一种长链非编码RNA在制备治疗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种长链非编码RNA在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

背景技术

肺纤维化是肺损伤、间质性肺疾病等多种肺部疾病终末期的病理过程。肺组织的纤维化导致正常肺组织结构改变、功能丧失，患者由缺氧最终进展为呼吸衰竭、死亡。近年来，由于职业因素、家居环境因素、空气污染雾霾和药物使用等因素，使肺纤维化的发病率逐年上升，一旦确诊为肺纤维化，患者大多生存时间只有3至5年，病死率高，五年生存率仅为23％，其治疗仍属世界性难题。有研究表明口服吡非尼酮和尼达尼布克可缓解肺纤维化进展，为患者带来新希望，但仍不足以降低肺纤维化的高致死率，需要新的治疗方式和思路。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200nt，不具有编码功能的RNA。LncRNA表达具有时空特异性，能在染色质重塑、转录调控以及转录后加工等多种水平调节基因的表达，参与多种疾病的发生和发展。随着非编码人类转录组越来越多的作用被发掘，研究者们开始从中探索新的治疗策略，寻求新的机遇。但是目前能够有效治疗肺纤维的LncRNA研究报道较少，因此本发明提供一种长链非编码RNA在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种长链非编码RNA在制备治疗肺纤维化药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该长链非编码RNA可缓解肺纤维化以及肺组织中炎症细胞的浸润，减少肺部血清和组织中的炎症细胞因子IL-6和IL-1β产生，提高小鼠生存率，为开发治疗肺纤维化的药物提供了新策略。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种长链非编码RNA(lncENAF)在制备治疗肺纤维化药物中的应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述长链非编码RNA通过减少肺组织中炎症细胞的浸润、降低肺泡灌洗液的总蛋白浓度和白细胞数量，以及减少炎症因子的表达量，实现治疗肺纤维化的功效。

进一步地，所述炎症因子包括IL-6和IL-1β。

进一步地，所述减少炎症因子的表达量具体为：减少血清和肺组织中的炎症因子表达量。

本发明还提供一种腺相关病毒重组载体在制备治疗肺纤维化药物中的应用，所述重组载体包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述重组载体通过上调表达SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，达到治疗肺纤维化的作用。

本发明还提供一种治疗肺纤维化的药物，所述药物包括上述的长链非编码RNA或上述的重组载体。

本发明公开了以下技术效果：

本发明先利用雾化吸入博来霉素构建肺纤维化小鼠模型，进一步通过雾化吸入lncENAF腺相关病毒液进行治疗，结果显示lncENAF不但可以减轻肺组织中炎症细胞的浸润，而且还可以减少肺部血清和组织中的炎症细胞因子IL-6和IL-1β产生，延缓肺纤维化，提高小鼠生存率，说明lncENAF是一种有望用于肺纤维化治疗的lncRNA。本发明研究为开发治疗肺纤维化的药物提供了新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HE染色观察各组小鼠肺脏的病理情况；

图2为观察6组小鼠1周内的生存情况，并作K-M生存曲线图进行分析；

图3为LncENAF对博来霉素刺激下的肺纤维化小鼠体内炎症反应影响的检测；A：利用BCA法对各组小鼠肺泡灌洗液中的蛋白浓度进行测定；B：利用改良牛鲍计数板法对各组小鼠肺泡灌洗液中的白细胞总数进行计数；C：利用ELISA实验检测各组小鼠血清中IL-6的蛋白浓度；D：利用ELISA实验检测各组小鼠血清中IL-1β的蛋白浓度；E：利用RT-qPCR检测肺组织中Il-6的mRNA相对表达量；F：利用RT-qPCR检测肺组织中Il-1β的mRNA相对表达量；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；

图4为CD68免疫组化染色观察各组小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞阳性视野的数量。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

在前期研究工作中，发明人团队通过转录组测序发现了一条在小鼠脂肪肝中高表达的lncRNA-lncENAF，进一步发现其可以影响小鼠体内外巨噬细胞炎症因子表达水平。所述lncENAF的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO：1)：

ATTGTACACCATGCAGACAAAGCGCTCAAACACTTGCAATGCTGGGCTTTCTCCCAATATCCTCTGCCATCTTTCCTACCCTTATAAAAGTCCAGAAAGAAAATAATCATTCTATCTGGAGGTGGGGGCCACTTCTTTAATCCTGGCACTTGGGAAGCAGAGGTAGGTGTATTGCTTTGAGTTCAAGACCAGACTGGTCTACAAAGTGAGTTCCGGGACAGTCAGGACTGTTGAACTTGGAAGCCTTGTCCTCAAATTTCTGGCAATTTTACTAGCACCAGTCTTCCCGCCTCAGCCTCCAGTGTCTTCCTGAGATGATCTGACTGCATGAAATGCCCTCGCCTCATTTTAGTTGGCTGGCCCTAAGGTCAAGGTAAATCCGCGCCCAAGCTGCCCGGTGGAGGTGGTCTCAGAGGGTGCTGCGGGATCGAGGTAGTGAGGAGACTAGATCGCAAGACGTGATCCTCACATTTATTTGCCTGGAGTTCTCATGCCAGAGAACCTGGCAGATTTTACTATTTCCCAATTGTTTACTCGCCAAGCTTTCAGGTCCACGCGCCTCAGGGCTGCGCCTCTCACTCTGAAACTTCATTCAAAGGCCAGGCAGGGAGGCCCAAGAGGTGGCGAATGGGCTTGAGTATGACCTCAAGGCC。

基于此，本发明探究lncENAF在小鼠肺纤维化中的作用，先利用雾化注射博来霉素构建肺纤维化小鼠模型，进一步通过雾化lncENAF腺相关病毒液对肺纤维化进行治疗，以此验证lncENAF对肺纤维是否有治疗效果。试验如下：

一、腺相关病毒的制备过程

(1)腺相关病毒载体的构建：构建pAV-CMV-GFP-P2A-lncENAF表达载体

首先将pAV-CMV-GFP-P2A载体进行AsiS I和MluI双酶切(37℃水浴锅2h)，然后进行电泳，回收切割后的载体片段(凝胶回收试剂盒具体步骤参考：碧云天生物技术试剂盒说明书(产品编号D0056))；

其次，使用PCR获得lncENAF目的片段，并进行与载体的连接，转化获得重组载体。

将PCR引物(F-

PCR产物进行凝胶电泳，利用碧云天生物技术试剂盒(产品编号D0056)对653bp左右的DNA片段进行回收。

将PCR回收的产物与pAV-CMV-GFP-P2A载体进行AsiS I和MluI双酶切的产物利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(Takara：6022Q)试剂盒，按照说明书进行连接，获得重组质粒。

(2)腺相关病毒的生产：

首先，大量制备重组质粒，利用康为世纪生物有限公司的GoldVac EndoFreePlasmid Maxi Kit试剂盒(CW2107)说明书进行操作。

然后进行重组腺相关病毒载体的包装和纯化，具有步骤如下：

①准备细胞：将培养AAV-293细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4℃冰箱取出的0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37℃水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50μL混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450μL 10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10μL细胞于计数板中计数。

②做脂质体转染复合物：Opti MEM需在37℃水浴中预热，VGF转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的复合物成分如下：

pAAV-RC 10μg、pHelper 20μg和pAV-CMV-GFP-P2A-lncENAF 10μg，转染后6h换新鲜培液。

③病毒收集

转染后72h，将100mm培养皿中所有细胞用300μL的PBS收于15mL离心管中。打开恒温水浴锅至37℃，将15mL离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。

④病毒纯化

1)全能核酸酶处理

加Benonase酶处理(每10mL病毒粗提物中加入1μL--Benonase酶-E1014)，37℃孵育1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒DNA。4000rpm，4℃，离心10min，取上清。

2)柱纯化

首先，取出上步得到的AAV病毒液，加入PBS补充到4mL，用0.45um的滤膜过滤。加入1/4病毒体积的Buffer P，充分混匀，于4℃放置过夜。3000rpm，4℃离心30min，弃上清，可观察到明显的病毒沉淀。

其次，离心的同时，将树脂柱放入到15mL锥形试管中，1000rpm离心2min。扯掉柱子底部，将柱子放入到15mL试管中，拧松帽子，让buffer能随重力流下。一旦液体停止流动，加入4mL Buffer S，让其随重力流下。加4mL Buffer S溶解重悬病毒沉淀。

再次，3000rpm，4℃离心5min.将澄清的上清液转移到一个干净的试管中，再一次3000rpm，4℃，离心5min.将澄清的上清液转移到干净的试管。

将上步得到的澄清的病毒液加入到4mL Centrifugal Device中，3000rpm离心15-20min，直到样品体积达到300μL左右。将病毒样品转移到一个干净的管子里，再加100μL的Buffer S清洗浓缩管，收集病毒。

将上步得到的病毒样品，一滴一滴的加入到柱子中，让其随重力结合到树脂上。

加入4mL Buffer S入树脂中，溶出AAV病毒。

将上步得到的4mL AAV病毒样品液体，加入到4mL Centrifugal Device中，3000rpm离心10-30min，约有200μL左右AAV浓缩液出来。收集最终得到的纯化后的病毒，于-70℃保存。

二、实验动物分组及给药

1.1小鼠分组

将C57BL/6小鼠随机分为6组，分别为对照组+雾化生理盐水、对照组+雾化AAV-GFP、对照组+雾化AAV-lncENAF、博来霉素+雾化生理盐水、博来霉素+雾化AAV-GFP和博来霉素+雾化AAV-lncENAF。每组6只。

1.2建立小鼠肺纤维化模型及干预给药方法

将实验小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉后，参考雾化针(北京慧荣和科技有限公司：肺部液体定量雾化器(HRH-MAG4))的使用方法，气管内注射博来霉素(Bleomycin)药品(用量为2U雾化给药)构建肺纤维化模型。其他组雾化相同体积的生理盐水。待小鼠建模3天后，进行干预给药，对照组给药生理盐水或AAV-GFP，实验组给药AAV-lncENAF(每次给药200μL，病毒滴度为10

三、提取小鼠肺泡灌洗液实验

待给药2周后处死小鼠，采用常规方法用PBS/生理盐水轻柔灌洗肺组织，收集肺泡灌洗夜。

四、小鼠肺组织的HE染色及CD68免疫组化染色

具体步骤如下：

(1)首先按上述提取肺泡灌洗液的步骤进行放血、解剖、埋线、插针，此时为保证肺组织内部也能得到充分固定，需向肺内注射200μL的4％多聚甲醛固定液；

(2)结扎线头，打死结，防止固定液漏出；

(3)分离肺组织，将小鼠的整只肺完全浸入4％多聚甲醛固定液中；

(4)小鼠肺组织的HE染色与免疫组化染色均委托苏州堪赛尔医学检验有限公司进行。HE染色观察各组小鼠肺组织的病理情况(见图1)；CD68免疫组化染色观察各组小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞阳性视野的数量(见图4)；

结果如图1、图4所示，图1结果显示：HE染色观察小鼠肺脏的病理情况，可见对照组中肺组织结构完整、肺泡排列整齐、未见明显的炎症细胞，而博来霉素组的肺组织发生纤维化，其肺组织结构被破坏、肺泡腔消失、可见明显炎症细胞的浸润、间质有水肿出血的现象，经lncENAF病毒液治疗后，肺组织的病变情况明显得到改善；图1结果表明lncENAF可以缓解肺部的纤维化。图4结果表明：经博来霉素刺激后CD68的阳性视野增多，经lncENAF治疗后，阳性视野明显减少，即lncENAF可以减少肺组织中炎症细胞的浸润。

五、小鼠生存率分析

利用Origin软件对6组小鼠在8天内的生存情况进行统计分析并作K-M生存曲线图(见图2)，图2结果显示：造模1周后，对照组的小鼠生存率均为1，博来霉素组生存率均低于1，但经lncENAF治疗后，生存率显著上升，结果表明lncENAF可以延长小鼠寿命。

六、BCA法检测小鼠肺泡灌洗液上清中的蛋白浓度

参考BCA测定试剂盒(Beyotime：BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)，具体步骤如下：

(1)对提取的肺泡灌洗液进行离心取上清，设置4℃，1500rpm，离心10min；

(2)参考BCA试剂盒说明书配置0.5mg/mL的BSA蛋白标准品；

(3)预先配制BCA工作液。若为N个样品，配置体系则按(N+1)个样品配置BCA工作液，A液和B液的配置比例为50:1；

(4)按照下表准备标准曲线体系：

表1标准曲线体系

即在96孔板中将0.5mg/mL蛋白标准品梯度稀释为0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL；

(5)在96孔板中加入2μL的肺泡灌洗液上清，再用PBS补齐至20μL；

(6)再加入200μL的BCA工作液，注意不要产生气泡；

(7)37℃放置30min；

(8)使用Molecular Devices酶标仪检测样品在562nm处的OD值。根据标准曲线公式Y＝bX+a(X为浓度，Y为吸光度值)，计算出样品的蛋白浓度。同时注意R2≥0.990。利用上述BCA检测法检测提取的小鼠肺泡灌洗液的蛋白浓度(见图3中A)，结果表明：博来霉素组肺泡灌洗液的总蛋白浓度较对照组均升高，与博来霉素+雾化AAV-GFP组(5.49±1.52mg/mL)相比，经lncENAF治疗后肺泡灌洗液中总蛋白浓度(3.10±0.57mg/mL)显著降低(P＜0.01)。

七、改良牛鲍计数板计数法检测小鼠肺泡灌洗液中的白细胞总数

具体步骤如下：

(1)上述小鼠的肺泡灌洗液经离心取上清用于检测蛋白浓度后，留取沉淀进行白细胞总数的计数；

(2)此时沉淀为红色，首先需用500μL 0.45％的生理盐水溶解红细胞，置于冰上静置20min，待液体呈鲜红色离心，设置4℃，1500rpm，离心10min，弃上清，此时沉淀为白色，用1mL冰的PBS重悬细胞沉淀，吹打混匀后取10μL于改良牛鲍计数板上进行白细胞总数计数(见图3中B)，结果表明：博来霉素组肺泡灌洗液的白细胞总数较对照组均升高，与博来霉素+雾化AAV-GFP组((878.67±266.84)×10

八、酶联免疫法检测小鼠血清中的细胞因子IL-6、IL-1β

参考IL-6、IL-1β试剂盒(MultiSciences：小鼠白介素6ELISA试剂盒(70-EK206/3)、小鼠白介素1βELISA试剂盒(70-EK201B/3)，具体步骤如下：

(1)离心管收集血清。血样凝集30分钟后，1,000g离心10min。吸取血清样本之后即刻检测，或者分装，-20℃以下贮存；

(2)稀释标准品：标准品开盖前短暂离心，用蒸馏水重溶小鼠IL-6标准品，重溶体积标注于标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为1000pg/mL。重溶后静置20min；

(3)取230μL浓缩的小鼠IL-6标准品，加入230μL标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度(500pg/mL)。在每一个试管中加入230μL标准品稀释液。使用高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度；

(4)检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温，准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品；

(5)将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口；

(6)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30s，弃掉洗液，在吸水纸上将微孔板拍干(洗板完成之后，立即使用微孔板，不要让微孔板干燥)；

(7)加样：标准品孔加入100μL 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品稀释液，样本孔加入90μL 1×检测缓冲液和10μL样本；

(8)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释)。步骤(7)、(8)连续加样，不要间断，加样过程在15min内完成；

(9)孵育：使用封板膜封板，300rpm/min振荡，室温孵育1.5h(IL-6)、2h(IL-1β)；

(10)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次，每次洗板，在吸水纸上拍干；

(11)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；

(12)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm/min振荡，室温孵育30min(IL-6)、45min(IL-1β)；

(13)洗涤：重复步骤(10)；

(14)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，室温孵育5-30min；

(15)加终止液：每孔加入100μL终止液，颜色由蓝色变为黄色(如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，轻轻叩击板框，充分混匀)；

(16)检测读数：在30min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm的测定值，仅使用450nm测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。在小鼠血清中检测IL-6、IL-1β的蛋白浓度(见图3中C-D)，结果表明：与博来霉素+雾化AAV-GFP组相比，雾化lncENAF组小鼠血清中IL-6、IL-1β的蛋白浓度均降低，但IL-6的蛋白浓度2组间无显著差异(P＞0.05)(图3中C)，IL-1β的蛋白浓度2组分别为：11.59±7.09pg/mL、6.21±3.00pg/mL，有显著差异(P＜0.05)(图3中D)。

九、提取小鼠肺组织RNA和qPCR

(1)首先从RNA保护液中取绿豆大小的小鼠肺组织加入TRIzol试剂进行研磨；

(2)在冰上沉淀5min充分裂解，加入1/5体积的氯仿，立即涡旋15sec充分混匀；

(3)在冰上沉淀5min，设置4℃，14,000rpm，离心12min；

(4)提前预冷异丙醇并准备好相应数量的1.5mL去酶EP管，做好标记；

(5)用移液枪吸取适量体积的上清液(切勿吸到离心管管壁上的白色沉淀以及管底的TRlzol试剂)转移至上述标记的去酶EP管中；

(6)加入等体积的异丙醇沉淀RNA。上下颠倒混匀后，冰上沉淀10min；

(7)14000rpm 4℃离心30min，小心弃去上清；

(8)加入80％乙醇(DEPC水配制)清洗沉淀，14000rpm 4℃离心15min，小心弃去上清，42℃烘干沉淀，约3分钟；

(9)加入10μL DEPC水溶解RNA；

(10)逆转录和qPCR步骤参考南京诺唯赞试剂盒(NO:R223-01)如下：

Ⅰ、逆转录

①去除基因组DNA

表2去除基因组DNA的试剂

用移液枪轻轻吹打混匀后，将EP管放入PCR仪器中，设置程序运行42℃，2min。

②配制逆转录反应体系

表3逆转录反应体系

用移液枪轻轻吹打混匀混合液，再将EP管短暂离心，2000rpm，离心10sec，放置PCR仪器进行下一步。

③逆转录反应

表4逆转录反应条件

PCR程序结束后，cDNA样本放置在-20℃冰箱保存。

Ⅱ、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

参考南京诺唯赞试剂盒(NO：Q311-02)步骤如下：

表5引物序列

①配制反应体系

表6反应体系

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在八联管中做好标记，按顺序加入上述混合液20μL/孔。将八联管放入离心机配平后，短暂离心收集反应液。

②PCR反应(在CFX96 Real-Time PCR System仪器操作)

表7PCR反应程序

反应后基因的相对表达水平按照2

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。