

图16为搅拌转速、培养天数分别与细胞活性的主效应图(例如，横坐标搅拌转速为20rpm时，纵坐标细胞活性为培养天数分别为5d、6d、7d时的细胞活性的平均值；横坐标培养天数为5d时，纵坐标细胞活性为搅拌转速分别为20rpm、30rpm、40rpm时的细胞活性的平均值)。

图17为搅拌转速、培养天数与细胞活性的交互作用图(例如，横坐标搅拌转速为20rpm时，纵坐标细胞活性为培养天数分别为5d、6d、7d时的细胞活性)。

由图16可知，当搅拌转速为20rpm时，细胞活性最大；随着搅拌转速越大，细胞活性迅速降低。当培养天数为5d时，细胞活性最大；随着培养天数增加，细胞活性降低。

由图17可知，当搅拌转速为30rpm，同时培养天数为5d时，细胞活性最大。

基于上述，综合考虑活细胞密度和细胞活性，选择将持续性搅拌培养时的搅拌转速设置为30rpm，同时培养天数设置为5d(即最佳收获时间)。

利用软件拟合活细胞密度和细胞活性，分析获得的回归方程如下：

活细胞密度＝34.58+7.917搅拌转速_20+4.583搅拌转速_30-12.50搅拌转速_40+7.083培养天数_5-1.250培养天数_6-5.833培养天数_7-2.083搅拌转速*培养天数_205+1.250搅拌转速*培养天数_206+0.8333搅拌转速*培养天数_207+6.250搅拌转速*培养天数_305-2.917搅拌转速*培养天数_306-3.333搅拌转速*培养天数_307-4.167搅拌转速*培养天数_405+1.667搅拌转速*培养天数_406+2.500搅拌转速*培养天数_407。

细胞活性＝0.8278+0.04222搅拌转速_20+0.02556搅拌转速_30-0.06778搅拌转速_40+0.06889培养天数_5-0.004444培养天数_6-0.06444培养天数_7-0.01889搅拌转速*培养天数_205+0.02444搅拌转速*培养天数_206-0.005556搅拌转速*培养天数_207+0.01778搅拌转速*培养天数_305-0.01889搅拌转速*培养天数_306+

0.001111搅拌转速*培养天数_307+0.001111搅拌转速*培养天数_405-0.005556搅拌转速*培养天数_406+0.004444搅拌转速*培养天数_407。

综合上述结果及分析得出结论：当pH设置为7.4，DO设置为30％，搅拌转速设置30rpm，培养周期为5天时，可获得最高活细胞密度及细胞活率。

对比例11～18

对比例11～18分别提供了一种药用级间充质干细胞的培养方法。

与实施例1的区别仅在于，对比例11～18中间歇式搅拌培养的参数不同，具体参数参见表5。其余步骤均与实施例1相同。

表5实施例1、对比例11～18的间歇式搅拌培养的条件

性能检测试验

对实施例1、3～12以及对比例1～18中的间充质干细胞的活细胞密度以及细胞活率进行测定，具体步骤参见实施例2，检测结果如表6所示。

表6实施例1、3～12以及对比例1～18中的间充质干细胞的性能检测结果

由表6可以看出，微载体溶胀的条件中，微载体的用量、溶胀温度、搅拌转速和溶胀时间对活细胞密度和细胞活性均有影响。其中，微载体干粉用量为2g/L，溶胀温度37℃，搅拌转速30rpm，溶胀时间3h，此条件下细胞的生长和活性为最佳。细胞的起始接种密度可以控制在(4-6)×10

实施例14-15

本实施例提供了一种药用级间充质干细胞的培养方法。本实施例与实施例1的不同之处在于：生物反应器的体积不同和持续性搅拌方式中的搅拌转速。具体如下：

实施例14，生物反应器中罐体的体积为5L；持续性搅拌方式中的搅拌转速为35rpm。

实施例15，生物反应器中罐体的体积为12.5L，持续性搅拌方式中的搅拌转速为40rpm。

性能检测试验

对实施例1、23～24中的间充质干细胞的生长曲线进行测定，具体步骤参见实施例2，检测结果如图18所示。

图18为实施例1、实施例13、实施例14中不同规模反应器中间充质干细胞的生长曲线。

由图18可知，本申请提供的药用级间充质干细胞的培养方法在500mL，5L和12.5L反应器中重复性良好，活细胞密度均可以达到5×10

实施例16

本实施例提供了一种药用级间充质干细胞的培养方法。本实施例与实施例1的不同之处在于：生物反应器为级联放大培养体系。具体如下：

本实施例中，包括依次并列设置的500mL生物反应器、5L生物反应器和12.5L生物反应器；其中，500mL生物反应器中，持续性搅拌方式中的搅拌转速为30rpm；5L生物反应器中，持续性搅拌方式中的搅拌转速为35rpm；12.5L生物反应器中，持续性搅拌方式中的搅拌转速为40rpm。

本实施例中，该自动化级联放大培养系统全封闭，形成从细胞接种、细胞扩大培养到细胞收获的完整生产工艺路线。级联放大培养体系包括：从500mL生物反应器中接种细胞开始培养，到转移至5L生物反应器中扩增培养，再转移至12.5L生物反应器中进一步扩增并收获。每个规模反应器各配备1套进样瓶和补料瓶。进样瓶、补料瓶与反应器之间，不同规模反应器之间通过硅胶管路连接，形成密闭系统。培养料液可以通过管路进行上级到下级的转移。500mL生物反应器、5L生物反应器和12.5L生物反应器可通过软件操控系统控制各级生物反应器的工艺参数，进行数据记录等。

通过利用本实施例的级联放大培养体系培养间充质干细胞，最后收获的细胞可以达到1000倍扩增。

本申请还提供了一种生物反应器。该生物反应器用于本申请提供的药用级间充质干细胞的培养方法中。在一个具体的实施方式中，实施例1提供的药用级间充质干细胞的培养方法是在该生物反应器进行的。实施例1所用的生物反应器的罐体数量为1个。

如图19(A)所示，该生物反应器包括培养罐、反应器主体和控制器。利用控制器通过反应器主体实时控制培养罐内的参数。

反应器主体外部为304不锈钢材质。反应器本体顶部设置有用于放置培养罐的底座，可将培养罐放置于底座中运行实验。反应器本体可以通过磁驱动的方式控制搅拌速度。可根据培养罐的数量设置底座的数量。

培养罐的数量可以是一个，也可以是多个。具体地，罐体的数量可以是4个。在本申请中，该生物反应器包括4联平行设置的培养罐，反应器本体顶部设置的底座也有4个，可用于同时进行4组平行实验。因此，本申请提供的培养方法结合生物反应器，使得实验过程操作简单，且能够有效提高细胞扩增倍数，降低人力成本，提高细胞生产效率。

培养罐包括罐体和盖子，罐体与盖子旋转密封。在本申请中，罐体为高硼硅玻璃材质，盖子为316L不锈钢材质，盖子与罐体连接处由塑料耐高温开孔盖旋转密封。

培养罐顶部安装有微型电机，并通过磁力联轴器带动罐体内的搅拌桨转动，从而对培养罐内的培养液进行搅拌，带动培养液流动，实现混合的目的。如图20所示，搅拌桨包括沿其轴线方向周向设置的浆叶；所述桨叶沿搅拌桨的轴向方向倾斜设置，倾斜角为30°，数量为8个。培养罐的盖子上部设有不同直径的开口，供插入外部传感器至罐体内部，可以连续监测罐体内部培养液的pH、DO、温度等参数。

反应器本体包括传感器，可通过不同功能的传感器实现同时控制培养罐的不同参数。传感器具体可以是电极。将反应器本体连接的控制不同参数的电极伸入培养罐内，可分别用于控制培养罐内的不同参数。例如，可以通过将不同电极插入培养罐内部实现对培养罐内pH、溶氧浓度、温度的控制。

另外，如图19(B)所示，反应器本体还有补充料液的功能。反应器本体上还对应培养罐设置有蠕动泵。一个培养罐对应三个蠕动泵，可以向培养罐中泵入培养液和微载体等初始物料，也可以在培养过程中按需求添加营养物质，酸液或者碱液。

控制器可以是计算机，利用计算机终端远程控制反应器主体，采集反应器本体运行时的各种参数状态，并可进行自动或者手动控制，从而实现对培养罐内参数的实时控制。

如图19(C)所示，反应器主体的后部还设置有外部气体的进气口，分别是氧气、深层空气、表层空气、二氧化碳气体，利用流量计控制气体进出速度和体积。空气进入培养罐的方式可以是深层通气或者表面通气。细胞培养过程中，可根据培养工艺的需要，每个罐体使用不同的气体或者不同比例的混合气。

生物反应器内pH的调控可以通过向生物反应器内通入二氧化碳气体或者通入酸液调控。当pH偏碱性时，通过蠕动泵向培养体系中通入二氧化碳(99.9％)或者酸液；当pH偏酸性时，通过蠕动泵向培养体系中通入碱液(7.5％碳酸钠溶液)。生物反应器内溶氧浓度可以通过向生物反应器内通入氧气来调控。通过向生物反应器内通入空气和氧气(99.999％)来调控，从而维持培养体系内的溶氧浓度在20-30％。生物反应器内搅拌转速可以通过设置不同的转速来调控。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。