一种比率型荧光探针及其制法和应用

技术领域

本发明属于酶活性检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光探针及其制法和应用。

背景技术

丁酰胆碱酯酶(BChE)是一种丝氨酸水解酶，由肝脏产生，广泛存在于血液、肝脏及神经胶质中。血清中BChE活性的降低常见于肝炎、肝癌等发病过程，而其活性的升高见于阿尔兹海默症、糖尿病、高血压等发病前期。由于有机磷类和氨基甲酸酯类农药能够抑制BChE的活性，血液中BChE活性浓度也是诊断两类农药中毒的重要指标。因此，发展BChE活性的检测方法对相关疾病和农药中毒的早期诊断具有重要意义。

荧光探针具有灵敏度高、特异性强、操作简单、响应快速、成本低等特点，逐渐成为测定BChE的新型工具。目前，已报道的绝大多数BChE荧光探针通过测定酶解产物硫代胆碱的浓度来间接定量酶活性，存在受硫醇干扰严重、灵敏度低、操作繁琐等缺点。现有的数个可直接检测BChE活性的荧光探针大部分都是增强型荧光探针，仅能依据荧光强度定量酶活性，检测结果容易受到探针浓度分布、光稳定性、微环境(pH值，极性，温度等)、仪器稳定性等多种不确性因素的影响，准确性较低。相比而言，比率型荧光探针利用两(或多)波长处荧光强度比值对目标物进行定量，通过自校正方式能够有效降低探针浓度、微环境、光源强度等因素的干扰，对BChE活性的定量结果更准确。

因此，如何设计并合成一种高效的比率型荧光探针以实现丁酰胆碱酯酶活性的精准检测是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种比率型荧光探针及其制法和应用，该比率型荧光探针特别适用于丁酰胆碱酯酶活性的检测，具有高灵敏度、高选择性、快速响应的优点。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种比率型荧光探针，具有式(1)所示结构：

第二方面，本发明提供一种上述比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

在碱的条件下，式(2)化合物与环丙基甲酰氯在有机溶剂中反应，得到式(1)化合物；

作为优选，相对于1毫摩尔的式(2)化合物，所述环丙基甲酰氯的用量为1～6毫摩尔，所述碱的用量为2～12毫摩尔，所述有机溶剂的用量为20～60毫升。

作为优选，所述碱选自碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、吡啶、哌嗪、三乙胺、N,N-二甲氨基吡啶中的至少一种；所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃、乙腈、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的至少一种。

作为优选，所述反应的温度为-20℃～40℃；反应时间为2～12小时。

第三方面，本发明提供上述比率型荧光探针或上述制备方法制备得到的比率型荧光探针在检测丁酰胆碱酯酶活性中的应用。

第四方面，本发明提供上述比率型荧光探针或上述制备方法制备得到的比率型荧光探针在监测有机磷农药和氨基甲酸酯农药对丁酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用；优选的，所述有机磷农药选自对氧磷、甲拌磷、敌百虫、甲胺磷、敌敌畏、马拉硫磷、毒死蜱、乐果、对硫磷中的一种或任意几种的组合，所述氨基甲酸酯农药选自西维因、涕灭威、克百威、灭多威中的一种或任意几种的组合。

第五方面，本发明提供一种丁酰胆碱酯酶活性的检测方法，包括以下步骤：

将上述比率型荧光探针或上述制备方法制备得到的比率型荧光探针加入到待测样品中，在一定温度下进行孵育，测定生成的荧光物质的荧光光谱，可观察到两个发射峰，通过测量并计算两个发射峰的强度比，利用该比值与丁酰胆碱酯酶浓度的对应关系能够定量丁酰胆碱酯酶的活性。孵育过程中，使所述荧光探针与待测样品中的丁酰胆碱酯酶反应后脱去环丙甲酰基团，生成式(2)所示化合物。

作为优选，所述孵育的温度为20-45℃，pH值为4-8，时间为20-60min；

所述测定生成的荧光物质的荧光光谱具体为：对所述生成的荧光物质使用370-450nm光进行激发，存在荧光发射，该发射波长范围为400-800nm，可观察到两个发射峰。

本发明所取得的有益效果：

(1)本发明的比率型荧光探针利用其双发射峰的荧光强度比值对丁酰胆碱酯酶活性进行分析，通过自校正方式能够有效降低探针浓度、微环境、光源强度等因素的干扰，检测结果的精准度高。此外，所述的荧光探针对丁酰胆碱酯酶灵敏度高，并且不受离子、氨基酸、多糖和蛋白质等共存物的干扰。

(2)本发明的比率型荧光探针合成步骤简单、易于分离纯化，具有良好的稳定性，适合批量生产，有利于商业化的推广应用.

(3)本发明的比率型荧光探针不仅能够应用于丁酰胆碱酯酶活性的检测，还能够应用于监测有机磷农药和氨基甲酸酯农药对丁酰胆碱酯酶的抑制作用，在有机磷中毒的诊断和农药残留的检测中极具市场应用与推广价值。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明荧光探针的

图2是本发明荧光探针的

图3是本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应前后的吸收光谱(a)和荧光光谱(b)。

图4是本发明探针的荧光光谱对丁酰胆碱酯酶的响应性(a)和其双发射峰的荧光强度比值与丁酰胆碱酯酶的活性浓度之间的线性关系(b)。

图5是本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶在加入抑制剂反应后的荧光光谱(a)与抑制效率曲线(b)。

图6是本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶在加入对氧磷反应后的荧光光谱(a)与抑制效率曲线(b)。

图7是本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶在加入克百威反应后的荧光光谱(a)与抑制效率曲线(b)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。

化合物1由以下方法制备：将化合物2(159.1mg，0.5mmol)溶于25mL甲苯中，加入CH

化合物2由以下方法制备：将4-羟基-1,8-萘二甲酸酐(0.428g,2mmol)和2-(2-氨基乙基)吡啶(263μL，2.2mmol)加入到无水乙醇(60mL)中，加热至回流，反应12小时后，自然冷却至室温。反应液经减压浓缩至20mL左右，有白色沉淀析出，过滤出沉淀物，得到化合物2。

4-羟基-1,8-萘二甲酸酐购自郑州艾菲尔特化工有限公司，2-(2-氨基乙基)吡啶、碘甲烷等试剂购自北京伊诺凯科技有限公司。

实施例1荧光探针的合成

本实施例制备荧光探针的合成路线如下：

其具体的合成步骤如下：

将化合物1(167mg，0.36mmol)溶于50mL CH

图1为比率型荧光探针的

图2为比率型荧光探针的

1

实验例1：荧光探针在缓冲溶液中与丁酰胆碱酯酶反应能力测试

(1)将实施例1制备的荧光探针配制成DMSO储备液(浓度为0.2mM)，加入到EP管中，然后向管中依次加入去离子水、PBS缓冲液(浓度为200mM，pH 7)和BChE的储备液(浓度为1U/mL)。溶液总体积为1mL，探针的终浓度为10μM，PBS的终浓度为20mM，BChE的终浓度为0.2U/mL。以上溶液在37℃的恒温培养箱中放置1小时，然后测定其吸收光谱和荧光光谱。

图3为探针与BChE反应前后的吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)。探针与BChE反应后，其吸收峰由345nm红移至450nm(图3a)；其在467nm发射峰处的荧光强度略有降低，在555nm处的荧光强度显著增强而形成一个新的发射峰(图3b)。该结果表明探针对BChE具有典型的双通道荧光响应。

取系列EP管，分别加入探针的DMSO储备液、去离子水、PBS缓冲液和不同体积的BChE的储备液。溶液总体积为1mL，探针的终浓度为10μM，PBS的终浓度为20mM，BChE的终浓度为0-0.2U/mL。以上溶液在37℃的恒温培养箱中放置1小时，然后测定其荧光光谱。

图4为探针对BChE浓度的滴定实验。随着BChE浓度的逐渐增加至2.0U/mL，探针在467nm发射峰处的荧光强度略有降低，但在555nm发射峰处的荧光强度逐步升高(图4a)。探针在两个发射峰处的荧光强度比值F

实验例2：荧光探针的抑制剂表征

用不同浓度的苯甲基磺酰氟(PMSF，BChE抑制剂)与BChE(0.2U/mL)预处理30分钟，然后再与探针(10μM)在37℃孵育1小时后检测荧光光谱变化。

图5为探针与抑制剂预处理的BChE反应后的荧光光谱。随着PMSF的浓度逐渐增加至200μM，探针在555nm处的荧光强度逐渐降低(图5a)，表明PMSF对BChE具有明显的抑制作用，并且抑制率与PMSF浓度(≤200μM)的对数呈现良好的线性关系(R

实验例3：荧光探针用于监测有机磷农药对BChE的抑制作用

用不同浓度的对氧磷(paraxon，有机磷农药)与BChE(0.2U/mL)预处理30分钟，然后再与探针(10μM)在37℃孵育1小时后检测荧光光谱变化。

图6为探针与有机磷预处理的BChE反应后的荧光光谱。随着对氧磷的浓度逐渐增加至1000ng/mL，探针在555nm处的荧光强度逐渐降低(图6a)，表明对氧磷对BChE具有明显的抑制作用。抑制率与对氧磷浓度(≤200ng/mL)的对数呈现良好的线性关系(R

实验例4：荧光探针用于监测氨基甲酸酯农药对BChE的抑制作用

用不同浓度的克百威(carbofuran，氨基甲酸酯农药)与BChE(0.2U/mL)预处理30分钟，然后再与探针(10μM)在37℃孵育1小时后检测荧光光谱变化。

图7为探针与氨基甲酸酯预处理的BChE反应后的荧光光谱。随着克百威的浓度逐渐增加至1400ng/mL，探针在555nm处的荧光强度逐渐降低(图7a)，表明克百威对BChE具有明显的抑制作用。抑制率与克百威浓度(≤1200ng/mL)的对数呈现良好的线性关系(R

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。