在重组产生的RSV蛋白质的纯化方法中对阴离子交换色谱法所用洗涤溶液的改进

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技术领域

本发明涉及制备呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的方法。更特别地，本发明涉及重组产生的RSV蛋白质的纯化方法，包括阴离子交换色谱法步骤。

发明背景

在遗传工程改造的宿主细胞中产生、从生物反应器收获、然后在设计用来为终产品赋予高度纯度的受控多步方法中纯化重组蛋白质，比如用于治疗或预防性意图的那些。

主要挑战之一是降低杂质尤其是残余的宿主细胞蛋白质(HCPs)，其是通过用于制备治疗性蛋白质的宿主细胞表达的蛋白质。

虽然从法规的立场来说可以对于全部生物药学产品不存在任何定义的HCP可接受水平，但是根据具体情况需要最小化HCP水平以便最小化任何关联的安全风险和对效力的负面作用。

治疗或预防性用途蛋白质的纯化方法中牵涉的常规步骤之一由阴离子交换色谱法步骤组成，其中将包含靶标蛋白质的负载溶液施用至阴离子交换色谱法介质，其例如呈色谱法柱中安排的树脂形式。

所述阴离子交换色谱法柱可以以结合-和-洗脱模式操作，其中

-将从收获的细胞培养液获得且包含RSV蛋白质的负载溶液与阴离子交换色谱法介质接触，由此RSV蛋白质结合至阴离子交换色谱法介质；

-为了移除杂质，用至少一种洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱法介质；和

-从阴离子交换色谱法介质洗脱RSV蛋白质。

一般期望的是，随阴离子交换剂的操作pH降低，感兴趣的蛋白质会失去结合能力。因此，在所述方法中一般使用具有约7.0或更高pH的洗涤溶液来保持产品结合。对于阴离子交换步骤一般不追求更低的pH条件，原因在于普遍接受的原理表明随pH降低蛋白质将具有更少的表面负电荷，从而影响蛋白质结合至介质的能力。

发明概要

然而，发明人已发现聚糖部分唾液酸化的蛋白质具有额外的负电荷，其使得蛋白质可以在更低的pH条件下保持结合至阴离子交换介质。已发现的是，作为蛋白质聚糖修饰的一部分的唾液酸含量增加表面电荷总量并且在较低的pH范围保持蛋白质结合。

发明人还已发现的是，pH条件是HCP降低的显著因素并且使用低pH条件的洗涤溶液显示宿主细胞蛋白质的有效移除。

根据本发明的第一方面，用至少一种pH为3.0至6.5的低pH洗涤溶液洗涤阴离子交换色谱法介质，由此宿主细胞蛋白质的移除被增强。

根据本发明的优选实施方式：

-负载溶液的pH是7.0至8.5，优选约7.5；

-所述低pH洗涤溶液的pH是4.0至6.0，优选4.5至5.5，优选约5.0；

-所述低pH洗涤溶液包含乙酸盐(acetate)；

-在所述低pH洗涤溶液中乙酸盐的浓度是56至84mM，优选63至77mM，优选约70mM；

-在洗脱RSV蛋白质之前，用至少一种pH为7.0至8.0、优选约7.5的第一高pH洗涤溶液进一步洗涤阴离子交换色谱法介质；

-所述第一高pH洗涤溶液包含浓度为18至22mM、优选约20mM的Tris；

-所述第一高pH洗涤溶液包含浓度为45至55mM、优选约50mM的NaCl；

-使用所述第一高pH洗涤溶液的洗涤步骤在使用所述低pH洗涤溶液的洗涤步骤之前进行；

-在洗脱RSV蛋白质之前，用至少一种pH为7.0至8.0、优选约7.5的第二高pH洗涤溶液进一步洗涤阴离子交换色谱法介质；

-所述第二高pH洗涤溶液包含浓度为45至55mM、优选约50mM的Tris；

-所述第二高pH洗涤溶液包含浓度为18至22mM、优选约20mM的NaCl；

-使用所述第二高pH洗涤溶液的洗涤步骤在使用所述低pH洗涤溶液的洗涤步骤之后进行。所述进一步洗涤步骤使得产品可以在恒定pH洗脱；

-用具有7.0至8.0、优选约7.5的pH的洗脱溶液洗脱RSV蛋白质；

-所述洗脱溶液包含浓度为146至180mM、优选约163mM的NaCl；

-所述洗脱溶液包含浓度为18至22mM、优选约20mM的Tris；

-负载挑战包含7.5至15.0mg每ml阴离子交换色谱法介质；

-方法还包括cHA色谱法步骤；

-方法还包括HIC色谱法步骤；

-所述阴离子交换色谱法、cHA色谱法和HIC色谱法步骤以该顺序依次进行；

-RSV蛋白质是来自RSV亚群A或RSV亚群B的蛋白质；

-RSV蛋白质是RSV F蛋白质；

-RSV F蛋白质呈融合前构象；

-RSV F蛋白质是任何RSV亚型的野生型F蛋白质的突变体，其含有一个或多个引入的突变；

-RSV F突变体是以融合前构象稳定化的；

-RSV F突变体特异性结合至抗体D25或AM-14；

-RSV蛋白质经配制用作可注射的药物产品。

在本发明的进一步方面中，提供药物产品，其包括通过根据本发明的第一方面的方法纯化的RSV蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是来自RSV亚群A的RSV F蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是来自RSV亚群B的RSV F蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是呈融合前构象的RSV F蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F突变体蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是以融合前构象稳定化的RSV F突变体蛋白质。

在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是三聚体形式的RSVF突变体蛋白质。

在优选的实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是三聚体形式且以融合前构象稳定化的RSV F突变体蛋白质。

在最优选的实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是三聚体形式且和以融合前构象稳定化的RSV F突变体蛋白质，其包含与所述F突变体蛋白质的F1多肽C-末端连接的三聚体化域。

在具体实施方式中，所述三聚体化域是T4 fibritin foldon域。

在具体实施方式中，所述T4 fibritin foldon域具有氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO：40)。

在优选的实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是特异性结合至抗体D25和/或AM-14的RSV F突变体。优选，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是特异性结合至抗体D25和AM-14的RSV F突变体。

来自不同RSV亚型的许多天然RSV F蛋白质的氨基酸序列以及编码所述蛋白质的核酸序列是本领域已知的。例如，数种亚型A、B和牛RSV F0前体蛋白质的序列描述于WO2017/109629，SEQ ID NOs：1、2、4、6和81-270中，其描述于本文提交的序列表中。在说明书中对SEQ ID NOs的任何提及都是指WO 2017/109629中的那些，其包括在作为本说明书的一部分提交的.txt文件中包含的序列表中，并且通过援引将该序列表全部并入本文。

不同RSV亚型的天然RSV F蛋白质展示显著的序列保守性。例如，在F0前体分子中，RSV亚型A和B共享90％的序列同一性，而RSV亚型A和B各自与牛RSV F蛋白质共享81％的序列同一性。在各RSV亚型中F0序列同一性甚至更高；例如，在RSV A、B和牛亚型各自当中，RSVF0前体蛋白质具有约98％的序列同一性。几乎全部鉴定的RSV F0前体序列在长度上由574个氨基酸组成，其长度的微小差异一般是由于C-末端胞质尾的长度。各种天然RSV F蛋白质的序列同一性是本领域已知的(参见例如WO 2014/160463)。为了进一步说明F蛋白质序列保守性的水平，来自代表性RSV A株和RSV B株的F0前体多肽序列的非共有氨基酸残基分别提供于WO 2014/160463的表17和18中(其中在用ClustalX(v.2)排列所选的RSV A株F蛋白质序列之后鉴定非共有氨基酸)。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F突变体，其包含在WO 2017/109629中称为"工程改造的二硫键突变(engineered disulfidebond mutation)"的胱氨酸突变对，其中该突变体包含引入的突变，其与在WO 2017/109629表1和4-6中提供的任何示范性突变体的引入的突变相同。在WO 2017/109629表1和4-6中提供的示范性RSV F突变体基于RSV A2株的相同天然F0序列，其在位置102、379和447具有三个天然取代(SEQ ID NO：3)。能够对任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列进行各突变体中相同的引入的突变从而获得不同的RSV F突变体，比如SEQ ID NOs：1、2、4、6和81-270任一中描述的天然F0多肽序列。基于任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列并且包含任意工程改造的二硫化物突变的RSV F突变体也属于本发明范围以内。在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含至少一个工程改造的二硫化物突变，所述突变选自：55C和188C；155C和290C；103C和148C；以及142C和371C，比如S55C和L188C，S155C和S290C，T103C和I148C，或者L142C和N371C。

在其它实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F突变体，其包含一个或多个空腔填充突变。术语"空腔填充突变"是指期望填充成熟RSV F蛋白质内部空腔的氨基酸对野生型RSV F蛋白质中的氨基酸残基的取代。在一种应用中，所述空腔填充突变有助于稳定化RSV F蛋白质突变体的融合前构象。RSV F蛋白质的融合前构象中的空腔能够通过本领域已知的方法鉴定，比如通过视觉检查融合前构象RSV F的晶体结构进行，或者通过使用蛋白质设计计算软件(比如BioLuminateTM[BioLuminate,SchrodingerLLC,New York,2015]，Discovery StudioTM[Discovery Studio Modeling Environment,Accelrys,San Diego,2015]，MOETM[Molecular Operating Environment,ChemicalComputing Group Inc.,Montreal,2015]和RosettaTM[Rosetta,University ofWashington,Seattle,2015])进行。将被空腔填充突变替换的氨基酸一般包括小脂族(例如Gly、Ala和Val)或小极性氨基酸(例如Ser和Thr)。它们还可以包括在融合前构象中包埋但是在后构象中暴露于溶剂的氨基酸。替换氨基酸能够是大脂族氨基酸(Ile、Leu和Met)或大芳族氨基酸(His、Phe、Tyr和Trp)。例如，在数种实施方式中，RSV F蛋白质突变体包括T54H突变。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含一个或多个空腔填充突变，所述突变选自：

1)在位置55、62、155、190或290用I、Y、L、H或M取代S；

2)在位置54、58、189、219或397用I、Y、L、H或M取代T；

3)在位置151用A或H取代G；

4)在位置147或298用I、L、H或M取代A；

5)在位置164、187、192、207、220、296、300或495用I、Y、H取代V；和

6)在位置106用W取代R。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F突变体，其包含一个或多个空腔填充突变，其中所述突变体包含在WO 2017/109629表2、4和6中提供的任何突变体中的空腔填充突变。在那些表2、4和6中提供的RSV F突变体基于RSVA2株的相同天然F0序列，其具有在位置102、379和447(SEQ ID NO：3)的三个天然取代。能够对任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列进行各突变体中相同的引入的突变从而获得不同的RSV F突变体，比如SEQ ID NOs：1、2、4、6和81-270任意中描述的天然F0多肽序列。基于任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列并且包含任意一个或多个空腔填充突变的RSV F突变体也属于本发明范围内。在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含至少一个空腔填充突变，所述突变选自：T54H，S190I和V296I。

在其它实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包括一个或多个静电突变。术语"静电突变"是指向野生型RSV F蛋白质引入的氨基酸突变，其使在折叠结构中相互邻近的蛋白质残基之间的离子互斥降低或使离子吸引增加。由于成氢键作用是离子吸引的特别情况，静电突变可以增加所述邻近残基之间的成氢键作用。在一种实例中，可以引入静电突变来改善三聚体稳定性。在某些实施方式中，引入静电突变来使在RSV F糖蛋白的融合前构象中紧密邻近但是在其融合后构象中并不如此的残基之间的互斥性离子相互作用降低或使其吸引性离子相互作用(潜在包括氢键)增加。例如，在融合前构象中，RSV F糖蛋白三聚体中的一种原聚体的Asp486酸性侧链位于三聚体界面并且结构上夹在另一原聚体的两个其它酸性侧链Glu487和Asp489中间。另一方面，在融合后构象中，Asp486酸性侧链位于三聚体表面并且暴露于溶剂。在数种实施方式中，RSV F蛋白质突变体包括静电D486S取代，其使得与RSV F三聚体的另一原聚体的Glu487和Asp489酸性残基的互斥性离子相互作用降低或增加其吸引性离子相互作用。因此，在实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质包含静电D486S取代。一般地，引入静电突变将增加RSV F蛋白质的融合前构象或融合前三聚体构象的熔化温度(Tm)。

融合前或融合前三聚体构象中的不利静电相互作用能够通过本领域已知的方法鉴定，比如通过视觉检查融合前或融合前三聚体构象RSV F的晶体结构进行，或通过用蛋白质设计计算软件(比如BioLuminateTM[BioLuminate，Schrodinger LLC，New York，2015]，Discovery StudioTM[Discovery Studio Modeling Environment，Accelrys，San Diego，2015]，MOETM[Molecular Operating Environment，Chemical Computing Group Inc.，Montreal，2015.]和RosettaTM[Rosetta，University of Washington，Seattle，2015.])进行。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含至少一个静电突变，所述突变选自：

1)在位置82、92或487用D、F、Q、T、S、L或H取代E；

2)在位置315、394或399用F、M、R、S、L、I、Q或T取代K；

3)在位置392、486或489用H、S、N、T或P取代D；和

4)在位置106或339用F、Q、N或W取代R。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F突变体，其包含一个或多个静电突变，其中所述突变体包含在WO 2017/109629表3、5和6中提供的任意突变体中的静电突变。在那些表3、5和6中提供的RSV F突变体基于RSV A2株的相同天然F0序列，其在位置102、379和447(SEQ ID NO：3)具有三个天然取代。能够对任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列进行各突变体中相同的引入的突变从而获得不同的RSV F突变体，比如SEQ ID NOs：1、2、4、6和81-270任意中描述的天然F0多肽序列。基于任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列并且包含任意一个或多个静电突变的RSV F突变体也属于本发明范围内。在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是包含突变D486S的RSV F蛋白质突变体。

B-2(d)工程改造的二硫键突变、空腔填充突变和静电突变的组合。

在又一方面，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含两种或更多种不同类型突变的组合，所述突变选自工程改造的二硫键突变、空腔填充突变和静电突变，各自如上文描述。

在某些实施方式中，突变体包含至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变。在某些具体实施方式中，RSV F突变体包括WO 2017/109629表4记载的突变组合。

在某些其它实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个静电突变。在某些具体实施方式中，RSV F突变体包括WO 2017/109629表5记载的突变组合。

在其它实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSV F蛋白质突变体，其包含至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变。在某些具体实施方式中，RSV F突变体包括WO 2017/109629表6中提供的突变组合。

在某些具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是包含突变组合的RSV F突变体，所述突变组合选自：

(1)T103C，I148C，S190I和D486S的组合；

(2)T54H S55C L188C D486S的组合；

(3)T54H，T103C，I148C，S190I，V296I和D486S的组合；

(4)T54H，S55C，L142C，L188C，V296I和N371C的组合；

(5)S55C，L188C和D486S的组合；

(6)T54H，S55C，L188C和S190I的组合；

(7)S55C，L188C，S190I和D486S的组合；

(8)T54H，S55C，L188C，S190I和D486S的组合；

(9)S155C，S190I，S290C和D486S的组合；

(10)T54H，S55C，L142C，L188C，V296I，N371C，D486S，E487Q和D489S的组合；和

(11)T54H，S155C，S190I，S290C和V296I的组合。

在某些具体实施方式中，RSV F突变体包含引入的突变的组合，其中所述突变体包含WO 2017/109629表4、5和6中提供的任意突变体的突变组合。在那些表4、5和6中提供的RSV F突变体基于RSV A2株的相同天然F0序列，其在位置102、379和447(SEQ ID NO：3)具有三个天然取代。能够对任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列进行各突变体中相同的引入的突变从而获得不同的RSV F突变体，比如SEQ ID NOs：1、2、4、6和81-270任意中描述的天然F0多肽序列。基于任何其它RSV亚型或株的天然F0多肽序列并且包含任意突变组合的RSV F突变体也属于本发明范围内。

在某些其它具体实施方式中，根据本发明方法纯化的重组产生的RSV蛋白质是RSVF突变体，其包含在位置103(103C)和在位置148(148C)的半胱氨酸(C)，在位置190(190I)的异亮氨酸(I)，以及在位置486(486S)的丝氨酸(S)，并且其中所述突变体包含F1多肽和F2多肽，其选自：

(1)包含SEQ ID NO：41氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：42氨基酸序列的F1多肽；

(2)包含与SEQ ID NO：41氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：42氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(3)包含SEQ ID NO：43氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：44氨基酸序列的F1多肽；

(4)包含与SEQ ID NO：43氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：44氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(5)包含SEQ ID NO：45氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：46氨基酸序列的F1多肽；

(6)包含与SEQ ID NO：45氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：46氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(7)包含SEQ ID NO：47氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：48氨基酸序列的F1多肽；

(8)包含与SEQ ID NO：47氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：48氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(9)包含SEQ ID NO：49氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：50氨基酸序列的F1多肽；

(10)包含与SEQ ID NO：49氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：50氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽。

(11)包含SEQ ID NO：279氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：280氨基酸序列的F1多肽；

(12)包含与SEQ ID NO：279氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：280氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(13)包含SEQ ID NO：281氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：282氨基酸序列的F1多肽；

(14)包含与SEQ ID NO：281氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：282氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(15)包含SEQ ID NO：283氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：284氨基酸序列的F1多肽；

(16)包含与SEQ ID NO：283氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：284氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(17)包含SEQ ID NO：285氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：286氨基酸序列的F1多肽；

(18)包含与SEQ ID NO：285氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：286氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(19)包含SEQ ID NO：287氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：288氨基酸序列的F1多肽；

(20)包含与SEQ ID NO：287氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：288氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽；

(21)包含SEQ ID NO：289氨基酸序列的F2多肽和包含SEQ ID NO：290氨基酸序列的F1多肽；和

(22)包含与SEQ ID NO：289氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQ ID NO：290氨基酸序列至少97％、98％或99％相同的氨基酸序列的F1多肽。

在某些具体实施方式中，三聚体化域连接至F突变体蛋白质的F1多肽C-末端。在具体实施方式中，三聚体化域是T4 fibritin foldon域，比如氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO：40)。

发明详述

定义

下述定义将用于本说明书和权利要求中：

-术语"收获的细胞培养液"(或"收获的CCF")是指溶液，其含有至少一种致力于从也存在的其它物质纯化的靶标物质。收获的CCFs常常是复杂的混合物，含有许多生物学分子(比如蛋白质、抗体、激素和病毒)，小分子(比如盐、糖类、脂质等)和甚至颗粒物质。虽然生物学来源的典型收获的CCF可以是水溶液或悬浮液，其还可以含有在先前的分离步骤比如溶剂沉淀、萃取等中使用的有机溶剂。可以含有适于通过本发明的各种实施方式纯化的有价值生物学物质的收获的CCF的实例包括但不限于来自生物反应器的培养上清液，匀化的细胞悬浮液，血浆，血浆级分，和乳；

-术语"负载"是指含有靶标物的任何物质，其衍生自细胞培养物(收获的CCF)或色谱法步骤(从而部分纯化)并且加载至色谱法介质；

-术语"负载挑战"是指在色谱法步骤的加载循环中加载至色谱法介质的物质的总质量，按物质质量单位每单元体积介质来度量；

-术语"杂质"是指收获的CCF中不同于感兴趣蛋白质(或靶标蛋白质)并且希望从最终的治疗性蛋白质配制剂排除的物质。典型的杂质包括核酸，蛋白质(包括HCPs和低分子量种类，肽，内毒素，病毒和小分子；

-术语"药物物质"是指通过本发明方法可获得的作为活性药物成分的治疗性蛋白质；

-术语"药物产品"是指含有治疗性蛋白质和与之结合的赋形剂的成品剂型；

-术语"赋形剂"意指最终的治疗性蛋白质配制剂的组分，其并非治疗性蛋白质。赋形剂一般包括蛋白质稳定剂，表面活性剂，例如有助于蛋白质稳定化的氨基酸，等…；

-除非另有说明，与数值关联的术语"约"意指属于所述值±5％的范围。

"降低HCPs"或"增强HCPs的移除"意指在洗脱池中与治疗性蛋白质相比所存在的HCP种类的浓度被降低。HCPs的一般降低能够通过本领域已知的方法测量，比如HCP ELISA(通常用作主要工具)和LC-MS/MS。

实施例

通过下述实施例进一步说明本发明，其相应于对重组产生的RSV蛋白质应用的纯化方法并且用各种AEX色谱法洗涤策略来评价。实施例仅出于示例性意图提供并且不应被解释为限制本发明的范围。

在示例性实施例中，RSV蛋白质是RSV A蛋白质或RSV B蛋白质。

在该实施例中，从生物反应器收集负载溶液中存在的RSV蛋白质，通过依次包括下述的多步纯化方法纯化：

-初始离心和深度过滤步骤；

-第一超滤/透析过滤步骤；

-阴离子交换(AEX)色谱法步骤，其在包含下述介质的色谱法柱中进行：Fractogel

-含碳酸盐的羟基磷灰石(cHA)色谱法步骤，比如CHT

-疏水相互作用色谱法(HIC)步骤，其在包含介质比如可获自GE Healthcare的Butyl Sepharose 4Fast Flow

-病毒过滤步骤，其使用可获自Millipore Sigma的ViresolvePro

-第二超滤/透析过滤步骤；和

-最终的配制和过滤步骤。

阴离子交换色谱法-洗涤缓冲液评价

将包括靶标蛋白质(RSV A或RSV B)和具有7.5±0.2的pH的负载溶液加载入Fractogel

感兴趣的蛋白质呈三聚体形式(表1中的"三聚体")。表1中所述的"对照pH 7.5洗涤"是pH 7.5的Tris，NaCl洗涤溶液。

表1：

从该实验能够观察到的是，与更常规的pH为7.5的洗涤溶液相比，低pH洗涤条件能够增强HCP的降低(～1个log)并且具有低产品损失。所述低pH洗涤条件还增加三聚体纯度(86和89％vs.72％)。

该实验表明的是，在低pH洗涤条件(在该实施例中pH为4.8)下，在低pH洗涤期间的产品损失随负载挑战(表1中的"树脂挑战")增加而增加。

在各种pH、乙酸盐浓度和负载挑战对乙酸盐洗涤溶液进行的进一步实验表明：低洗涤pH与更佳的HCP移除相关联。更低的质量挑战与更佳的HCP移除和更佳的收率相关联。更高的乙酸盐浓度与更低的收率相关联。

结果指出的是，在测试的因素当中，pH条件是HCP降低的最显著因素而缓冲剂浓度是产品回收的最显著因素。

除了上文描述的实验中所用的乙酸盐以外，该方法可以使用备择的阴离子溶液：柠檬酸盐，磷酸盐，硫酸盐，氯化物阴离子溶液。

已进行进一步实验来评价具有不同阴离子浓度的各种缓冲剂种类的影响并且表征对于HCP移除的最佳条件。

下表2显示进行评价的洗涤条件(盐、浓度、pH)。

表2：

图1和图2将各洗涤溶液获得的收率值(产品回收百分比)对pH值作图，分别对应RSV A和RSV B负载溶液。

从对于RSV A的图1观察到：

(i)增加的缓冲剂浓度导致更低的收率，原因是在低pH洗涤期间的产品损失；

(ii)乙酸盐和柠檬酸盐显示收率与洗涤pH相关联；

(iii)磷酸盐和硫酸盐显示在pH 3.5更高的收率并且对pH更不敏感。

对于RSV B的图2展示的数据表明：

(i)对乙酸盐观察到与RSV A相似的趋势，也即更低的pH和增加的浓度导致更低的收率；

(ii)收率对高缓冲剂浓度并不如RSV A那样敏感；

(iii)与RSV A相比，对RSV B观察到更低的收率。

在进一步的实验中，对RSV A和RSV B两者在HCP降低和收率方面评价多种洗涤条件(缓冲剂类型、浓度、pH)，并且与优选的洗涤溶液：70mM乙酸盐，pH 5.0对比。

已在下表3中整理所产生的数据。

表3：

在表3中，用高通量筛选(HTS)方法对优选的洗涤溶液(70mM乙酸盐，pH 5.0)获得的数据-如倒数第二栏所示-已基于历史数据进行标准化并且显示：

-对于RSV A：70％的收率和0.9至1.1的HCP的log降低值(LRV)；和

-对于RSV B：65％的收率和0.9至1.4的LRV。

所进行的洗涤筛选表明的是，增加的缓冲剂浓度引起在洗涤期间的收率损失并且降低的洗涤pH引起更佳的HCP移除。RSV A和RSV B显示收率和HCP的相似趋势，其中RSV B显示更低的收率。

不同的缓冲剂显示在HCP移除与收率之间的范围有效性，尤其是磷酸盐和硫酸盐，基于表3中的标准化数据它们是作为乙酸盐备择对象的稳健选项。

最后，在负载溶液具有7.0至8.5和更特别约7.5的pH并且负载挑战包含7.5至15.0mg每ml阴离子交换色谱法介质的情况下，对RSV A和RSV B均可行的对AEX色谱法柱的优选低pH洗涤条件是：70mM乙酸盐和pH 5.0。

基于前述实验，用于低pH洗涤溶液的pH的可接受范围可以是3.0至6.5，更优选4.0至6.0，和最优选4.5至5.5。

在这些操作条件下，磷酸盐和硫酸盐是作为乙酸盐备择对象的稳健选项。

在真实的方法中，在将包括靶标蛋白质(RSV A或RSV B)的负载溶液载入AEX柱之前，用平衡溶液：20mM Tris，50mM NaCl pH 7.5使柱平衡。

在加载之后，用三种洗涤溶液依次洗涤柱，第二种是低pH洗涤溶液，第一和第三种是高pH洗涤溶液：

-洗涤#1：20mM Tris，50mM NaCl，pH 7.5；

-洗涤#2：70mM乙酸盐，pH 5.0；

-洗涤#3：50mM Tris，20mM NaCl，pH 7.5。

前述的pH值和组成对于洗涤溶液是优选的那些，然而在HCP降低和收率方面可接受的效能也可以在下述条件下获得：

-第一高pH洗涤溶液(洗涤#1)可以具有7.0至8.0的pH。Tris浓度可以是18至22mM和NaCl浓度可以是45至55mM；

-在低pH洗涤溶液(洗涤#2)中的乙酸盐的浓度可以是56至84mM，更优选63至77mM。pH的可接受范围如上文所讨论是3.0-6.5，优选4.0-6.0，和更优选4.5-5.5；

-第二高pH洗涤溶液(洗涤#3)可以具有7.0至8.0的pH。Tris浓度可以是45至55mM和NaCl浓度可以是18至22mM。

在通过依次用三种洗涤溶液洗涤柱所进行的洗涤步骤之后，用洗脱溶液洗脱RSV蛋白质。洗脱溶液包含浓度为146至180mM、优选约163mM的NaCl，和浓度为18至22mM、优选约20mM的Tris。洗脱溶液的pH是7.0至8.0，和优选约7.5。

实施例的后续色谱法步骤优选按下述条件操作。

cHA色谱法

在将产品载入cHA色谱法柱之前，用第一平衡缓冲剂0.5M磷酸钠，pH 7.2、然后用第二平衡缓冲剂20mM Tris、100mM NaCl、13mM磷酸钠，pH 7.0使柱平衡。

在过滤之后，将从AEX色谱法柱收集和用磷酸盐添加调节的产品池载入cHA色谱法柱。将负载的pH设为7.1±0.3的值并且负载挑战包含8.0至12.0mg每ml介质。

用洗涤溶液洗涤柱，所述溶液包含：20mM Tris、100mM NaCl、13mM磷酸钠，pH 7.0。

以流过模式操作柱，这意味着随着负载流体载入柱中，靶标蛋白质流过柱而杂质结合至介质。洗涤期望从柱洗出无意结合的靶标蛋白质。

HIC

在将产品载入HIC柱之前，用包含20mM磷酸钾的pH 7.0的第一平衡缓冲剂、然后用包含1.1M磷酸钾的pH 7.0的第二平衡缓冲剂使柱平衡。

在过滤之后，将从cHA色谱法柱收集并用磷酸钾添加调节的产品池载入HIC柱中。将负载的pH和电导率分别调节为7.0±0.3和104±10mS/cm。负载挑战包含8.0至12.0mg每ml介质。

以结合和洗脱模式操作柱，由此载入柱中的靶标蛋白质结合至介质然后通过施用洗脱缓冲液被洗脱。在施用洗脱缓冲液之前，用洗涤溶液洗涤柱以便洗出结合至介质的杂质。

该HIC步骤中所用的洗涤溶液是1.1M磷酸钾，pH 7.0而洗脱缓冲液是448mM磷酸钾，pH 7.0。

上文描述的方法适于以足够的纯度纯化重组产生的RSV蛋白质，从而所述蛋白质可以用于制备药物产品。尤其是，所述纯化的RSV蛋白质可以通过加入适宜的赋形剂配制，用作可注射的药物产品。