一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及功能材料领域，特别是涉及一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球及其制备方法与应用。

背景技术

肺癌是全球最常见最致命的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有新诊断肺癌的85％。肺癌首选治疗方案为手术切除，但由于60％肺癌患者确诊时已进入进展期，手术切除率不及半数，而传统的放、化疗手段有效率较低。目前，传统的铂类化疗方案的研究和临床应用进入了瓶颈期，单纯的化疗有效率低，随着治疗周期的增长，毒副作用不断累积。除传统治疗手段外，还有介入治疗，免疫治疗等新兴的治疗手段，但均有各自的不足与局限性。

近年来，肺癌靶向治疗发展迅速，己有相当数量的靶向抑制剂上市，用于临床治疗研究，但现有技术中，此类靶向制剂在取得良好临床效果的同时也存在着一些不可避免的问题，例如患者长期使用EGFR-TKI类药物后均会产生耐药性，同样针对ALK基因的靶向药物也具有耐药性等。

因此，如何提供一种新型靶向制剂系统用于肺癌的治疗是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，为抗肺癌药物的制备提供新的思路。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)大豆分离蛋白微球的制备：

将大豆分离蛋白溶于缓冲溶液中，调节pH＝10，搅拌反应6h后逐滴加入溴酸钠溶液，避光继续搅拌反应60min，然后利用煮好的(蒸馏水煮沸30min)透析袋透析三天，再将透析袋中所得溶液冷冻干燥，即得大豆分离蛋白微球；

(2)偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球的制备：

将所述大豆分离蛋白微球溶于有机溶剂中超声分散，再边搅拌边向其中滴入羟基喜树碱溶液后，依次进行高压均质、旋转蒸发、冷冻干燥，得到偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球；

(3)绿原酸偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球的制备：

将所述偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球加入绿原酸甲醇溶液中，匀浆搅拌后依次进行高压均质、旋转蒸发、冷冻干燥，即得绿原酸偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球。

有益效果：大豆分离蛋白作为FDA批准的GRAS级辅料，由于其成本低、生物相容性良好，是一种理想的微球载体材料。其作为一种天然的两亲性分子材料，与其他蛋白质相比，具有较大比例的亲水性氨基酸，通过适当氧化剂和偶联剂作用，能够包裹疏水性药物，组装成稳定的微球粒，适合包载疏水性药物分子。

绿原酸是一种生物活性多酚类化合物，主要存在于植物中，具有效抗病毒，抗真菌抗氧化和抗肿瘤特性。在严格控制抗菌药物和多药耐药盛行的今天，广泛应用于呼吸系统感染性疾病。另外，绿原酸可以被肺组织大量摄取，在肺组织浓度高，且肺癌组织中具有绿原酸受体，经过绿原酸修饰的微球具有良好的肺靶向性，为肺癌化疗药物靶向治疗提供了方向。

优选的，步骤(1)中所述缓冲溶液为Na

所述溴酸钠溶液的质量浓度为1.8％，且滴加速度为5-60滴/min；

所述大豆分离蛋白、缓冲溶液和溴酸钠溶液的添加量之比为50mg:20mL:5mL；

所述调节pH为利用浓度为1mol/L的碳酸钠进行调节；

所述透析袋分子量为3500，所述透析介质为蒸馏水。

优选的，步骤(1)中所述搅拌速率为100r/min；

所述继续搅拌速率为200r/min；

所述冷冻干燥具体包括以下步骤：

将透析袋中所得溶液加入到冻干瓶中，在-40℃条件下预冻2小时，之后在-64℃条件下冷冻干燥48小时。

优选的，步骤(2)中所述有机溶剂为氯仿和无水乙醇的混合溶剂，其中氯仿和无水乙醇的体积比为7:3；

所述大豆分离蛋白微球在所述有机溶剂中的浓度为50-200mg/mL；

所述羟基喜树碱溶液浓度为2.3mg/mL。

优选的，步骤(2)中所述超声功率为5kW，超声时间为5-10min；

所述搅拌速率为200r/min，搅拌时间为50min；

所述高压均质压力为3kPa；

所述冷冻干燥具体包括以下步骤：

将旋转蒸发后得到的水分散液在-40℃的条件下预冻2小时，之后在-60℃的条件下冷冻干燥64小时。

优选的，步骤(3)中所述绿原酸溶液为浓度166.9mg/400mL的绿原酸甲醇溶液。

优选的，步骤(3)中所述匀浆搅拌速率为200r/min，匀浆时间为50min；

所述冷冻干燥为在-10℃下冷冻干燥64小时。

优选的，步骤(2)和(3)中所述旋转蒸发转速为80-940r/min。

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法制备得到的羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球。

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球在抗肺部肿瘤药物的制备中的应用。

本发明公开了以下技术效果：本发明提供的靶向微球具有能够延长血液循环时间、改善药物溶解性、改变药物的给药途径、控制药物的释放等优点，并能通过增强的渗透性和保留(EPR)效应积聚于肿瘤组织中，其作为肿瘤等重大疾病的新治疗手段，在提高药效及降低毒性方面具有独特性质和优势。其次，本发明中的大豆分离蛋白由于其良好生物相容性、无毒、体内生物降解性和自组装能力，为微球药物输送系统的理想载体。本发明中使用大豆分离蛋白与其他蛋白质相比，具有较大比例的亲水性氨基酸，这使其能够包裹绿原酸并组装成稳定的微球，进而能够为肺癌的靶向治疗提供新的途径。此外，本发明提供的制备方法简便，利于放大生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1所得靶向微球的粒径分布图；

图2为实施例1所得靶向微球Zeta点位图；

图3为实施例1所得靶向微球的透射电镜图；

图4为实施例1所得靶向微球的存放稳定性及包封率示意图；

其中A为粒径变化图，B为包封率变化图；

图5为实施例1所得靶向微球体外释放率变化图；

图6为羟基喜树碱、药物-大豆分离蛋白、实施例1所得CG-SPI-HPs处理A549细胞后细胞存活率示意图；

图7为实施例1所得CG-SPI-HP的生物组织分布影像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)空白微球的制备：大豆分离蛋白(SPI)微球

称取SPI 50mg，将其溶于20mL Na

将分子量为3500的透析袋用沸水煮30min，然后将上述反应溶液加入到煮好的透析袋中，以蒸馏水为透析介质，透析三天。将透析袋中的溶液加入到冻干瓶中，在-40℃条件下预冻2小时，然后在-64℃条件下冷冻干燥48小时，得到大豆分离蛋白(SPI)微球冻干粉86.89mg；

(2)制备偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球(SPI-HPs)

取步骤(1)中所得SPI微球50mg溶于1mL含有氯仿和无水乙醇的混合有机溶剂中，然后以5KW的超声功率超声5-10min，其中，该混合有机溶剂中氯仿与无水乙醇的体积比为7:3，然后将浓度为2.3mg/mL的羟基喜树碱溶液滴加入上述含有大豆分离蛋白的溶液中，期间伴随高速匀浆器以200r/min的速率高速搅拌匀浆50min。将匀浆后的呈乳化状态的体系，在3kPa压力下进行高压均质，得到半透明呈现淡黄色乳光的均一体系，利用旋转蒸发在80r/min转速下除去体系中的有机溶剂(乙醇和氯仿)，将得到的水分散液在-40℃的条件下预冻2小时，之后在-60℃的条件下冷冻干燥64小时，得到SPI-HPs119.88mg；

(3)制备绿原酸偶联大豆分离蛋白-羟基喜树碱微球(GC-SPI-HPs)

称取166.9mg CG溶于400mL甲醇中，然后将步骤(2)中所得SPI-HPs冷冻干燥物加入该溶液中，高速匀浆器以200r/min的速率高速搅拌匀浆50min，得到乳化状态体系，然后高压均质，80-940r/min转速旋转蒸发除去甲醇，产物在-10℃的条件下冷冻干燥64小时，得到产物CG-SPI-HPs 169.66mg。

所得产物CG-SPI-HPs的粒径分布图如图1所示，Zeta点位图如图2所示，透射电镜图如图3所示。

将实施例1中的技术方案重复实施三次，对三次所得产物分别进行检测，检测结果见表1：

表1

实施例2-4

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(1)中第一产物滴加至溴酸钠溶液中的速度依次为每滴3秒、每滴6秒、每滴12秒。

不同滴加速率对微球性质的影响如下表2：

表2：

实施例5-8

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中旋转蒸发转速依次为180r/min、480r/min、760r/min、940r/min。

不同转速对微球性质的影响如下表3：

表3：

实施例9-10

一种羟基喜树碱恶性肿瘤靶向微球的制备方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中大豆分离蛋白微球在有机溶剂中的浓度依次为120mg/mL、200mg/mL。不同大豆分离蛋白微球浓度对微球性质的影响见下表4：

表4：

技术效果

1.存放稳定性和包封率

存放稳定性和包封率

按照最佳制备工艺制备所得产品用纯净水稀释10倍后，于4℃下储存，分别于存储后0,1,2,6,12,24,48h时测定包封率及粒径，每个时间点平行设置三份样品。具体结果参考图4，其中粒径随时间变化图为图4A，包封率随时间变化图为图4B。

2.体外释放：

37℃含有0.2％吐温-80的去离子水中测试了产品体外释放动力学。参考图5，结果表明，释放是双相的，其特征是在最初的8小时内快速释放约20％的药物，然后进入第二阶段缓慢释放，在24h后DM1累积释放量约40％。由于产品具有核-壳结构，在制备过程中，大豆分离蛋白首先形成核，然后缓慢吸附羟基喜树碱，形成一层又一层的壳。因此，药物的初始快速释放可能是由于壳中或核-壳界面处的药物引起的，而慢速药物释放阶段可能是处于产品疏水核内物理截留的药物。

3.体外抗肿瘤活性：

羟基喜树碱、药物-大豆分离蛋白、实施例1所得CG-SPI-HPs评价

A549细胞于1972年从肺癌患者体内分离得到，为人非小细胞肺癌细胞系，被广泛的用于肺癌治疗药物研究。

为了评体外抗肿瘤活性，本发明采用cck-8显色法考察其对A549人类肺癌细胞的增长抑制情况。实验中游离HP和微球药物浓度范围均为1x10

4.CG-SPI-HP的肿瘤靶向效率及生物组织分布

为了评微球制剂在活体动物中的分布情况，按照最佳制备工艺制备了包裹荧光物质IR-780的微球制剂:IR-780-loaded CG-SPI-HPs，静脉注射游离IR-780(20ug)和IR-780-微球药物(20ug IR-780equiv.)60h后处死小鼠，取出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)以及肿瘤组织进行离体成像，并用整合形态分析软件(Molecular Devices,CA,US)计算器官中的相对信号强度，进行半定量分析。

如图7所示，影像结果显示，在肿瘤中IR-780-loaded微球药物组的荧光强度是游离IR-780组的2.5倍，IR-780-loaded微球药物组的IR一荧光信号强度显示相比于游离IR-780,微球药物显著减少了其他中的积累，并增加了肺中的积累。

主要器官及肿瘤离体荧光强度(X104)见下表5：

表5

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。