植酸酶变体和编码其的多核苷酸
文献发布时间：2024-04-18 19:52:40
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过援引并入本文。
原子坐标的引用
本申请将植酸酶变体(var400)的三维结构的原子坐标列于图5中。
技术领域
本发明涉及植酸酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。
背景技术
植酸酶是熟知的酶，将它们添加到动物(包括人类)的食物中的优点也是熟知的。已经从各种来源中分离了植酸酶，包括许多真菌和细菌菌株。
本发明的目的是提供具有植酸酶活性的替代性多肽(植酸酶)和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的植酸酶变体表现出与亲本植酸酶相比改进的或改变的，优选地改善的特性。此类特性的非限制性实例是：稳定性(诸如酸稳定性、加热稳定性、蒸汽稳定性、丸粒化稳定性、和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)、温度曲线、pH曲线、比活性、底物特异性、动物饲料性能(诸如植酸盐的释放和/或降解改善)、糖化易感性、和/或糖基化模式。
如本文所述，采用编码植酸酶的亲本多核苷酸的诱变来制备编码植酸酶的变体(合成)DNA，该植酸酶相对于由亲本多核苷酸编码的植酸酶具有改善的特性。
柠檬酸杆菌
来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)菌株的phyA基因序列已由Zinin等人提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库，登录号为AY390262。对应的植酸酶氨基酸序列见于UniProt/TrEMBL数据库，登录号为Q676V7。Q676V7的预期成熟部分作为SEQ ID NO：4包括在本序列表中。
WO-2004/085638(韩国国立水产研究所(Republic of National FisheriesResearch and Development Institute of Korea))将来自布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)YH-15(保藏为KCCM 10427)的植酸酶的氨基酸序列披露为SEQ ID NO：7。此氨基酸序列的成熟部分作为SEQ ID NO：3包括在本文中。此序列也见于数据库Geneseqp，登录号为ADU50737。
WO 2006/037328(诺维信公司(Novozymes A/S))披露了布氏柠檬酸杆菌ATCC51113的野生型植酸酶(即，本文中的SEQ ID NO：2)及其变体，该变体也包括在本序列表中，即作为SEQ ID NO：6。
WO 2006/038062和WO 2006/038128(丹尼斯克股份有限公司(Danisco A/S))均披露了弗氏柠檬酸杆菌P3-42的植酸酶基因的氨基酸序列及其多种变体，该弗氏柠檬酸杆菌以登录号NCIMB 41247保藏。此氨基酸序列作为SEQ ID NO：9包括在本文中。根据本文使用的编号，这些申请仅披露了位置233中对半胱氨酸(S233C)的一个取代，这将是S211C。WO2006/038062和WO 2006/038128的文本似乎是相同的。
WO 2007/112739(诺维信公司)披露了大量植酸酶变体，例如使用布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113植酸酶作为亲本。WO 2007/112739特别指示了二硫键的产生。
WO2011/117396(诺维信公司)通过在分子中引入两个或更多个二硫键披露了另外的植酸酶变体，例如使用布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113作为变体。
发明内容
在一方面，本发明涉及植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％同一性并且与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C，以便在位置52与99、31与177、和141与199之间形成二硫键，并且在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ IDNO：2用于编号。
本发明涉及植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同一性，但小于100％同一性，并且与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C+N203L，并且在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号，并且具有植酸酶活性。
另一方面涉及一种具有植酸酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b)与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c)与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d)与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e)与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽。
典型地，所述多肽是pH稳定且热稳定的，使得它具有以下特性中的一种或多种：
i.在pH 4下至少75℃的去折叠温度；
ii.在pH 3下至少70℃的去折叠温度；和
iii.在pH 2下至少55℃的去折叠温度。
可替代地定义，所述多肽是酸稳定的，使得它在pH 2、3、4、5、6、7和8中的每一个下24小时之后维持高于90％的残余活性水平。
本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
因此，本发明涉及一种制备具有植酸酶活性的重组多肽的方法，该方法包括以下步骤：
(a)培养包含选自由以下组成的组的外源多核苷酸的重组宿主细胞：
a.与SEQ ID NO：13具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
b.与SEQ ID NO：15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
c.与SEQ ID NO：17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
d.与SEQ ID NO：19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
e.与SEQ ID NO：21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
本发明进一步涉及一种产生本发明的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养包含外源多核苷酸的重组宿主细胞，该外源多核苷酸编码具有植酸酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e.与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
本发明进一步涉及包含本发明的变体的组合物，具体地动物饲料组合物，以及此类组合物用于以下的用途：改善动物饲料的营养价值；降低动物粪肥中的植酸盐水平；处理植物性蛋白质；从植酸盐底物中释放磷；或增加体重增益，改善动物的比生长速率和/或改善饲料转化率；或改善动物的营养存留率和/或营养消化率。
序列表的简要说明
在序列列表中，序列应用如下：
SEQ ID NO：1表示来自布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113(WO 2006/037328)的植酸酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2表示来自布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113(WO 2006/037328)的植酸酶的多肽序列。
SEQ ID NO：3表示来自布氏柠檬酸杆菌YH-15(WO-2004/085638)的植酸酶的多肽序列。
SEQ ID NO：4表示来自弗氏柠檬酸杆菌(UniProt/TrEMBL登录号Q676V7)的植酸酶的多肽序列。
SEQ ID NO：5表示SEQ ID NO：2的变体(18是Xaa并且323是Xaa)。
SEQ ID NO：6表示SEQ ID NO：2的变体(18是Gly并且323是Pro)。
SEQ ID NO：7表示布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113信号肽。
SEQ ID NO：8表示布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113前肽。
SEQ ID NO：9表示来自弗氏柠檬酸杆菌NCIMB 41247(WO 2006/038062和WO 2006/038128)的植酸酶的多肽序列。
SEQ ID NO：10表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var300)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：11表示编码SEQ ID NO：10的多核苷酸序列，编码序列(CDS)为从核苷酸11至核苷酸1351。
SEQ ID NO：12表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var400)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：13表示编码SEQ ID NO：12的多核苷酸序列，CDS为从核苷酸11至核苷酸1351。
SEQ ID NO：14表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var404)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：15表示编码SEQ ID NO：14的多核苷酸序列，CDS为从核苷酸11至核苷酸1351。
SEQ ID NO：16表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var405)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：17表示编码SEQ ID NO：16的多核苷酸序列，CDS为从核苷酸11至核苷酸1351。
SEQ ID NO：18表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var406)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：19表示编码SEQ ID NO：18的多核苷酸序列，CDS为从核苷酸11至核苷酸1351。
SEQ ID NO：20表示SEQ ID NO：2的变体(名称为var411)的成熟多肽序列。
SEQ ID NO：21表示编码SEQ ID NO：20的多核苷酸序列，CDS为从核苷酸1至核苷酸1341。
SEQ ID NO：22表示蛋白酶的多肽序列。
附图说明
图1示出了SEQ ID NO：2的植酸酶和SEQ ID NO：9的植酸酶的比对的实例。
图2示出了实验试验期间饲料消耗比(FR)和体重(BW)演变。
图3示出了骨P存留采样的方案。
图4示出了饲喂91天之后来自不同实验处理的鱼血浆中的磷。数据以平均值±SD(标准偏差)呈现。显著处理(p＜0.05)通过不同的字母示出。
图5列出了植酸酶变体(var400)的三维结构的原子坐标。这些原子坐标可以协助生成描绘植酸酶变体(var400)的结构的三维模型以及同源结构(诸如上述植酸酶变体的变体)的三维模型。
具体实施方式
本文描述了一种具有改善特性的植酸酶，包括改善的固有温度和pH稳定性和改善的体内功效/酶单位(FYT)。如本领域技术人员已知，这些类型的改善不仅允许产物配制的灵活性和由此灵活性而产生的成本节约，它还提供了改善植酸盐和抗营养因子的去除，改善磷、钙和肌醇的释放和增加磷的消化率，通过肌醇释放改善肌肉蛋白增生和最小化P排泄以改善可持续性。
在一方面，本发明涉及植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％同一性并且与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C，以便在位置52与99、31与177、和141与199之间形成二硫键。
本发明涉及植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性，并且与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C，并且在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号，其中这些变体具有植酸酶活性。
变体
在一方面，本发明涉及植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％同一性并且与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C+G52C+A99C+K141C+T177C+V199C，以便在位置52与99、31与177、和141与199之间形成二硫键。
本发明提供植酸酶变体，这些植酸酶变体与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L，并且在选自以下的一个或多个位置中进一步包含改变：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号，其中这些变体具有植酸酶活性。
在一个实施例中，该改变是取代。
在一个实施例中，该变体与亲本植酸酶的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在一方面，本发明的变体与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L和另外的改变，其中本发明的变体中另外的改变的数量是1-30个，例如1-20、1-10和1-5个，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在另一方面，本发明的变体与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L和在对应于57、73、121、134、155、207和273的位置中另外的一个或多个取代，使用SEQ ID NO：2进行编号。在一个优选实施例中，这些变体与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L和另外的两个或更多个取代，例如2、3、4、5、6或7个取代；在对应于57、73、121、134、155、207和273的位置中，使用SEQ ID NO：2进行编号。
在另一方面，该变体在对应于位置57的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置57的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Tyr取代。在另一方面，该变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代E57Y或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置73的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置73的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，该变体包含SEQ IDNO：2的成熟多肽的取代N73P或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置121的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置121的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Pro取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的取代N121P或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置134的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置134的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Gln取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的取代S134Q或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置155的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置155的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Val，优选地被Phe取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的取代Y1 55F或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置207的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置207的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的取代P207T或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置273的位置处包含取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置273的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选地被Leu取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的取代M273L或由其组成。
在另一方面，该变体在对应于位置57和73的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57和121的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73和121的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置155和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置155和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置207和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73和121的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、155和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、155和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、207和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、155和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134、155和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134、155和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置155、207和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、和134的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、和155的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置121、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、155、和207的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、155、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、121、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置73、121、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置57、73、121、134、155、207、和273的位置处包含改变或由其组成，诸如以上所述的那些。
在另一方面，该变体包含选自由以下组成的组的一个或多个(例如，若干)取代或由其组成：30Q、36A、43C、46C、57Y、60H、64Q、73P、79Q、119P、121P、123C、130T,C、134Q、138A、151S、155F、161T、162A、176P、180N、184Q、190T、207T、224Q、230E、243N、273L、286S、336R、340L,P、358Q和375K。
在另一方面，该变体包含选自由以下组成的组的一个或多个(例如，若干)取代或由其组成：K30Q、Q36A、P43C、W46C、E57Y、Q60H、L64Q、N73P、S79Q、E119P、N121P、P123C、M130T,C、S134Q、L138A、N151S、Y155F、S161T、S162A、N168R、E176P、T180N、S184Q、P190T、P207T、E224Q、Q230E、R243N、M273L、N286S、K336R、T340L,P、D358Q和D375K。
在另一个方面，该变体包含取代或由其组成。
在一个优选实施例中，该变体与以下相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L：SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有植酸酶活性的多肽，并且进一步该变体在以下位置中包含取代：57、73、121、134、155、207和273，优选地57Y、73P、121P、134Q、155Y、207T和273L；并且在以下一个或多个位置中进一步包含一个或多个取代：30、36、43、46、60、64、79、119、123、130、138、151、161、162、168、176、180、184、190、224、230、243、286、336、340、358和375。
如果该变体与SEQ ID NO：2相比包含取代P43C，则优选它还包含取代W46C。如果该变体与SEQ ID NO：2相比包含取代W46C，则优选它还包含取代P43C。如果该变体与SEQ IDNO：2相比包含取代P123C，则优选它还包含取代M130C。如果该变体与SEQ ID NO：2相比包含取代M1 30C，则优选它还包含取代P123C。
氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(诸如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins[蛋白质]，Academic Press[学术出版社]，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有使多肽的物理化学特性改变的这种性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244：1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的植酸酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271：4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由诸如以下技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255：306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309：59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体在储存条件下具有改善的稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改善的热稳定性。
根据本发明的变体的实例包括与SEQ ID NO：2相比具有以下取代的变体：
N31C/G52C/E57Y/N73P/A99C/N121P/S134Q/K141C/Y155F/T177C/V199C/N203L/P207T/M273L；
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L；
N31C/Q36A/P43C/W46C/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L；
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/P123C/M130C/S134Q/L138A/K141C/N151S/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L；以及
N31C/Q36A/P43C+W46C+G52C+E57Y+Q60H+L64Q+N73P+A99C+E119S+N121P+P123C+M130C+S134Q+L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L。
植酸酶多肽，同一性百分比
在本发明上下文中，植酸酶是一种具有植酸酶活性的多肽，即催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为以下的酶：(1)肌醇和/或(2)它的单-，二-，三-，四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐。
在本发明上下文中，术语植酸盐底物涵盖，即植酸和任何植酸盐(植酸的盐)，以及以上(2)中列出的磷酸盐。
在互联网(
根据ENZYME网站，已知三种不同类型的植酸酶：一种所谓的3-植酸酶(别名1-植酸酶；肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)、一种所谓的4-植酸酶(别名6-植酸酶；基于1L编号系统并不是1D编号系统命名，EC 3.1.3.26)，和一种所谓的5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。出于本发明的目的，所有三种类型都包括在植酸酶的定义中。
在一个特别实施例中，本发明的植酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，其包括大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌植酸酶，诸如泡盛曲霉(Aspergillusawamorii)植酸酶A和B(EC：3.1.3.8)(基因phyA和phyB)。组氨酸磷酸酶共享两个序列相似的区域，每个区域都以保守的组氨酸残基为中心。这两种组氨酸似乎参与酶的催化机制。第一种组氨酸位于N末端部分并形成磷-组氨酸中间体，而第二种组氨酸位于C末端部分并且可能充当质子供体。
在另一个特别实施例中，本发明的植酸酶具有保守活性位点基序，即R-H-G-X-R-X-P，其中X代表任何氨基酸(参见SEQ ID NO：2、3、4、6的氨基酸16至22和SEQ ID NO：9的氨基酸38-44)。在一个优选实施例中，保守活性位点基序是R-H-G-V-R-A-P，即氨基酸16-22(SEQ ID NO：2)是RHGVRAP。
出于本发明的目的，植酸酶活性以FYT单位确定，一个FYT是酶在以下条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸盐的量：pH 5.5；温度37℃；底物：植酸钠(C
在一个特别实施例中，本发明的植酸酶是分离的。如本文所用，术语“分离的”是指多肽是至少20％纯的，优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的，并且甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所确定。具体地，优选多肽呈“基本上纯的形式”，即该多肽制剂基本上不含与其天然缔合的其他多肽材料。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。
两个氨基酸序列之间的关联度通过参数“同一性”来描述。出于本发明的目的，两个氨基酸序列的比对使用来自EMBOSS包(http：//emboss.org)2.8.0版的Needle程序来确定。Needle程序实现了Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48，443-453中描述的全局比对算法。所使用的替换矩阵是BLOSUM62，空位开放罚分是10并且空位延伸罚分是0.5。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与权利要求中提及的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)之间的同一性程度计算为两个序列比对中的完全匹配数量除以“发明序列”的长度或SEQID NO：2的长度，以最短者为准。结果表示为同一性百分比。
当“发明序列”和SEQ ID NO：2在重叠的相同位置中具有相同的氨基酸残基时，就会发生完全匹配(在以下比对实例中，这由“|”表示)。序列的长度是该序列中氨基酸残基的数量(例如，SEQ ID NO：2的氨基酸1-411的长度是411)。
WO2011/117396中的实例11是SEQ ID NO：2的植酸酶和SEQ ID NO：9的植酸酶的比对实例，并且该实例说明了如何计算这两个主链之间的同一性百分比。
在以下另一个纯假设的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，空位由“-”指示。
假设比对实例：
在一个特别实施例中，多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的同一性百分比通过以下确定：i)使用Needle程序将两个氨基酸序列对齐，使用BLOSUM62替换矩阵，空位开放罚分是10并且空位延伸罚分是0.5；ii)对比对中完全匹配的数量进行计数；iii)将完全匹配的数量除以两个氨基酸序列中最短的长度，以及iv)将iii)的除法结果转换为百分比。
在以上假设实例中，完全匹配的数量是6，两个氨基酸序列中最短的长度是12；因此同一性百分比是50％。
在本发明的植酸酶的特别实施例中，与SEQ ID NO：2的同一性程度是至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％。在又另外的特别实施例中，同一性程度是至少98.0％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或至少99.9％。在替代性实施例中，同一性程度是至少70％、71％、72％、或至少73％。
在又另外的特别实施例中，本发明的植酸酶与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或不多于10个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于11、12、13、14、15、16、17、18、19、或不多于20个修饰；与SEQ IDNO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于21、22、23、24、25、26、27、28、29、或不多于30个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于31、32、33、34、35、36、37、38、39、或不多于40个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于41、42、43、44、45、46、47、48、49、或不多于50个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于51、52、53、54、55、56、57、58、59、或不多于60个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于61、62、63、64、65、66、67、68、69、或不多于70个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于71、72、73、74、75、76、77、78、79、或不多于80个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于81、82、83、84、85、86、87、88、89、或不多于90个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于91、92、93、94、95、96、97、98、99、或不多于100个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于101、102、103、104、105、106、107、108、109、或不多于110个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于111、112、113、114、115、116、117、118、119、或不多于120个修饰；与SEQ ID NO：2或任何其他亲本植酸酶相比具有不多于121、122、123、或124个修饰。
本发明的一方面涉及一种具有植酸酶活性的分离的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b)与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c)与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；和
d)与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、99％同一性或100％同一性的多肽：以及
e)与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽。
优选地，该多肽从布氏柠檬酸杆菌获得或可从布氏柠檬酸杆菌获得。
一个有趣的方面涉及一种具有植酸酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b)与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c)与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d)与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e)与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
其中该多肽是pH稳定且热稳定的，使得它具有以下特性中的一种或多种：
i.在pH 4下至少75℃的去折叠温度；
ii.在pH 3下至少70℃的去折叠温度；和
iii.在pH 2下至少55℃的去折叠温度。
另一个有趣的方面涉及一种具有植酸酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b)与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的多肽；
c)与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多肽；
d)与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e)与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
其中所述多肽是酸稳定的，使得它在pH 2、3、4、5、6、7和8中的每一个下24小时之后维持高于90％的残余活性水平。
典型地，该多肽与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C。优选地，该多肽与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L。更典型地，本发明的多肽在选自以下的一个或多个位置中包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号。
位置编号
本文用于定义氨基酸位置的命名法是基于衍生自布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113的植酸酶的氨基酸序列，其成熟序列在序列表中作为SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：2的氨基酸1-411)给出。因此，在本发明上下文中，编号位置的基础是SEQ ID NO：2，从E1开始并以E411结束。
当在本文中使用时，术语“成熟”部分(或序列)是指由细胞分泌的多肽部分，该细胞作为其遗传设备的一部分含有编码该多肽的多核苷酸。换言之，成熟多肽部分是指在信号肽部分以及前肽部分(如果有的话)被切割掉之后保留的多肽部分。信号肽部分可以通过本领域已知的程序(例如，SignalP)来预测。SEQ ID NO：2的预期信号肽部分作为SEQ IDNO：8包括在本序列表中，其由SEQ ID NO：7编码。SEQ ID NO：2是预期成熟部分。通常，酶的成熟部分的第一个氨基酸可以通过纯化酶的N末端测序来确定。然后信号肽部分与成熟部分之间的任何差异必定是由于前肽的存在。
修饰，诸如取代、缺失、插入
植酸酶变体相对于模板(即，参考或比较氨基酸序列，诸如SEQ ID NO：2)可以包含各种类型的修饰：一个氨基酸可以被另一个氨基酸取代；可以缺失一个氨基酸；可以插入一个氨基酸；以及任何数量的此类修饰的任何组合。在本发明上下文中，术语“插入”还旨在涵盖N末端和/或C末端延伸。
本文所用的单个修饰的一般命名法如下：XDcY，其中“X”和“Y”独立地表示一个字母的氨基酸代码，或者“*”(氨基酸的缺失)，“D”表示一个数字，并且“c”表示字母计数器(a、b、c并且以此类推)，它只存在于插入中。参考下表，该表描述了将此命名法应用于各种类型的修饰的纯假设实例。
表
如上所解释，位置编号(“D”)从SEQ ID NO：2的第一个氨基酸残基开始计数。
同一序列中的若干修饰用“/”(斜杠)分开，例如名称“1*/2*/3*”意指位置编号1、2、
替代性修饰用“，”(逗号)分开，例如名称“119R,K”意指位置119中的氨基酸被R
在各种其他可能性枚举中本文所用的逗号意指它们通常在语法上所做的，即经常是和/或。例如，列表“53V,Q，121D，和/或167Q”中的第一个逗号代表替代项(V
在本发明上下文中，“至少一个”(例如，修饰)是指一个或多个修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个修饰；或12、14、15、16、18、20、22、24、25、28、或30个修饰；等等，最多达125、130、140、150、160、170、180、190、或200个修饰。然而，本发明的植酸酶变体仍然必须与SEQ ID NO：2具有至少74％同一性，此百分比如上所述确定。
进行取代或延伸而没有任何指示用什么取代或延伸是指插入任何天然或非天然氨基酸，但在模板中占据此位置的氨基酸除外。
鉴定对应的位置编号
如上所解释，布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113(SEQ ID NO：2)的成熟植酸酶用作位置编号的标准，并且因此也用于命名法。
对于另一种植酸酶，具体地本发明的植酸酶变体，通过如上在标题为“植酸酶多肽，同一性百分比”部分中指定比对两个序列，找到对应于SEQ ID NO：2中位置D的位置。从比对中可以清晰且明确地鉴定本发明序列中对应于SEQ ID NO：2的位置D的位置(比对中彼此重叠的两个位置)。
本发明的图1是SEQ ID NO：2的植酸酶和SEQ ID NO：9的植酸酶的比对实例，并且该实例说明了如何鉴定这两个主链中的对应位置。
以下包括一些额外的纯假设实例，这些实例来源于上表，该表第三栏包括两个序列的许多比对。
考虑上表第一行中的第三个单元格：上部序列是模板，下部序列是变体。位置编号80是指模板中的氨基酸残基G。氨基酸A占据变体中的对应位置。因此，此取代被指定为G80A。
现在考虑上表第二行中的第三个单元格：上部序列也是模板，并且下部序列是变体。位置编号80也是指模板中的氨基酸残基G。该变体在模板中的G80之后和V81之前具有两个插入，即TY。虽然T和Y在变体氨基酸序列中当然具有自己的“真实”位置编号，但出于本发明的目的，我们总是参考模板位置编号，并且因此声称T和Y分别在位置编号80a和80b中。
最后，考虑上表最后一行中的第三个单元格：位置编号275是指模板的最后一个氨基酸。声称ST的C末端延伸分别在位置编号275a和275b中，但是它们在变体氨基酸序列中当然也具有自己的“真实”位置编号。
改变的特性，参考植酸酶
在一个特别实施例中，本发明的用于产生植酸酶变体的方法提供了具有改变的、优选改善的特性的变体。
术语“改变的”和“改善的”意味着与另一种植酸酶进行比较。此类其他参考或比较植酸酶的实例是：SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：6。参考植酸酶的又另外实例可以是SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：4。参考植酸酶的又另外实例可以是SEQ ID NO：9及其变体。
经改变、优选改善的特性的非限制性实例如下：热稳定性、pH曲线、比活性、动物饲料性能、丸粒化稳定性、蛋白酶敏感性、和/或糖基化模式。通过本发明的方法产生的植酸酶变体表现出改善的热稳定性，并且还可以具有改变的、优选改善的温度曲线，并且/或者它可以包含潜在蛋白酶切割位点的变化。
热性能
温度稳定性
温度稳定性可以如WO 2011/117396，实例3中所述，通过在60℃或更高的温度下温育30分钟期间确定活性并与在37℃下进行的参考实验进行比较来确定。
热稳定性
热稳定性可以如WO 2011/117396，实例4中所述，即，使用DSC测量确定经纯化的植酸酶蛋白的变性温度(Td)来确定。Td指示了该蛋白质的热稳定性：Td越高，热稳定性越高。因此，在一个优选实施例中，本发明的植酸酶具有一个Td，该Td高于参考植酸酶的Td，其中Td是对经纯化的植酸酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，通过SDS-PAGE确定)确定的。
加热稳定性
加热稳定性可以如WO 2011/117396，实例5中所述，通过确定变体植酸酶的温度/活性曲线来确定。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可以如WO 2011/117396，实例7中所述，通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后植酸酶分子的残余活性来确定。
丸粒化稳定性
丸粒化稳定性可以如WO 2001/117396，实例8中所述，通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。将此预混合物与饲料混合。从混合器中，将饲料用蒸汽调节至95℃。在调节之后，将饲料压制成粒料并确定残余活性。
在优选实施例中，本发明的植酸酶的热特性，诸如通过残余活性、Td或其他参数提供的加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或丸粒化稳定性高于对应的值(诸如SEQ ID NO：2的植酸酶的残余活性或Td)，更优选地是它的至少10 1％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或至少110％。甚至更优选地，本发明的植酸酶的参数(诸如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO：2的植酸酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在又另外的特别实施例中，本发明的热稳定的植酸酶具有至少50℃的熔化温度Tm(或变性温度Td)，如在实例(即在20mM乙酸钠，pH 4.0)中所述使用差示扫描量热法(DSC)所确定的。在又另外的特别实施例中，Tm是至少51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、62.5℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少100℃。DSC测量也可以如实例中所述进行。
温度曲线/温度稳定性
与参考植酸酶相比，本发明的植酸酶是否具有改变的温度曲线，可以如WO 2011/117396，实例5中所述来确定。因此，在一个特别实施例中，与参考植酸酶相比，本发明的植酸酶具有改变的温度曲线，其中温度曲线被确定为植酸酶活性，作为植酸钠在pH 5.5下在20℃-90℃的温度范围内(10℃梯级)的温度的函数。优选的缓冲液是0.25M乙酸钠缓冲液，pH 5.5。优选地，将在每个温度下的活性指示为归一化至在最佳温度下的值的相对活性(以％为单位)。最佳温度是在被测试温度(即，具有5℃-10℃跳跃的那些)内该活性最高的温度。
动物饲料性能
在一个特别实施例中，与参考植酸酶相比，本发明的植酸酶具有改善的动物饲料性能。动物饲料性能可以通过体外模型确定。因此，在一个优选实施例中，本发明的植酸酶具有改善的动物饲料性能，其中该性能通过以下在体外模型中确定：制备由30％大豆粉和70％玉米粉构成的饲料样品，添加CaCl
本发明的植酸酶和参考植酸酶以相同的量，优选基于植酸酶活性单位(FYT)给药。合适的剂量是100-5000FYT/kg饲料，诸如125至4000FTY/kg饲料，诸如125至3000FTY/kg。植酸酶可以呈纯化植酸酶的形式或呈发酵上清液的形式给药。纯化的植酸酶优选具有至少95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定。
在优选实施例中，相对于参考植酸酶的降解IP6-P值，本发明的纯化植酸酶的降解IP6-P值是至少101％、或至少102％、103％、104％、105％、110％、115％、或至少120％。在又另外的优选实施例中，相对于参考植酸酶的降解IP6-P值，本发明的纯化植酸酶的降解IP6-P值是至少125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或至少200％。优选地，相对于SEQ ID NO：2植酸酶的降解IP6-P值，本发明的植酸酶的降解IP6-P值是至少105％、110％、113％、115％、120％、125％、或至少130％。
本发明的植酸酶的相对性能也可以计算为由参考植酸酶释放的磷的百分比。
在又另外的特别实施例中，本发明的植酸酶的相对性能可以计算为本发明的植酸酶释放的磷相对于参考植酸酶释放的磷量的百分比。
在又另外的特别实施例中，本发明的植酸酶的相对性能是至少105％，优选至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或至少200％。
蒸汽稳定性
热稳定性是一个重要的参数，但与此相关联的蒸汽稳定性也很重要。在这方面，参考WO 2011/117396，实例8。
低过敏性变体
在一个特定实施例中，通过本发明的方法产生的植酸酶变体(也)是低过敏性变体，被设计来在暴露于动物(包括人类)时引发降低的免疫应答。术语免疫应答应理解为暴露于植酸酶变体的动物的免疫系统的任何反应。一种类型的免疫应答是导致暴露动物中IgE水平增加的过敏应答。低过敏性变体可以使用本领域已知的技术制备。例如，植酸酶变体可以与聚合物部分缀合，从而屏蔽参与免疫应答的植酸酶变体的部分或表位。与聚合物的缀合可以涉及聚合物与植酸酶变体的体外化学缀合，例如如WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026、和/或WO 99/00489中所述。缀合可以另外或可替代地涉及聚合物与植酸酶变体的体内缀合。这种缀合可以通过对编码植酸酶变体的核苷酸序列进行基因工程化，在植酸酶变体中插入编码另外的糖基化位点的共有序列，并在能够使植酸酶变体糖基化的宿主中表达植酸酶变体来实现，参见例如WO 00/26354。提供低过敏性变体的另一种方式是对编码植酸酶变体的核苷酸序列进行基因工程化，以便使植酸酶变体自我低聚，从而实现植酸酶变体单体可以屏蔽其他植酸酶变体单体的表位，并且从而降低低聚物的抗原性。此类产物及其制备描述于例如WO 96/16177中。参与免疫应答的表位可以通过各种方法鉴定，诸如WO 00/26230和WO 01/83559中所述的噬菌体展示方法，或EP 561907中所述的随机方法。一旦鉴定了一个表位，就可以通过已知的基因操纵技术改变其氨基酸序列以使植酸酶变体的免疫特性发生改变，这些基因操纵技术诸如定点诱变(参见例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO 00/22103)，并且/或者合物的缀合可以在足够接近表位的情况下进行，以使聚合物屏蔽表位。
每只鸡的每日BW增益(BW增益)和饲料转化率(FCR)
每只鸡的每日体重增益(BW增益)和饲料转化率(FCR)计算如下：
每只鸡的体重增益：每只鸡的BW在研究结束时和开始时之间的差异
每日BW增益：每只鸡的BW在研究结束时和开始时之间的差异，除以天数
FCR：一个圈栏的总饲料消耗除以此圈栏的总BW增益(总BW增益＝结束时总BW+去除和损失的重量-开始时的总BW)。
FI＝FCR*WG
核酸序列和构建体
本发明还涉及核酸序列，这些核酸序列包含编码本发明的植酸酶变体的核酸序列。
本发明的一方面涉及一种制备具有植酸酶活性的重组多肽的方法，该方法包括以下步骤：
(a)培养包含选自由以下组成的组的外源多核苷酸的重组宿主细胞：
a.与SEQ ID NO：13具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
b.与SEQ ID NO：15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
c.与SEQ ID NO：17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
d.与SEQ ID NO：19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的多核苷酸；
e.与SEQ ID NO：21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
另一方面涉及产生本发明的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养包含外源多核苷酸的重组宿主细胞，该外源多核苷酸编码具有植酸酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e.与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
典型地，在本发明的方法中，该具有植酸酶活性的多肽与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C。优选地，在本发明的方法中，该具有植酸酶活性的多肽与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L。更典型地，该多肽在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号。
术语“分离的核酸序列”是指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如，至少约20％纯的，优选至少约40％纯的，更优选至少约60％纯的，甚至更优选至少约80％纯的，并且最优选至少约90％纯的，如通过琼脂糖电泳确定。例如，分离的核酸序列可以例如通过基因工程化中使用的标准克隆程序获得，以将核酸序列从其天然位置重新定位到将要复制的不同位点。克隆程序可以涉及切除和分离包含编码该多肽的核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入载体分子中，并将该重组载体并入宿主细胞中，其中将会复制该核酸序列的多个拷贝或克隆。该核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其何组合。
本发明的核酸序列可以通过将至少一个突变引入模板植酸酶编码序列或其子序列中来制备，其中突变体核酸序列编码变体植酸酶。将突变引入核酸序列中以将一个核苷酸交换为另一个核苷酸可以通过本领域已知的任何方法实现，例如通过定点诱变，通过随机诱变或通过掺杂、加标或局部随机诱变。
随机诱变适合作为局部或区域特异性随机诱变在翻译成所示的讨论氨基酸序列的基因的至少三个部分中或在整个基因内进行。当通过使用寡核苷酸进行诱变时，可以在寡核苷酸合成期间在有待改变的位置处对寡核苷酸掺杂或加标三个非亲本核苷酸。可以进行掺杂或加标，以避免不想要的氨基酸的密码子。掺杂或加标的寡核苷酸可以通过任何技术并入编码植酸酶的DNA中，例如使用PCR、LCR或任何DNA聚合酶和连接酶(如认为适当)。
优选地，掺杂使用“恒定随机掺杂”进行，其中每个位置中的野生型和突变的百分比是预定义的。此外，掺杂可以指向对引入某些核苷酸的偏好，从而倾向于引入一种或多种特定氨基酸残基。可以进行掺杂，例如，允许在每个位置中引入90％的野生型和10％的突变。选择掺杂方案的另一个考虑因素是基于遗传和蛋白质结构的限制。
随机诱变可以有利地定位于所讨论的亲本植酸酶的一部分中。例如，当酶的某些区域已被鉴定为对酶的给定特性特别重要时，这可能是有利的。
用于提供本发明变体的替代性方法包括例如在WO 95/22625或WO 96/00343中所述的基因改组，以及EP 897985中所述的共有序列推导过程。
核酸构建体
核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的核酸序列，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。表达将被理解为包括多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
如本文使用，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或其经修饰以本来不存在于自然界中的方式含有核酸的区段。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。
术语“控制序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需或有利的所有成分。每个控制序列对于编码该多肽的核苷酸序列可以是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。控制序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，这些特异性限制位点促进控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
术语“可操作地连接”在本文中代表一种配置，其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列放置在适当位置处，使得控制序列指导多肽的编码序列的表达。
当在本文中使用时，术语“编码序列”(CDS)意指直接指明其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由可读框决定，该可读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(诸如GTG和TTG)开始。编码序列可以是DNA、cDNA、或重组核苷酸序列。
表达载体
术语“表达”包括多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”在本文定义为包含编码本发明多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供了其表达的额外核苷酸的线性或环状DNA分子。
编码本发明的植酸酶变体的核酸序列可以使用表达载体表达，该表达载体典型地包含编码启动子、操作子、核糖体结合位点、翻译起始信号、以及任选地阻遏基因或各种激活基因的控制序列。
携带编码本发明的植酸酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA程序的任何载体，并且载体的选择经常取决于有待引入其中的宿主细胞。该载体可以是这样一种载体，当它被引入宿主细胞中时，被整合到宿主细胞基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。
植酸酶变体也可以与至少一种其他动物饲料感兴趣的酶共表达，诸如植酸酶、磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、淀粉酶、和/或β-葡聚糖酶。这些酶可以从不同的载体、从一种载体、或使用两种技术的混合物共表达。当使用不同的载体时，这些载体可以具有不同的可选择标记和不同的复制起点。当仅使用一种载体时，基因可以从一种或多种启动子表达。如果在一种启动子(二顺反子或多顺反子)的调节下克隆，基因克隆的顺序可能影响蛋白质的表达水平。植酸酶变体也可以表达为融合蛋白，即编码植酸酶变体的基因已经在框内融合到编码另一种蛋白质的基因上。这种蛋白质可以是另一种酶或来自另一种酶的功能结构域。
宿主细胞
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸有利地用于重组产生多肽。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
有用的单细胞微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞(Bacillus cell)，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)。在一个优选方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选方面，芽孢杆菌细胞是嗜碱性芽孢杆菌。
可以通过以下方法实现将载体引入细菌宿主细胞中：例如原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics[分子与普通遗传学]168：111-115)，使用感受态细胞(参见例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology[分子生物学杂志]56：209-221)，电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6：742-751)或缀合(参见例如，Koehler和Thorne，1987，Journalof Bacteriology[细菌学杂志]169：5771-5278)。
宿主细胞还可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
在一个优选方面，宿主细胞是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人，于Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi[安-倍氏菌物辞典]，第8版，1995，CAB国际大学出版社，剑桥，英国(CAB International，University Press，Cambridge，UK)中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth等人，1995，同上，第171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。
在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于不完全菌(FungiImperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，出于本发明的目的，酵母应如在Biology and Activities of Yeast[酵母生物学与活性](Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学研讨会系列第9期]，1980)中所述进行定义。
在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)细分的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，同上所定义)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(诸如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉酵母属(Fil
在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢菌(Fusarium cerealis)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰刀菌(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、或虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、粉色面包霉菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉齿菌(Phlebia radiata)、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA[美国国家科学院院报]81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属(Fusarium)物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78：147-156、和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.(学术出版社有限公司)，纽约；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]153：163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国国家科学院院报]75：1920。
产生方法
本发明涉及用于产生植酸酶变体的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该植酸酶的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该植酸酶。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适于产生该多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料、或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规程序从营养培养基中回收，这些常规程序包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
本发明的多肽可以通过各种本领域已知的程序纯化，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
组合物和用途
在又另外的方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物及其使用方法。
可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以呈液体或干组合物的形式。可以根据本领域已知的方法将包含在组合物中的多肽稳定化。
针对液体配制品，配制剂可以包含多元醇(例如像，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(例如像，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或者糖或糖衍生物(例如像，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一个实施例中，组合物是液体组合物，其包含本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇。液体配制品可以喷洒在已经丸粒化(pelleted)的饲料上，或可以添加到供给动物的饮用水中。
针对固体配制品，配制品可以是例如作为颗粒、喷雾干燥粉末或凝集物。配制剂可以包含盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，例如像，诸如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或者糖或糖衍生物(例如像，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。
在一个实施例中，固体组合物呈颗粒或微粒形式。颗粒可以具有基质结构(matrixstructure)，其中组分是均匀混合的。然而，颗粒典型地包含核心粒子和一种或多种包衣，该包衣典型地是盐的和/或蜡质的包衣。蜡的实例是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂油诸如氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或二甘油酯，诸如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；以及脂肪酸，诸如氢化的线性长链脂肪酸及其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。核心粒子可以是任选地与一种或多种另外的酶组合的本发明的植酸酶并且任选地连同一种或多种盐的均匀共混物，或是惰性粒子(具有本发明的植酸酶，该植酸酶任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合)。
在一个实施例中，核心粒子的材料选自由以下组成的组：无机盐(诸如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或者糖或糖衍生物(例如像，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(例如像，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作含水层状硅酸铝)。在一个优选实施例中，该核心包括粘土矿物质，诸如高岭石或高岭土。
盐包衣典型地至少是1μm厚并且可以是一种特别的盐或多种盐的混合物，诸如Na
在另一个实施例中，组合物是固体组合物，其包含本发明的植酸酶和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选实施例中，配制剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。在一个优选实施例中，固体组合物呈颗粒形式。在一个实施例中，固体组合物呈颗粒形式，并且包括核心粒子、包含本发明的植酸酶的酶层以及盐包衣。
在另一个实施例中，配制剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1，2-丙二醇或1，3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。在一个优选实施例中，配制剂选自以下化合物中的一种或多种：1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。
本发明的植酸酶可以用于在任何工业环境中降解例如植酸盐、植酸、和/或肌醇的单、二、三、四和/或五磷酸盐。熟知的是，这些化合物的磷酸部分螯合二价和三价阳离子，诸如金属离子，即钙、铁、锌和镁的营养必需离子以及微量矿物质锰、铜和钼。此外，植酸还在一定程度上通过静电相互作用结合蛋白质。
因此，本发明的多肽或多核苷酸的优选用途是动物饲料制剂(包括人类食品)或此类制剂的添加剂。
在一个特别实施例中，本发明的多肽或多核苷酸可以用于改善动物饲料的营养价值。改善动物饲料(包括人类食品)的营养价值的非限制性实例是：改善饲料消化率；促进动物生长；改善饲料利用率；改善蛋白质的生物利用率；增加可消化磷酸盐的水平；改善植酸盐的释放和/或降解；改善微量矿物质的生物利用率；改善巨量矿物质的生物利用率；消除对于添加补充磷酸盐、微量矿物质、和/或巨量矿物质的需要；和/或改善蛋壳质量。饲料的营养价值会因此而增加，并且还改善了动物的生长速率和/或体重增益和/或饲料转化率(即，相对于体重增益的摄取的饲料的重量)。在另一个特别实施例中，本发明的多肽或多核苷酸可以用于改善动物的营养存留率和/或营养消化率。
此外，本发明的多肽或多核苷酸可以用于降低粪肥中的植酸盐水平。
动物、动物饲料、和动物饲料添加剂
术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括诸如绵羊、山羊、和牛(例如母牛，诸如肉牛和奶牛)等动物。在一个特别实施例中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物例如猪或生猪(包括但不限于仔猪、生长猪和母猪)；家禽，诸如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意指适于或者旨在由动物摄入的任何化合物、制剂、混合物、或组合物。
在根据本发明的用途中，可以在饮食之前、之后、或同时向动物饲喂该多肽或多核苷酸。优选后者。
本发明进一步涉及一种增强动物的选自生长速率、磷消化率、全身磷存留率的组中的一种或多种和/或降低FCR的方法，所述方法包括向该动物饲喂如本文定义的植酸酶。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
本发明进一步涉及一种增强单胃动物的生长速率或降低FCR的方法，所述方法包括向该动物饲喂如本文定义的植酸酶。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
本发明进一步涉及一种增强动物的生长速率或降低FCR的方法，该动物选自由家禽、生猪、鱼或甲壳动物组成的组，所述方法包括向该动物饲喂如本文定义的植酸酶。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
本发明进一步涉及一种增强家禽的生长速率或降低FCR的方法，所述方法包括向该家禽饲喂如本文定义的植酸酶。该家禽可以典型地选自由以下组成的组：火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)，典型地是鸡，具体地肉鸡和蛋鸡。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
本发明进一步涉及一种增强生猪的生长速率或降低FCR的方法，所述方法包括向该生猪饲喂如本文定义的植酸酶。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
本发明进一步涉及一种增强鱼或甲壳动物的生长速率或降低FCR的方法，所述方法包括向该鱼或甲壳动物饲喂如本文定义的植酸酶。该鱼可以典型地选自由以下组成的组：鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲷鱼(诸如金头鲷)、鲈鱼(诸如海鲈鱼)、和鲤鱼。甲壳动物可以典型地选自由以下组成的组：龙虾、螃蟹、小龙虾、磷虾、虾和对虾。本发明的方法典型地包括100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的植酸酶补充剂量。
在一个特别实施例中，呈添加到饲料中的形式或当包含在饲料添加剂中时的多肽是实质上纯的。在一个特别实施例中，它是明确定义的。术语“明确定义的”意指植酸酶制剂是至少50％纯的，如通过尺寸排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)确定的。在其他特别实施例中，植酸酶制剂是至少60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少95％纯的，如通过此方法确定的。
实质上纯的和/或明确定义的多肽制剂是有利的。例如，对于基本上不受其他多肽干扰或污染的多肽而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确配量具体是指获得一致和恒定的结果的目标，和基于所需效果优化剂量的能力。
然而，为了在动物饲料中使用，本发明的植酸酶多肽不必那么纯；它可以例如包含其他多肽，此时可以将其称为植酸酶制剂。
该植酸酶制剂可以(a)直接添加到饲料中(或者直接用于蛋白质处理过程)，或者(b)它可以用于产生一种或多种随后添加到饲料中(或者用于处理过程)的中间体组合物，诸如饲料添加剂或预混合物。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，以上所述的纯度都是指原始多肽制剂的纯度。
具体地，使用重组产生方法即可获得纯度为上述数量级的多肽制剂，然而，当通过传统的发酵方法产生多肽时，要想获得这些多肽制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。
此类多肽制剂当然可以与其他多肽混合。
可以将呈任何形式的多肽添加到饲料中，如它是相对纯的多肽，或与旨在添加到动物饲料中的其他组分的混合物，即呈动物饲料添加剂的形式，诸如所谓的动物饲料预混合物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，诸如动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混合物。
本发明的另一方面涉及一种包含如本文定义的植酸酶的动物饲料添加剂。动物饲料添加剂可以用于单胃或反刍动物(典型地是单胃动物)的饲料。动物饲料添加剂用于典型地选自由以下组成的组的动物的动物饲料，该组：家禽、生猪、鱼或甲壳动物。动物饲料添加剂典型地包含100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的量的植酸酶。
本发明进一步涉及一种用于家禽饲料的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如本文定义的植酸酶。该家禽饲料添加剂典型地用于选自由以下组成的组的家禽的饲料：火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)，典型地是鸡，具体地肉鸡和蛋鸡。
本发明进一步涉及一种用于生猪饲料的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如本文定义的植酸酶。
本发明进一步涉及一种用于鱼或甲壳动物饲料的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如本文定义的植酸酶。该鱼典型地选自由以下组成的组：鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲷鱼(诸如金头鲷)、鲈鱼(诸如海鲈鱼)、和鲤鱼。甲壳动物可以典型地选自由以下组成的组：龙虾、螃蟹、小龙虾、磷虾、虾和对虾。
除本发明的多肽以外，本发明的动物饲料添加剂还含有至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种微量矿物质。该饲料添加剂还可以含有至少一种巨量矿物质。
此外，任选的饲料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素诸如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗维生素肽；多不饱和脂肪酸；活性氧生成物质；和/或至少一种选自以下的其他肽：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；磷酸酶(EC 3.1.3.1；EC3.1.3.2；EC 3.1.3.39)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
如在饲喂肉鸡中在实例14中所证明，本发明的蛋白酶和植酸酶的组合使蛋白质消化率增加了0.7％至1.6％，蛋白质存留率增加了0.9％至4.4％，并且能量存留率增加了0.6％至1.3％。这使得体重增益(BWG)提高了2.3％或3.7％并且饲料转化率提高了4.6％或2.8％。因此，本发明的一个实施例涉及一种包含本发明的植酸酶和蛋白酶的动物饲料或动物饲料添加剂。蛋白酶可以选自包含在以下中的蛋白酶：Ronozyme ProAct
典型地，包含蛋白酶和植酸酶的动物饲料在饲料中包含100至5,000FYT/kg的植酸酶，诸如500至2000FYT/kg。典型地，包含蛋白酶和植酸酶的动物饲料在饲料中包含10,000至50,000U/kg的植酸酶，诸如15,000至35,000U/kg，典型地20,000至40,000U/kg。
在一个特别实施例中，这些其他多肽是明确定义的(如上针对植酸酶制剂定义的)。
本发明的植酸酶还可以与其他植酸酶组合，例如子囊菌植酸酶，诸如曲霉属植酸酶，例如来源于无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、黑曲霉、或泡盛曲霉；或担子菌植酸酶，例如来源于隔孢伏革菌(Peniophora lycii)、平田头菇(Agrocybe pediades)、绒毛栓菌(Trametes pubescens)、或卷边网褶菌(Paxillus involutus)；或其具有植酸酶活性的衍生物、片段或变体。
因此，在本发明的动物饲料中的用途的优选实施例中，并且在本发明的动物饲料添加剂和动物饲料的优选实施例中，本发明的植酸酶与此类植酸酶组合。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫素、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和奥维司匹林(Ovispirin)诸如诺维司匹林(Novispirin)(Robert Lehrer，2000)、菌丝霉素(Plectasin)、和他汀(包括在WO 03/044049和WO 03/048148中披露的化合物和多肽)以及以上的保留抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉(Aspergillus niger)肽，以及其保留抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/0 1459和WO02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，诸如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
活性氧产生物质的实例是诸如过硼酸盐、过硫酸盐、或过碳酸盐等化学品；以及多肽，诸如例如氧化酶、氧合酶或合酶。
通常，脂溶性维生素和水溶性维生素以及微量矿物质形成所谓的旨在添加到饲料中的预混合物的一部分，而巨量矿物质通常被分开地添加到饲料中。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的多肽时，都是本发明的动物饲料添加剂。
在一个特别实施例中，本发明的动物饲料添加剂旨在以以下水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中：0.01％至10.0％；更具体地0.05％至5.0％；或0.2％至1.0％(％意指g添加剂/100 g饲料)。具体地，对预混合物也是如此。
以下列出了这些组分的非排他性实例列表：
脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E、和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸酯，例如Ca-D-泛酸酯。
微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒、和钴。
巨量矿物质的实例是钙、磷和钠。
这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养需求意指应在饮食中提供指示浓度的这些组分。
在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种或直至所有十五种单独组分中的任一种、一种或多种。更特别地，此至少一种单独组分以提供在表A的第四栏、或第五栏、或第六栏指示的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包含在本发明的添加剂中。
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪饮食可以如WO 01/58275的表B第2-3栏所指示来表征。鱼饮食可以如此表B第4栏所指示来表征。此外，此类鱼饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275对应于US 09/779334，其通过援引特此并入。
根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，并且此外还包含至少一种本发明的多肽。
此外或在(以上指示的粗蛋白含量)的替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在特别实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任一个内。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)确定氮含量(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis[官方分析方法]第14版，Association of Official Analytical Chemists[官方分析化学家集]，华盛顿特区)。
可代谢能量可以根据如下进行计算：NRC出版物Nutrient requirements inswine[生猪的营养需求]，第九次再版1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.[美国国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会]美国国家科学院出版社[NationalAcademy Press]，华盛顿特区，第2-6页；以及European Table of Energy Values forPoultry Feed-stuffs[欧洲家禽饲养材料能量值表]，斯克得霍特家禽研究与推广中心(Spelderholt centre for poultry research and extension)，7361 DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv，瓦赫宁恩(Wageningen).ISBN 90-71463-12-5。
根据诸如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7等饲料表计算在动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的膳食含量。
在一个特别实施例中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种蛋白质。该蛋白质可以是动物性蛋白质，诸如肉和骨粉和/或鱼粉；或者它可以是植物性蛋白质。如本文所用，术语植物性蛋白质是指包含至少一种来源于或源自植物的蛋白质的任何化合物、组合物、制剂或混合物，该蛋白质包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在特别实施例中，植物性蛋白质的蛋白含量是至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％(w/w)。
植物性蛋白质可以来源于植物性蛋白质源，诸如豆类和谷类，例如来自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科、和早熟禾科植物的材料，诸如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。
在一个特别实施例中，植物性蛋白质源是来自豆科的一种或多种植物材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆。
在另一个特别实施例中，植物性蛋白质源是来自一种或多种藜科植物，例如甜菜、糖甜菜(sugar beet)、菠菜或奎奴亚藜的材料。
植物性蛋白质源的其他实例是油菜籽、向日葵籽、棉籽、和卷心菜。
大豆是优选的植物性蛋白质源。
植物性蛋白质源的其他实例是谷类，诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦、和高粱。
在又另外的特别实施例中，本发明的动物饲料组合物含有0％-80％玉蜀黍；和/或0％-80％高粱；和/或0％-70％小麦；和/或0％-70％大麦；和/或0％-30％燕麦；和/或0％-40％大豆粉；和/或0％-25％鱼粉；和/或0％-25％肉和骨粉；和/或0％-20％乳清。
可以将动物饮食制造成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。多肽可以作为固体或液体多肽配制品添加。例如，典型地在混合步骤之前或期间添加固体多肽配制品；典型地在丸粒化步骤之后添加液体多肽制剂。也可以将该多肽掺入饲料添加剂或预混合物中。
饮食中最终多肽浓度是在0.01-200mg多肽蛋白/kg饮食的范围内，例如在5-30mg多肽蛋白/kg动物饮食的范围内。
本发明的植酸酶当然应以有效量，即足以改善饲料的溶解和/或改善营养价值的量施加。目前预期按一个或多个以下量(剂量范围)施用多肽：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有这些范围都以mg植酸酶多肽蛋白/kg饲料(ppm)为单位。
为了确定mg植酸酶多肽蛋白/kg饲料，从饲料组合物中纯化植酸酶，并且使用相关测定来确定经纯化的植酸酶的比活性。还使用相同测定确定像这样的饲料组合物的植酸酶活性，并且在这两次确定的基础上计算出以mg植酸酶蛋白/kg饲料为单位的剂量。
应用相同的原理确定饲料添加剂中的植酸酶多肽蛋白的mg数。当然，如果样品使用了用于制备饲料添加剂或饲料的植酸酶，可以由此样品确定比活性(不需要从饲料组合物或添加剂中纯化植酸酶)。
用于产生发酵产物的方法
本发明的再一方面涉及用于产生发酵产物，例如像酒精、啤酒、葡萄酒、干酒糟(DDG)的方法，其中该发酵在通过本发明产生的植酸酶存在下进行。发酵过程的实例包括例如WO 01/62947中所述的过程。发酵是使用发酵微生物(诸如酵母)进行。
在一个特别实施例中，本发明提供了用于产生发酵产物的方法，这些方法包括(a)在本发明的植酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，诸如酵母)含有碳水化合物的材料(例如，淀粉)，和(b)由该发酵的含有碳水化合物的材料产生该发酵产物。
在一个特别实施例中，本发明提供了用于产生酒精的方法，这些方法包括在本发明的植酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，诸如酵母)含有碳水化合物的材料(例如，淀粉)，和由该发酵的含有碳水化合物的材料产生或回收酒精。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生酒精的方法，这些方法包括a)例如通过液化和/或糖化过程、原淀粉水解过程水解淀粉，b)在本发明的植酸酶存在下发酵所得的淀粉，和c)产生酒精。
植酸酶可以在任何合适的阶段并以任何合适的组合物添加到发酵过程中，包括单独或与其他酶组合，诸如一种或多种α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、和/或纤维素酶。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生酒精的方法，这些方法包括水解生物质，和在本发明的植酸酶存在下发酵(使用发酵微生物，诸如酵母)所得的生物质。
植物
本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生植酸酶。植酸酶可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有植酸酶的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性、以及流变特性，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，诸如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，诸如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，诸如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(诸如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)、以及十字花科植物(十字花科)(诸如花椰菜、油菜籽、和紧密相关的模式生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana))。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，诸如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，诸如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分、和植物细胞的子代。
表达植酸酶的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建植物或植物细胞：将编码植酸酶的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码植酸酶的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的可选择标记，和将此构建体引入所讨论的植物中所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达植酸酶来确定对调节序列诸如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择。例如，编码植酸酶的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，诸如种子或叶。调节序列由例如Tague等人，1988，Plant Physiology[植物生理学]86：506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(Franck等人，1980，Cell[细胞]21：285-294；Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689；Zhang等人，1991，Plant Cell[植物细胞]3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(诸如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.[遗传学年度评论]24：275-303)、或来自代谢库组织(诸如分生组织)(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24：863-878)、种子特异性启动子，诸如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(Wu等人，1998，Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39：885-889)、来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆(Viciafaba)的未知种子蛋白基因(Conrad等人，1998，J.Plant Physiol.[植物生理学杂志]152：708-711)、来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人，1998，PlantCell Physiol.[植物与细胞生理学]39：935-941)、来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，诸如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人.，1993，Plant Physiol.[植物生理学]102：991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]26：85-93)、来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]248：668-674)、或伤口诱导型启动子(诸如马铃薯pin2启动子)(Xu等人，1993，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：573-588)。同样地，该启动子可以通过诸如温度、干旱或盐度变化等非生物处理来诱导，或通过外源地应用使该启动子活化的物质(例如，乙醇；雌激素；植物激素，诸如乙烯、脱落酸、和赤霉酸；及重金属)来诱导。
启动子增强子元件也可以用于实现植酸酶在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码植酸酶的多核苷酸之间的内含子。例如，Xu等人，1993，同上，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
可选择标记基因及表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体并入到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser等人，1990，Science[科学]244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology[生物/技术]8：535；Shimamoto等人，1989，Nature[自然]338：274)。
根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19：15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，尽管对于这些植物可以使用其他转化方法。一种用于生成转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou，1992，Plant J.[植物杂志]2：275-281；Shimamoto，1994，Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评]5：158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology[生物/技术]10：667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人，1993，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]21：415-428所描述的。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过援引以其全文并入本文)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。经常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码植酸酶的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了此类植物的子代。如本文所用，子代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何世代的后代。此类子代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过将起始系用供体植物系交叉授粉，将转基因引入植物系中。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化工艺生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个中。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以在特定杂交的个别子代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所需性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所需种质的子代。以这种方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景中所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的植酸酶的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该植酸酶的条件下培养包含编码该植酸酶的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收该植酸酶。
在以下段落中进一步定义本发明：
1.一种植酸酶变体，该植酸酶变体与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，并且与SEQID NO：2相比包含改变N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L，并且在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号。
2.如段落1所述的变体，该变体在以下位置中包含取代：57、73、121、134、155、207和273。
3.如段落2所述的变体，该变体在以下位置中进一步包含取代：36、60、64、73、119、130、138、161、162、168、176、180、184、190、224、230、243、336和340。
4.如段落1-3中任一项所述的变体，其中这些取代选自：30Q、36A、43C、46C、57Y、60H、64Q、73P、79Q、119P、121P、123C、130T，C、134Q、138A、151S、155F、161T、162A、168R176P、180N、184Q、190T、207T、224Q、230E、243N、273L、286S、336R、340L，P、358Q和375K。
5.如段落1-4中任一项所述的变体，该变体包含取代31C/52C/57Y/73P/99C/121P/134Q/141C/155F/177C/199C/203L/207T/273L。
6.如段落5所述的变体，该变体选自包含选自由以下组成的组的取代的变体：
31C/52C/57Y/73P/99C/121P/134Q/141C/155F/177C/199C/203L/207T/273L；
31C/36A/52C/57Y/60H/64Q/73P/99C/119S/121P/130T/134Q/138A/141C/155F/161T/162A/176P/177C/180N/184Q/190T/199C/203L/207T/224Q/230E/243N/273L/336R/340L；
31C/36A/43C/46C/52C/57Y/60H/64Q/73P/99C/119S/121P/130T/134Q/138A/141C/155F/161T/162A/176P/177C/180N/184Q/190T/199C/203L/207T/224Q/230E/243N/273L/286S/336R/340L；
31C/36A/52C/57Y/60H/64Q/73P/99C/119S/121P/123C/130C/134Q/138A/141C/151S/155F/161T/162A/176P/177C/180N/184Q/190T/199C/203L/207T/224Q/230E/243N/273L/336R/340L；和
31C/36A/43C/46C/52C/57Y/60H/64Q/73P/99C/119S/121P/123C/130C/134Q/138A/141C/155F/161T/162A/176P/177C/180N/184Q/190T/199C/203L/207T/224Q/230E/243N/273L/286S/336R/340L。
7.如段落6所述的变体，该变体具有带有以下取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，这些取代选自由以下组成的组：
N31C/G52C/E57Y/N73P/A99C/N121P/S134Q/K141C/Y155F/T177C/V199C/N203L/P207T/M273L；
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L；
N31C/Q36A/P43C/W46C/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L；
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/P123C/M130C/S134Q/L138A/K141C/N151S/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L；或
N31C/Q36A/P43C/W46C/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/P123C/M130C/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L。
8.如段落1-7中任一项所述的变体，其中该亲本植酸酶与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
9.如段落1-8中任一项所述的变体，其中该亲本植酸酶包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由其组成。
10.如段落1-9中任一项所述的变体，该变体与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L的植酸酶相比具有改善的热稳定性。
11.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-10中任一项所述的变体。
12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如段落11所述的多核苷酸。
14.一种产生如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体的方法，该方法包括：
在适于表达该变体的条件下培养如段落13所述的宿主细胞；和
回收该变体。
15.一种植物，该植物包含如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体和/或如段落11所述的多核苷酸。
16.一种组合物，该组合物包含至少一种如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体。
17.如段落16所述的组合物，该组合物进一步包含：
至少一种脂溶性维生素；
至少一种水溶性维生素；和/或
至少一种微量矿物质。
18.如段落16或17所述的组合物，该组合物进一步包含至少一种选自以下酶组的酶：淀粉酶、植酸酶、磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶和/或β-葡聚糖酶。
19.如段落16-18中任一项所述的组合物，该组合物是动物饲料添加剂。
20.一种动物饲料组合物，该动物饲料组合物具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并且包含如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体、如段落11所述的多核苷酸、或如段落16-19中任一项所述的组合物。
21.一种改善动物饲料的营养价值的方法，其中将如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体、如段落11所述的多核苷酸、或如段落16-19中任一项所述的组合物添加到该饲料中。
22.一种用于降低动物粪肥中的植酸盐水平的过程，该过程包括向动物饲喂有效量的如段落20所述的饲料组合物。
23.一种用于处理植物性蛋白质的方法，该方法包括将如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体、如段落11所述的多核苷酸、或如段落16-19中任一项所述的组合物添加到至少一种植物性蛋白质或蛋白质源中的步骤。
24.一种用于增加动物的体重增益和/或改善饲料转化率的方法，该方法包括向该动物施加具有有效量的如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体、如段落11所述的多核苷酸、或如段落16-19中任一项所述的组合物的饲料的步骤。
25.如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体、如段落11所述的多核苷酸、或如段落16-19中任一项所述的组合物在以下中的用途：动物饲料；动物饲料的制备；改善动物饲料的营养价值；降低动物粪肥中的植酸盐水平；处理植物性蛋白质；从植酸盐底物中释放磷；或增加体重增益，改善动物的比生长速率和/或改善饲料转化率；或改善动物的营养存留率和/或营养消化率。
26.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括(a)在如段落1-10中任一项所述的植酸酶变体或如段落11所述的多核苷酸存在下使用发酵微生物发酵含有碳水化合物的材料，和(b)由该发酵的含有碳水化合物的材料产生发酵产物或发酵副产物。
27.如段落26所述的方法，其中该发酵产物是酒精、啤酒、葡萄酒或干酒糟(DDG)。
28.一种具有植酸酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
a)与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b)与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c)与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d)与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e)与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽。
29.如段落28所述的多肽，该多肽从布氏柠檬酸杆菌获得或可从布氏柠檬酸杆菌获得。
30.如段落28至29中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽是pH稳定且热稳定的，使得它具有以下特性中的一种或多种：
i.在pH 4下至少75℃的去折叠温度；
ii.在pH 3下至少70℃的去折叠温度；和
iii.在pH 2下至少55℃的去折叠温度。
31.如段落28至30中任一项所述的分离的多肽，其中所述多肽是酸稳定的，使得它在pH 2、3、4、5、6、7和8中的每一个下24小时之后维持高于90％的残余活性水平。
32.如段落28至31中任一项所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2相比包含改变N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C。
33.如段落28至32中任一项所述的多肽，该多肽在选自以下的一个或多个位置中包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号。
34.一种制备具有植酸酶活性的重组多肽的方法，该方法包括以下步骤：
(a)培养包含选自由以下组成的组的外源多核苷酸的重组宿主细胞：
a.与SEQ ID NO：13具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
b.与SEQ ID NO：15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
c.与SEQ ID NO：17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
d.与SEQ ID NO：19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
e.与SEQ ID NO：21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
35.一种产生具有植酸酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养包含外源多核苷酸的重组宿主细胞，该外源多核苷酸编码具有植酸酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；以及
e.与SEQ ID NO：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽；
其中表达该多核苷酸并产生该多肽；
(b)任选地分离该多肽；以及
(c)任选地回收该多肽。
36.如段落35所述的方法，其中该具有植酸酶活性的多肽与SEQ ID NO：2相比包含取代N31C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C。
37.如段落34至36中任一项所述的方法，其中该多肽在选自以下的一个或多个位置中进一步包含取代：30、36、43、46、57、60、64、73、79、119、121、123、130、134、138、151、155、161、162、168、176、180、184、190、207、224、230、243、273、286、336、340、358和375，使用SEQ ID NO：2用于编号。38.一种动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如段落1至10中任一项所述的植酸酶，用于选自下组的动物的动物饲料，该组由以下组成：家禽、生猪、鱼或甲壳动物。
39.如段落38所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂用于家禽的饲料，其中该家禽选自由以下组成的组：火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡、蛋鸡)，典型地是鸡，具体地肉鸡和蛋鸡。
40.如段落38所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂用于生猪的饲料。
41.如段落38所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂用于鱼或甲壳动物的饲料。
42.如段落41所述的动物饲料添加剂，其中该鱼选自由以下组成的组：鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲷鱼诸如金头鲷、鲈鱼诸如海鲈鱼、和鲤鱼，并且其中该甲壳动物选自由以下组成的组：龙虾、螃蟹、小龙虾、磷虾、虾和对虾。
43.如段落38至42中任一项所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含100-5000FYT/kg饲料、诸如125至4000FTY/kg饲料、诸如125至3000FTY/kg饲料的量的如段落1至10所述的植酸酶。
本文所描述和要求保护的发明并不局限于本文披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的几方面的例示性说明。任何等同的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
本文引用了多个参考，其披露内容通过援引以其全文并入本文。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
使用的化学品至少是试剂等级的商业产品。
实例1：变体的制备和活性的确定
植酸酶变体在米曲霉中的表达
使用包含实例中的布氏柠檬酸杆菌植酸酶变体基因的构建体构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由以下表达盒组成，该表达盒是基于融合至构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在曲霉属选择性标记pyrG，其来自使得作为pyrG minus的曲霉属能够在基本培养基上生长的构巢曲霉。将植酸酶变体的表达质粒转化到曲霉属中，如Lassen等人(2001)，Applied and Environmental Micorbiology[应用与环境微生物学]，67，4701-4707中所述。针对每个构建体，分离、纯化并在微量滴定板中培养4-6个菌株。使用对硝基苯基磷酸酯底物确定表达。在摇瓶中发酵产生最好的菌株。
布氏柠檬酸杆菌植酸酶变体的纯化
通过具有0.22μm截留的快速PES瓶(Fast PES Bottle)顶部过滤器过滤具有植酸酶变体的发酵上清液。将所得溶液用水稀释至双倍体积，并用乙酸将pH调节至4.5。偶尔地，该溶液变得有一点模糊并且通过具有0.22μm截留的快速PES瓶顶部过滤器过滤来去除这种模糊。
在预处理之后，通过在XK26柱中的大约30ml的S琼脂糖(S Sepharose)上的色谱法纯化植酸酶变体，使用50mM乙酸钠(pH 4.5)作为缓冲液A并且使用50mM乙酸钠+1M NaCl(pH4.5)作为缓冲液B。使用磷酸酶测定分析来自柱的级分的活性(参见下文)，并且汇集具有活性的级分。
在一些情况下，使用具有30kDa截留膜的Amicon ultra-15过滤装置浓缩含有纯化植酸酶变体的溶液。
如从SDS-PAGE中估计的分子量大约为45-50kDa并且纯度>95％。
磷酸酶活性的确定
将75微升含有植酸酶的酶溶液分配在微量滴定板孔(例如，NUNC 269620)中，并且添加75微升底物(对于制备底物，将两片5mg对硝基苯基磷酸酯片(西格玛公司(Sigma)，目录号N-9389)溶解在10ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.5中)。将板密封并温育15min.，在37℃下以750rpm振荡。在温育时间之后，添加75微升终止试剂(终止试剂是0.1M在水中的四硼酸二钠)，并且在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。一个磷酸酶单位定义为在给定反应条件下释放1微摩尔磷酸盐/min的酶活性(缓冲液盲减)。在测定条件下，1微摩尔对硝基苯酚的吸光度确定为56AU(AU＝吸光度单位)。
植酸酶活性的确定
将适当稀释于0.25M乙酸钠、0.005％(w/v)Tween-20(pH 5.5)中的75微升含有植酸酶的酶溶液分配在微量滴定板孔(例如NUNC 269620)中，并且添加75微升底物(通过将100mg来自稻的植酸钠(奥德里奇公司(Aldrich)目录号274321)溶解在10ml 0.25M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中来制备)。将板密封并温育15min.，在37℃下以750rpm振荡。在温育之后，添加75微升终止试剂(将10ml钼酸盐溶液(在0.25％(w/v)氨溶液中的10％(w/v)七钼酸铵)、10ml偏钒酸铵(0.24％商业产品，来自Bie&Berntsen公司，目录号LAB17650)、和20ml21.7％(w/v)硝酸混合来制备终止试剂)，并且在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。植酸酶活性以FYT单位表示，一个FYT是酶在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸盐的量。所测量的植酸酶活性的绝对值可以通过参考从无机磷酸盐的适当稀释物制得的标准曲线或通过参考从具有已知活性的植酸酶酶制剂的稀释物得到的标准曲线获得(这种具有已知活性的标准酶制剂经要求是可从DK-2880巴格斯维尔德的克罗格休约尔36的诺维信公司(Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd)获得的)。
实例2：单位置变体
此实例的亲本植酸酶是具有带有以下取代的SEQ ID NO：2的序列的变体：(var300)N3 1C/G52C/A99C/K141C/T177C/V199C/N203L。
如实例1所述制备亲本植酸酶的96个单位置变体。基于已知植酸酶的比对和如本领域已知的共有序列的鉴定来选择取代。根据制造商的说明书，使用Protein ThermalShift
表1.
/>
实例3：组合有益位置
基于实例2中披露的结果，生成了组合若干有益取代的变体，该变体具有带有以下取代的SEQ ID NO：2的序列：
(var400)：
N31C/G52C/E57Y/N73P/A99C/N121P/S134Q/K141C/Y155F/T177C/V199C/N203L/P207T/M273L
设计基因，并且如实例1所述产生变体。在变体上一式三份进行热位移测定，该测定显示81℃。
实例4：另外的组合变体
基于实例2中披露的结果，使用实例3中生成的变体作为亲本植酸酶，变体组合了另外的有益取代。生成了具有带有以下取代的SEQ ID NO：2的序列的以下变体：
(var404)
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L
(var405)
N31C/Q36A/P43C/W46C/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/M130T/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L
(var406)
N31C/Q36A/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/P123C/M130C/S134Q/L138A/K141C/N151S/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/K336R/T340L
(var411)
N31C/Q36A/P43C/W46C/G52C/E57Y/Q60H/L64Q/N73P/A99C/E119S/N121P/P123C/M130C/S134Q/L138A/K141C/Y155F/S161T/S162A/E176P/T177C/T180N/S184Q/P190T/V199C/N203L/P207T/E224Q/Q230E/R243N/M273L/N286S/K336R/T340L
实例5：生成的变体的热稳定性
构建以下变体并测试其热稳定性：
表2.
通过纳米差示扫描荧光(nanoDSF)测试了变体的热稳定性。
Nano-DSF根据温度监测330和350nm处蛋白质的内在色氨酸(Trp)荧光。蛋白质的温度稳定性可以通过在荧光信号拐点处发现的Tm(折叠和去折叠分子数量相等的温度)来表示。
用nanoDSF Prometheus NT.48仪器(诺坦普科技有限责任公司，慕尼黑，德国(NanoTemper Technologies GmbH，München，Germany))进行NanoDSF。通过毛细管作用将植酸酶变体样品(如实例1所述进行纯化，它们全部在50mM乙酸钠(pH 4.5)中)加载到nanoDSF标准级毛细管(诺坦普科技有限责任公司；目录号PR-C002)中。每个样品填充三个毛细管。然后将毛细管放入仪器中(单次运行最多可以加载48个单个毛细管)，并且确定最佳信号生成所需的激光强度。用以下实验环境运行样品：温度斜率2℃/分钟，开始温度20℃和结束温度95℃。
使用仪器随附的软件(PR.ThermControl v2.0.4，诺坦普科技有限责任公司)分析数据，并且确定Tm(针对比率350nm/330nm)(结果在以下表3中示出)。
此外，使用WO 2011/117396，实例4中披露的测定，使用DSC测试变体。结果在表3中示出。
表3.
还使用NanoDSF(以上所述)在pH范围1.0至8.5内测试这些变体的热稳定性。变体样品是在0.1M甘氨酸、0.1M乙酸、0.1M Bis-Tris中，用0.5M HCl或0.1M NaOH调节至所需pH。在此实验中，温度斜率是3.33℃/分钟。结果在表4a和4b中示出。
表4a
表4b
/>
结论：这些变体在所有测试的pH值下都具有增加的去折叠温度。与野生型相比，这些变体在所有pH下都具有改善的热稳定性。
实例6：pH-稳定性
通过在37℃和各种pH值下温育1.0和24小时之后测量残余植酸酶活性来确定C.b.Wt(SEQ ID NO：2)和var400(SEQ ID NO：12)的纯化植酸酶在37℃下的pH稳定性。将植酸酶在0.1M甘氨酸、0.1M乙酸、0.1M Bis-Tris中温育，调节至所需pH。在0、1.0和24小时之后取出相应温育混合物的样品，通过在0.25M乙酸钠、0.005％(w/v)Tween20(pH 5.5)中稀释将样品的pH调节至5.5，并且使用实例1中所述的方法确定pH 5.5下的残余活性。归一化至0小时发现的活性的24小时的结果在以下表5中示出。
表5.37℃下的pH稳定性
Var400在24小时温育之后在非常低的pH(pH 1.0-3.0)下温育之后具有更高的残余活性。
实例7：在胃蛋白酶存在下的pH-稳定性
通过在37℃和各种pH值下分别温育30和60分钟之后测量残余植酸酶活性来确定C.b.Wt(SEQ ID NO：2)和变体(参见下表)的纯化植酸酶在37℃下和胃蛋白酶存在下的pH稳定性。将植酸酶在0.1M甘氨酸、0.1M乙酸、0.1M Bis-Tris中温育，调节至所需pH并添加500U/ml胃蛋白酶(Sigma P7000)。在0、30分钟和60分钟之后取出相应温育混合物的样品，通过在0.25M乙酸钠、0.005％(w/v)Tween20(pH 5.5)中稀释将样品的pH调节至5.5，并且使用实例1中所述的方法确定pH 5.5下的残余活性。归一化至0小时发现的活性的结果在以下表6和7中示出。
表6.30分钟温育之后的残余活性。
表7.60分钟温育之后的残余活性。
与var300参考相比，这些变体在胃蛋白酶存在下在低于3.0的pH值下具有增加的pH-稳定性。
实例8：植酸酶在肉鸡和断奶仔猪中的功效研究
在肉鸡研究中，将鸡(Cobb 500，雄性，可从中国北京峪口禽业有限责任公司(Yukou Poultry Husbandary Co.，Ltd.，Beijing，China)购买)圈养在环境受控房间中的金属丝地板电池笼中。在试验开始时(第8天年龄)，将鸡按体重分类并分到重复组中，每组包括8只鸡。将笼子重量相似的鸡随机分配到不同处理之一中，并且每个处理用12个笼子重复。有8个饮食处理，由阴性对照和补充7个水平的植酸酶变体(var400)的阴性对照组成：187.5、375、750、1125、1500、1875或2250 FYT/kg。以玉米和大豆粉为主要成分制备基础饮食，并将其配制为仅缺乏总P(0.46％)。在实验饮食完全混合之前，将植酸酶变体与少量基础饮食预混合，以确保混合的均匀性。将饲料在75℃下丸粒化。饮食处理的分析植酸酶变体活性是182、328、640、1060、1347、1560和1931 FYT/kg。
从第8天至第18天年龄将实验饮食提供给鸡，在整个试验过程中随意提供饲料和水。在第8天和第17天年龄，按笼子记录饲料消耗量和体重(BW)，以计算体重增益(WG)、饲料摄取量(FI)和饲料转化率(FCR)。在第14天至第17天收集排泄物。在此时间段期间，每天一次定量收集来自每个处理的12个笼子的排泄物，并且将4天的每个笼子的排泄物汇集在一起，收集之后立即在-20℃下冷冻。在解冻后，将每个笼子的总排泄物均质化，并且取代表性子样品并且冷冻干燥，用于确定干物质(DM)、P、Ca和植酸盐-P。还记录了排泄物收集时间段期间的饲料消耗总量。在第18天年龄，从12个复制笼中的每一个中随机选择的2只鸡中取出右胫骨。将胫骨去肉，并且在收集之后去除软骨帽。将它们在-20℃的塑料袋中保持冷冻以维持湿度，直至分析灰分、Ca和总P含量。
在仔猪研究中，使用了140头阉割的公仔猪(Redon x Big White)。将仔猪在28天年龄断奶，并且在试验开始时具有7.5±1.1kg(平均值±标准偏差)的平均体重。将仔猪圈养在环境受控房间中的35个平甲板笼子里，每个笼子4只动物。每个笼子都有塑料涂层的焊接金属丝地板，并配有两个水喷嘴和两个不锈钢喂料器。实验饮食饲喂42天，分为14天的起始期和28天的生长期。随意提供水和饲料。饲料以糊状物形式提供。
有7个饮食处理，由阳性对照(PC)、阴性对照(NC)和补充187.5、375、750、1500或3000FYT测试植酸酶/kg饲料的NC组成(关于分析：起始期饮食中266、383、771、1445、和2914FYT/kg；生长期饮食中219、395、884、1408、和2730FYT/kg)。起始期和生长期的PC饮食分别满足由NRC(2012)规定的7至11kg和11至25kg体重范围的猪对于能量和营养物质的需求，并且以玉米、大豆粉和油菜籽粉作为主要成分配制。NC饮食是通过从PC饮食中取出磷酸二钙来建立的，从而产生具有足够Ca的P缺乏饮食(起始期和生长期的总P分别为0.43％和0.41％)。饮食的成分和营养组成在表8中示出。
表8.肉鸡和仔猪试验中实验饮食的成分和营养组成，％
/>
(1)每kg饮食提供的肉鸡预混合物：维生素A，10,000IU；维生素D
每kg饮食提供的仔猪预混合物：维生素A，15,000IU；维生素D
对猪单独称重并记录每个猪栏的饲料消耗量，以计算平均每日增益(ADG)、平均每日饲料摄取量(ADFI)和FCR。在试验结束时，屠宰每个猪栏的2头体重最接近其猪栏的平均体重的猪以收集股骨。将右股骨分离并去除软组织。通过锯切获得每个股骨的骨干切片(长度为约3.5em)，并且然后进行压缩以确定使骨破裂的力(以牛顿为单位)。使用破裂的骨来确定灰分、Ca和P含量。
将从肉鸡和猪试验中收集的饮食和排泄物样品在分析之前研磨以通过0.5-mm筛网。一式两份分析所有样品。将样品在105℃下在烘箱中干燥4小时以进行干物质确定(方法934.01；美国官方农业化学家协会(AOAC International)，2006)。在硫酸矿化之后，通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES；5100Dual View，安捷伦公司，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国(Agilent，Santa Clara，CA，USA)；方法985.01；美国官方农业化学家协会(AOACInternational)，2006)确定Ca和P。将饮食植酸盐P计算为总P与游离P之间的差异。用大剂量植酸酶处理饮食样品以释放植酸盐结合的P之后确定总P。在0.66M HCl中过夜提取之后确定未与植酸盐结合的游离P。通过比色法测量植酸酶活性。一个植酸酶单位被定义为在37℃和pH 5.5下每分钟从5.0 mM植酸酶中释放1μmol无机磷酸盐的酶的量。
在肉鸡和猪试验中，使用SAS(赛仕软件研究所，加里，北卡罗来纳州，美国(SASInc.，Gary，NC，USA)，9.0版)的GLM程序通过单向ANOVA分析数据。构建正交对比以测试补充植酸酶变体对NC饮食的线性和二次效应。在肉鸡试验中还应用了Tukey多重比较测试。呈现了最小二乘均值。
结果
在肉鸡研究中，在第8至17天年龄期间，NC中鸡的体重增益和饲料消耗量比Cobb500性能目标低10％约15％，这是由于NC饮食中的P缺乏所致。增加向NC饮食中添加植酸酶变体以线性和二次方式两者改善了鸡在第8-17天的体重增益和饲料摄取量(p＜0.01)。在用高剂量植酸酶变体进行的处理中观察到实现了性能目标，而没有注意到不良效应。另外，来自排泄物的数据表明，随着植酸酶变体补充的增加，来自植酸盐-P降解的P释放以及P和Ca的对应存留率以线性和二次方式改善(p＜0.01)。随着植酸酶变体添加的增加，Ca和P在骨灰中以剂量依赖性方式沉积，与性能和排泄物结果一致。
在仔猪研究中，仔猪的生长性能因饲料中P缺乏而降低，这表现在第14至42天以及整个试验持续时间期间与PC相比，NC仔猪的ADG和ADFI显著降低，这通过增加植酸酶变体的添加而逐渐纠正。随着植酸酶变体剂量的增加，测试植酸酶在第14至42天以及整个试验持续时间期间以线性和二次方式改善了ADG和ADFI(p<0.01)。在试验结束时，通过仔猪的平均体重也观察到了这种模式。与生长性能结果一致，与添加植酸酶变体相关联的骨强度以及灰分、Ca和P的骨含量显著改善(p＜0.01)也显示了剂量-应答关系。此外，在3,000FYT/kg饲料(当前研究中测试的最高剂量植酸酶变体)下实现的生长性能和骨测量值超过了PC的水平，在试验期间没有引起任何明显的不良效应。这显示了当以3,000FYT/kg饲料包括在内时，PC饮食中以磷酸二钙形式提供的Ca和P都可以完全被植酸酶变体替代。
表9.肉鸡的生长性能、排泄物中的Ca(％)和P(％)存留率、植酸盐-P降解率(％)和骨参数。
同一行内具有不同上标的均值差异显著(P<0.05)。
表10.仔猪的生长性能和骨参数
每个处理8个重复。
实例9：补充植酸酶变体的妊娠晚期和泌乳母猪中钙和磷的表观总肠道消化率
此研究的目的是在具有大白猪(Large white)、长白猪(Landrace)和杜洛克猪(Duroc)的遗传背景并饲喂使用国家研究委员会(NRC)(2012)针对饲料成分建议的可消化P配制的饮食的妊娠晚期和泌乳母猪中评价植酸酶变体(var400)。实例1和2中分别使用了45头妊娠晚期母猪和45头泌乳母猪，采用完全随机的设计。为母猪提供对照饮食(表11)和添加187.5或375FYT植酸酶/kg饲料的对照饮食。饮食中没有任何无机P补充剂并且包含3g/kgTiO
D
D
其中D
通过SAS(赛仕软件研究所，加里，北卡罗来纳州)的GLM程序分析消化率和性能数据，模型包括饮食处理作为唯一的固定效应和误差项。构建正交对比以测试补充植酸酶的线性和二次效应，并将对照与添加植酸酶的处理进行比较。
结果在表12中示出。植酸酶为母猪释放0.07％-0.12％的可消化P，这取决于植酸酶剂量和母猪的生理阶段(对于泌乳母猪释放更多的P)。
表11.基础饮食的成分和营养组成(g/kg饲料，按原样基础)
/>
a在将饮食混合之前将小麦麸在95℃下丸粒化。
b每千克饮食提供的预混合物：维生素A，12,000IU；维生素D
表12.妊娠母猪和泌乳母猪的饲料中钙(Ca)和磷(P)以及消化的Ca和P的表观总肠道消化率，％
/>
a每个最小二乘均值代表15个观测值。
bSEM：平均值的标准误差。
实例10：虹鳟鱼(虹鳟(Oncorhynchus mykiss))中的植酸酶功效
实验饮食
根据表13中详述的配方，在Village-Neuf(法国)帝斯曼营养产品公司(DSMNutritional Products)的动物营养与健康研究中心(Research Centre for AnimalNutrition&Health)的实验饲料厂中制备实验饮食。饮食以糊状物制备，并使用布勒双螺杆挤出机产生为挤出粒料。在挤出之后，用在40℃下加热的油和植酸酶(var400)的混合物涂覆粒料。在饲喂试验期间，实验饮食保持在4℃下。
理论计算值为总磷0.821％，植酸盐磷0.326％和11.5g/Kg植酸(根据Allix 3软件，A-systems公司(A-systems)，法国)。
鱼和养殖设施
将240只单性(均为雌性)虹鳟鱼(IBW＝46.3±1.2g)随机分布在12个水箱(250L；每个水箱20条鱼)中。
表13.基础饮食的详细组成(％)和计算的饮食中的粗蛋白/脂质
饲喂
将动物饲喂91天。鳟鱼在一周内每天两次(上午和下午)手工饲喂，并且周末由自动饲喂器进行饲喂。所有鱼都根据向维持在相同水温下的鱼饲喂的类似商业饮食的饲喂配给表饲喂。整个实验中的饲料消耗量和体重在图2中示出。饲料消耗量基于每周的实际摄取量和2周时间段内鱼的生长(比生长速率)以百分比计算。在整个实验饲喂中，饲料消耗量范围为2.31％至1.65％(图2)。
动物园技术参数
在试验开始时对鱼进行单独称重，并且在所考虑的每个时间点处对鱼进行批量称重之后确定每个一式三份水箱中鱼的平均体重。每两周一次记录批量体重。在处理之前，对鱼进行麻醉(0.08g/L三卡因甲磺酸盐；MS222；法玛克公司，奥沃尔哈拉，挪威(PharmaQLtd.，Overhalla，Norway))。
测量/计算以下动物园技术参数：
-存活率(％)
-性能
-初始体重，IBW(g)
-最终体重，FBW(g)
-体重增益，WG，作为FBW-IBW(g)
-比生长速率，SGR，作为{100*(ln(FBW/IBW)]}*d
-饲料利用率
-饲料转化率，FCR，作为饲料摄取量*生物质增益
磷全身存留率
在试验开始和结束时，对整条鱼进行采样并在-80℃下冷冻，以分析磷全身存留率。
血浆
在实验饲喂试验结束时，使用80mg MS222·L
使用肝素锂4.5mL注射器采样4mL血液，并将其保持在冰中，直至进一步处理。将血液样品离心(10min，2000g，4℃)，并且将1.5mL血浆等分试样冷冻(-20℃)，直至分析。单独分析样品。
单独分析样品，但出于统计目的，每个水箱都被视为一个重复。
表观消化率系数(ADC)
在实验饲喂开始之后77天和91天进行两个不同的粪便收集，以确定磷ADC。将动物轻度麻醉(80mg MS222·L
表观消化率系数(ADC)按照NRC(2001)所概述在干物质基础上计算：
ADC(％)＝100-[(CMf/CMe)x(CNe/CNf)]x 100
CMf＝饲料中标记的浓度；CMe＝粪便中标记的浓度；
CNf＝饲料中营养物质的浓度；CNe＝粪便中营养物质的浓度磷释放代表由于补充植酸酶而释放的磷的％。其如下计算：
(饲料的总P％x磷ADCPHY X)-(饲料的总P％*磷ADC测试)
其中总P％是饮食中磷的总百分比；ADCPHY X是给定植酸酶剂量下磷的消化率；并且磷ADC测试是没有补充植酸酶的测试饮食的磷消化率。
骨磷存留率
在试验开始和结束时，在每个水箱5条鱼中采样3-4cm切片(参见图3)(每次处理15条鱼)并在-80℃下冷冻。去除皮肤和肉以仅进一步处理用于分析的骨。
分析和计算
根据标准方法(VDLUFA 1976；AOAC，2006)分析饲料、排泄物、血浆、整条鱼和脊椎样品中的营养成分。
根据Zhai等人，2001，通过酶实验室DNP研发解决方案中心(凯泽劳斯特(Kaiseraugst))使用钼酸铵的酶法通过计算总P与游离P之间的差异来测量饲料中的植酸盐-P。
通过氮分析仪(FP 528，力可公司，圣约瑟夫，美国(LECO，St.Joseph，USA))使用杜马斯法(CP＝N*6.25)确定粗蛋白。
使用绝热式热量计(C 2000basic，艾卡公司，施陶芬，德国(IKA，Staufen，Germany))进行总能量测量。
在硫酸矿化之后，根据DIN EN ISO 11885：1997(DIN EN ISO 1998；AOAC，2006)通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES，5100 Dual View，安捷伦公司)确定饲料、整条鱼、脊椎和排泄物中的钙、磷、锌和氧化钇浓度。在同一台仪器上通过直接进样对冷冻水样品进行磷的水分析。
使用相应的罗氏诊断试剂盒通过生物医学自动化COBAS 6000(罗氏诊断公司，CH-4202室，巴塞尔(Roche Diagnostics，CH-4202Basel))确定P浓度的血浆浓度。
通过盐酸进行热酸蚀刻，接着用石油醚连续提取并用重量法确定来在外部公司Larebron进行饲料的脂质分析。
在德国BioPract有限责任公司(BioPract GmbH，Germany)根据ISO 30024：2009(Animal feeding stuffs-Determination of phytase activity[动物饲料-植酸酶活性的确定]，https：//www.iso.org/standard/45787.html)进行饮食中的植酸酶分析。
结果
表14示出了在BioPract有限责任公司处获得的分析结果。
表14.8个实验处理中的植酸酶含量。LOD＝低于检测水平。
鱼行为和水质量
在整个实验中没有记录到死亡，并且鱼很好地接受了所有的实验饮食。
性能
表15示出了91天实验饲喂时间段结束时的动物园技术参数。对照饮食显示最差的生长速率。补充植酸酶对生长有积极影响。这一趋势与剂量相关，并且补充1000FYT/Kg组生长显著高于对照组；类似地，补充2000和3000FYT/Kg酶的动物表现显著优于1000FYT/Kg。
在任何植酸酶包含水平下比生长速率和饲料转化率也显著改善，但与包含水平无关。
表15.鱼的存活率和生长性能(第0天至第91天)。
存活百分比是指整个试验持续时间；IBW：初始体重(g)；FBW：最终体重(g)t；SGR：比生长速率(％BW/天)；FCR：饲料转化率(按饲喂基础)。数据以平均值±SD(标准偏差)呈现/Sign.＝显著性；Ns：在处理之间未观察到显著差异。
全身磷存留率
表16示出了矿物质和蛋白质的全身存留率(摄入量的％)。在任何补充剂量下，全身锌和蛋白质存留率都有显著改善。当以1000和3000FYT/Kg补充植酸酶时，磷显著改善。意外地，以2000FYT/Kg包含植酸酶时显示中等应答。
表16.磷、锌、钙和蛋白质全身存留率(摄入量的％；第0天至第91天)。
数据以平均值±SD(标准偏差；n＝3)呈现。Sign.＝显著性；Ns：在处理之间未观察到显著差异。
血浆中的磷含量
血浆磷浓度随植酸酶的补充而显著增加。与对照饮食相比，补充外源酶使循环磷增加了1.99、2.3和2.44倍。
表观消化率系数(ADC)
干物质、蛋白质、能量和矿物质(磷、钙和锌)的粪便消化率在表17中总结。
数据显示，补充1000FYT/kg的植酸酶显著改善了粪便干物质、能量消化率以及粪便钙、磷和锌消化率。与未补充对照组相比，植酸酶1000FYT/kg、植酸酶2000FYT/kg和植酸酶3000FYT/kg的磷消化率分别增加了60.1％、82.9％和89.7％。因此，基于以上结果，本发明的一方面涉及饲喂鱼的方法，该方法包括诸如以500至5000FYT/kg的量添加如本文定义的植酸酶。在典型实施例中，植酸酶的量是从500至3000FYT/kg，诸如750至3000FYT/kg，诸如1000至3000FYT/kg。
表17.表观消化率系数(％)和磷释放(Phos.Rel.；％磷/kg饲料)。
/>
纽曼-科伊尔斯检验：行内不共享共同上标的平均值显著不同(p<0.05)。消化率以n＝3个水箱/处理来计算。
骨磷存留率
磷的存留率在表18中总结。在脊椎中，与阴性对照相比，灰分百分比和磷浓度随着植酸酶掺入而显著增加。
表18.实验饲喂91天之后鱼的脊椎中灰分和磷的存留率(DM的％)。
纽曼-科伊尔斯检验：行内不共享共同上标的平均值显著不同(p<0.05)。消化率以n＝3个水箱/处理来计算。
结论
向参考饮食补充1000、2000和3000FYT/kg植酸酶(0.74总磷)在实验饲喂91天之后显示生长、血浆磷和血浆表观消化率的剂量依赖性和显著增加。包含任何水平的植酸酶都会增加动物全身和脊椎中磷的存留率。
本发明的植酸酶有效地从植酸盐中释放磷，并且本发明部分涉及当鲑鱼饮食中的鱼粉被富含这种抗营养因子的蔬菜原材料替代时植酸酶的使用。
实例11：分级补充水平的植酸酶对饲喂富含植物蛋白的饮食的欧洲海鲈鱼(欧洲鲈(Dicentrarchus labrax))的生长性能、全身营养存留率和营养消化率的影响
该试验包括5个饮食处理：具有0.7％的总饮食磷(P)水平的对照饮食(CTRL)，其中P的显著部分以植酸盐结合的P(0.3％)的形式存在。其他三种基于CTRL配方的饮食以分级剂量(500、1000和2000FTY/kg饲料)补充植酸酶(var400)(饮食PHY500、PHY1000、PHY2000)。植酸酶通过包衣在挤出后施加。同样基于CTRL配方的第五种饮食(MCP)补充了磷酸一钙，至0.9％的总P水平，并且可用P水平高于该物种的已知需求。所有饮食均为等氮、等脂和等能量的。在94天期间向四组具有57.6±3.8g平均初始体重的38条欧洲海鲈鱼饲喂五种实验饮食之一，水温曲线为22.1℃±0.4℃。
表19.实验饮食配方和测量的植酸酶活性
结果
在试验结束时，最终体重(FBW)的范围在142.0克与156.5克之间。来自最佳处理(PHY2000)的鱼显示初始体重(IBW)增加了2.7倍。在第94天，所有补充饮食产生的FBW和SGR显著高于饲喂CTRL饮食的那些(P<0.05)。饲喂PHY500、PHY1000、PHY2000和MCP饮食的鱼与饲喂CTRL饮食的那些相比显示显著更低的FCR(P<0.05)。对于全身磷存留率和磷表观消化率，CTRL处理始终与各种处理中显著最低的值相关联。较高的植酸酶补充剂量(1000和2000FTY/kg)导致全身P含量显著增加(P<0.05)。饲喂MCP饮食的鱼与饲喂CTRL饮食的那些相比显示显著更高的全身P存留率，但是与饲喂PHY1000和PHY2000饮食的那些相比显著更低。总P和植酸盐-P消化率的显著增强与增加植酸酶饮食剂量相关联，饮食处理PHY2000的P消化率显著高于PHY1000，并且后者的P消化率显著高于PHY500。另外，植酸酶补充剂量的增加(0、500、1000和2000FTY/kg)也与全身磷存留率的逐步增加呈正相关。因此，基于以上结果，本发明的一方面涉及饲喂鱼的方法，该方法包括诸如以250至5000FYT/kg的量添加如本文定义的植酸酶。在典型实施例中，植酸酶的量是从300至4000FYT/kg，诸如500至3000FYT/kg。
表20.饲喂94天(试验结束)之后的生长性能。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
表21.全身营养存留率(摄取量的％)。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
表22.营养物质的表观消化率系数(AD℃，％)。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
结论
500至5000FTY/kg饲料、诸如500至3000FTY/kg、诸如500至2500FTY/kg、诸如500至2000FTY/kg、诸如1000至2000FTY/kg饲料补充剂量的植酸酶是增强饲喂富含植物蛋白的饮食的欧洲海鲈鱼的生长速率、磷消化率、全身磷存留率和降低FCR的有效策略。
实例12：植酸酶对饲喂富含植物蛋白的饮食的尼罗罗非鱼(尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))的生长性能、全身营养存留率和营养消化率的影响
该试验包括5个饮食处理：具有0.96％的总饮食磷(P)水平的对照饮食(CTRL)，其中P的显著部分以植酸盐结合的P(0.6％)的形式存在。其他三种基于CTRL配方的饮食以分级剂量(500、1000和2000FTY/kg饲料)补充植酸酶(var400)(饮食PHY500、PHY1000、PHY2000)。植酸酶通过包衣在挤出后施加。同样基于CTRL配方的第五种饮食(DCP)补充了磷酸二钙，至1.2％的总P水平，并且可用P水平高于该物种的已知需求。所有饮食均为等氮、等脂和等能量的。在93天期间向四组具有39.5±1.4g平均初始体重的30条罗非鱼饲喂五种实验饮食之一，水温曲线为25.5℃±0.4℃。
表23.实验饮食配方
1
2
结果
在试验结束时，来自最佳处理(PHY2000)的鱼显示初始体重增加了4.7倍。饲喂CTRL饮食的鱼与饲喂所有其他饮食的那些相比显示显著更低的FBW、SGR、PER，和更高的FCR(P＜0.05)。此外，饲喂PHY1000、PHY2000和DCP饮食的鱼与饲喂PHY500和CTRL饮食的那些相比显示显著更高的FBW和SGR(P＜0.05)。饲喂PHY2000饮食的鱼与饲喂PHY500饮食的那些相比显示显著更低的FCR(P＜0.05)。饲料摄取量(FI)在每天1.75％与1.82％ABW之间变化，并且不受饮食处理的显著影响(P>0.05)。饲喂CTRL饮食的鱼与饲喂所有其他饮食的那些相比显示显著更低的全身磷(P)含量(P<0.05)。植酸酶补充剂量分级增加导致全身P含量显著增加(P<0.05)。饮食植酸酶分级增加导致全身P存留率显著增加(P<0.05)。饲喂DCP饮食的鱼与饲喂CTRL和PHY500饮食的那些相比显示显著更高的全身P存留率(P<0.05)，但是与饲喂PHY1000和PHY2000饮食的那些相比显著更低(P<0.05)。饲喂CTRL饮食的鱼与饲喂所有其他饮食的那些相比显示显著更低的P消化率(P<0.05)。P消化率的显著增强(P<0.05)与增加植酸酶饮食剂量相关联，饮食处理PHY2000的P消化率显著高于PHY1000(P<0.05)，并且后者的P消化率显著高于PHY500(P<0.05)。DCP饮食的磷消化率显著低于饮食PHY2000的磷消化率(P<0.05)，并且显著高于PHY500和CTRL饮食的磷消化率(P<0.05)。
表24.饲喂93天(试验结束)之后的生长性能。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
表25.全身营养存留率(摄取量的％)
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P＜0.05)。
表26.营养物质的表观消化率系数(ADC，％)。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
结论
500、1000和2000FTY/kg饲料，诸如500至200FYT/kg补充剂量的植酸酶是增强饲喂富含植物蛋白的饮食的尼罗罗非鱼的生长速率、磷消化率、全身磷存留率和降低FCR的有效策略。
实例13：分级补充水平的植酸酶对饲喂富含植物蛋白的饮食的金头鲷(金头鲷(Sparus aurata))的生长性能、全身营养存留率和营养消化率的影响
该试验包括5个饮食处理：具有0.78％的总饮食磷(P)水平的对照饮食(CTRL)，其中P的显著部分以植酸盐结合的P(0.4％)的形式存在。其他三种基于CTRL配方的饮食以分级剂量(500、1000和2000FTY/kg饲料)补充植酸酶(var400)(饮食PHY500、PHY1000、PHY2000)。植酸酶通过包衣在挤出后施加。同样基于CTRL配方的第五种饮食(MCP)补充了磷酸一钙，至1.1％的总P水平，并且可用P水平高于该物种的已知需求。所有饮食均为等氮、等脂和等能量的。在94天期间向四组具有55.3±4.1g平均初始体重的37条金头鲷饲喂五种实验饮食之一，水温曲线为22.4℃±0.2℃。
表27.实验饮食配方。
结果
在试验结束时，最终体重(FBW)的范围在142.8克与157.5克之间。具有最高体重增益的鱼显示其初始体重(IBW)增加了2.8倍。比生长速率(SGR)在1.01与1.11％/天之间变化。在第94天，所有补充饮食产生的FBW和SGR显著高于饲喂CTRL饮食的那些(P<0.05)。饲喂PHY500、PHY1000、PHY2000和MCP饮食的鱼与饲喂CTRL饮食的那些相比显示显著更低的FCR(P<0.05)。对于全身磷存留率和磷表观消化率，CTRL处理始终与各种处理中显著最低的值相关联。与CTRL和MCP处理两者相比，较高的植酸酶补充剂量(1000和2000FTY/kg)产生显著的全身P存留率(P<0.05)。总P和植酸盐-P消化率的显著增强与增加植酸酶饮食剂量相关联，饮食处理PHY2000的P消化率显著高于PHY500(P<0.05)。另外，植酸酶补充剂量的增加(0、500、1000和2000FTY/kg)也与全身磷存留率的增加呈正相关。
表28.饲喂94天之后的生长性能。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
表29.全身营养和能量存留率(摄取量的％)。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P＜0.05)。
表30.营养物质的表观消化率系数(ADC，％)。
值是平均值±标准偏差(n＝4)。
行内具有不同上标的值代表统计差异(P<0.05)。
结论
500、1000和2000FTY/kg饲料补充剂量的植酸酶是增强生长速率和磷消化率的有效策略。1000和2000FTY/kg饲料补充剂量的植酸酶显著增加饲喂富含植物蛋白的饮食的金头鲷的全身磷存留率。
实例14：植酸酶和蛋白酶在肉鸡中的功效
研究了使用具有1，500FYT/kg植酸酶(var400)和30，000U/kg蛋白酶(
表31.处理名称
1
2
表32.起始期和生长期实验饮食
/>
结果
表33.从孵化至孵化后第28天饲喂标准Ca和粗蛋白或低Ca和高粗蛋白饮食(具有或没有蛋白酶)以及额外1,000U/kg植酸酶的肉鸡的生长性能
表34.从孵化至孵化后第28天饲喂标准Ca和粗蛋白或低Ca和高粗蛋白饮食(具有或没有蛋白酶)以及额外1,000U/kg植酸酶的肉鸡的表观营养消化率
/>
结论
向肉鸡饲喂蛋白酶和额外1，000FYT/kg植酸酶的组合使蛋白质消化率增加了0.7％至1.6％，蛋白质存留率增加了0.9％至4.4％，并且能量存留率增加了0.6％至1.3％。这使得体重增益(BWG)提高了2.3％或3.7％并且饲料转化率提高了4.6％或2.8％。