一种洋葱伯克霍尔德氏菌及其应用

技术领域

本申请涉及一种洋葱伯克霍尔德氏菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

番茄，又称西红柿；属于茄科番茄属，为一年生草本植物。番茄果实中营养价值十分丰富，富含多种维生素、胡萝卜素、有机酸等营养物质，适合食用。因此，开发番茄促生长剂的需求一直存在。

另外，番茄青枯病是一种常见的病害。番茄青枯病由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)侵染植物引起，属于细菌性植物病害。这种病害能够危害番茄植株的根、茎、叶。患病植株会严重缺水枯萎，影响番茄果实的品质和产量，病害严重时甚至可以造成大面积的番茄减产与死亡，给从事番茄生产的农业工作者带来严重的经济损失。近年来，针对番茄青枯病生物防治的相关研究越来越成为主要的研究方向。

研究表明，一些无致病力的菌株可以在番茄的根、茎、叶等部位定殖，并挤占致病菌的生存空间、阻止高致病力菌株进入植物并增殖。若作物苗期时预先接种无致病力菌株作为“植物疫苗”，可以有效阻碍病原菌的侵入。同时无致病力菌株的定殖还会激发植物防御相关酶的活性，促进抗病化合物的合成、提高防卫相关基因的表达量等。因此，亟需一种既能促进番茄生长以及抵御青枯病害，又能对人体安全无毒的菌株。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请首先提供了一种洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)GZ，保藏号CGMCC No.25647。

本申请还提供一种菌剂，包括上述的洋葱伯克霍尔德氏菌、该洋葱伯克霍尔德氏菌的菌悬液、该洋葱伯克霍尔德氏菌的代谢物、该洋葱伯克霍尔德氏菌的发酵液、该洋葱伯克霍尔德氏菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的一种或多种混合物。

本申请还提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌或菌剂在促进番茄生长中的用途。

本申请还提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌或菌剂在抑制番茄青枯病中的用途；

本申请还提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌或菌剂在提高番茄CTD1、IAA9和/或ARF3的表达量的用途；

本申请还提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌或菌剂在抑制番茄黄褐孢霉菌和/或灰葡萄孢病原菌中的用途；

本申请还提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌或菌剂在诱导番茄体内的系统性抗性中的用途。

本申请突出的有益效果是同时解决了多个技术问题：

①本申请的洋葱伯克霍尔德氏菌对番茄具有显著的促生效果。菌株GZ不但提升了株高与根长，对植物的鲜重和干重、以及叶片中的可溶性糖和蛋白质含量均有提升。

②本申请的洋葱伯克霍尔德氏菌显著提高番茄生长素受体CTD1和生长素效应因子ARF3的表达量。

③本申请的洋葱伯克霍尔德氏菌对番茄青枯病的防治效果良好。施加菌株GZ后，不仅使番茄的病情明显减轻，疾病指数下降，而且菌株GZ可以进入番茄的茎部定殖，能够有效降低青枯雷尔氏菌在茎部的生长繁殖。另外，菌株GZ产生的抑菌物质(硝吡咯菌素)也对青枯雷尔氏菌起到了抑制作用。

④通过施加菌株GZ，有利于诱导植物的JA和ET途径，提升植物青枯雷尔氏菌的抵抗作用。同时，植物防御相关的基因表达也由菌株GZ的诱导提高。

⑤本申请的洋葱伯克霍尔德氏菌安全性可靠。

保藏说明

菌种名称：洋葱伯克霍尔德氏菌

拉丁名：Burkholderia cepacia

菌株编号：GZ

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年09月05日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25647。

附图说明

附图用来提供对本申请的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请，并不构成对本申请的限制。

图1：GZ对番茄促生能力的评估。

图2：BCESM引物扩增。

图3：BCESM序列比对结果。

图4：洋葱接种试验。

图5：GZ对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用。

图6：GZ对其他病原菌的抑制作用。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

菌株GZ具有产蛋白酶、铁载体的能力，同时具有一定的溶解磷和固氮能力。菌株GZ能够将难溶的磷酸盐降解成可溶性磷，促进植物的生长发育；生成的各种含氮的物质能够提升土壤中氮元素的含量，有利于植物的生长。与此同时菌株GZ还具有产生类生长素的能力。类生长素在植物体内能够起到与生长素相似的作用，促进植物的生长发育。上述能力均证明菌株GZ具有促进植物生长发育的潜在功能。

经过多代培养的菌株GZ对青枯菌的抗性保持稳定，证明其抗性不是偶然获得。通过基因组分析，证实菌株GZ基因组中含有合成抑菌物质硝吡咯菌素的基因簇基因PrnA，PrnB，PrnC，PrnD。这些基因位于质粒上，合成起始物质为色氨酸。

根据抑菌试验结果，菌株GZ对黄褐孢霉以及灰葡萄孢均具有抑制作用，对黄褐孢霉抑制效果一般，但对灰葡萄孢抑制效果明显；证明菌株GZ不仅可以抑制青枯病原菌，而且对真菌也有一定的抑制效果。

根据盆栽试验结果显示，菌株GZ对番茄青枯病的防治效果良好。施加菌株GZ后，茎部组织中青枯菌含量明显下降，番茄的病情明显减轻，病情指数下降，防治效果可达70％。

我们的研究结果显示单纯施用菌株GZ后，可以诱导番茄体内相关抗性基因的表达以及诱导植株体内的水杨酸信号途径及茉莉酸信号途径依赖的抗性反应。此外，施加菌株GZ后再接种青枯病原菌，我们的研究结果表明番茄体内诱导了更高水平的抗性反应，同样也激活了水杨酸信号途径和茉莉酸信号途径的相关基因，说明GZ可以诱导番茄体内的系统性抗性，且水杨酸信号途径和茉莉酸信号途径具有协同效应。

菌株GZ表现出明显促进植物生长能力。GZ的施用不但促进植物根和茎的伸长，还有利于植物生物量提升，增加了植物的鲜重和干重。施加菌株GZ后，番茄叶片中的可溶性糖和蛋白质含量提升，表明菌株GZ还有助于叶片中有机物的积累。此外，我们的研究结果显示菌株GZ能够促进植物的生长素信号途径的关键基因表达，施用GZ后，IAA9和ARF3的表达量明显提升。因此，菌株GZ不仅对番茄具有防治青枯病的效果，同时具有良好的促生效果。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)GZ，保藏号CGMCCNo.25647的分离鉴定

发明人从贵州土壤中分离出一株洋葱伯克霍尔德氏菌，经过氨基酸和核苷酸共线性分析，确定该菌株属于洋葱伯克霍尔德氏菌。同时，将筛选并纯化后的GZ单菌落利用平板划线法在NA培养基制得的平板上培养，发现菌落呈圆型，颜色为黄色。菌落表面光滑、不透明、边缘整齐，菌落周围有一圈颜色较深的黄色，表明该细菌可产生黄色色素。经过染色鉴定，该细菌为革兰氏阴性菌，不产生荧光。将菌株GZ于28℃条件下培养24-48h，并依据《常见细菌系统鉴定手册》中的方法对各项生理生化特性进行检测。结果如下表1：

表1菌株GZ的生理生化特征

实施例2 GZ对番茄促生能力评估

1、促生能力的鉴定

(1)纤维素酶：将菌株GZ接种到刚果红鉴定培养基上，28℃下培养48h。若菌落周围产生透明圈，则证明该菌株能产生纤维素酶。

(2)蛋白酶：将菌株GZ接种到酪蛋白培养基上，28℃下培养48h。若菌落周围产生透明圈，则证明该菌株能产生蛋白酶。

(3)铁载体：将菌株GZ接种到CAS固体培养基上，28℃下培养48h。若菌落周围产生透明圈，则证明该菌株能产生铁载体。

(4)溶解磷能力：将菌株GZ接种到Pikovskaya培养基上，28℃下培养48h。若菌落周围产生透明圈，则证明该菌株具有溶解磷酸盐的能力。

(5)固氮能力：将菌株GZ接种到Jensen’s N free培养基上，28℃下培养48h。若能在平板上正常生长，则证明该菌株能利用空气中的氮气，具有固氮能力。

2、结果：纤维素酶检测平板上无明显现象(A)，表明菌株GZ无产生纤维素酶的能力。在蛋白酶和铁载体检测平板上，出现了明显的透明圈(B，D)，证明菌株GZ能够产生蛋白酶与铁载体。在溶磷检测平板上，菌株GZ的周围也生成了较小的透明圈(C)，证明菌株GZ具有较弱的溶解磷酸盐能力。不含氮元素的培养基上，菌株GZ也形成了较小的菌落且有微弱透明圈形成(E)，证明菌株GZ具有一定的固氮能力(见图1)。

实施例3菌株GZ的安全性检测

研究表明与人体致病相关的因子为洋葱伯克霍尔德氏菌致病因子(B.cepaciaepidemic strain marker，BCESM)毒力基因。发明人采用PCR试验，结果显示未检测到该菌株有人体致病相关的洋葱伯克霍尔德氏菌致病因子(BCESM)毒力基因(见图2)。

为了进一步验证其可靠性，把BCESM毒力基因序列与菌株GZ全基因组序列进行比对，比对结果未发现相似序列(见图3)，证明菌株GZ的全基因组中不含有对人有致病作用的BCESM毒力基因，作为生防菌不具有致病性。

此外，我们该菌株接种到洋葱中，检测其对洋葱的致病性。我们将较高浓度，OD600＝0.5的菌株GZ的菌液注射到洋葱中。72h后，对照组与实验组的洋葱几乎无任何差别，洋葱组织完好，未发现有腐烂变色等现象(见图4)。实验结果表明注射菌株GZ不会对洋葱组织造成影响，该菌株不是洋葱的致病菌。

实施例4菌株GZ的抑菌能力检测

为了验证筛选的菌株是否具有稳定的对青枯雷尔氏菌的拮抗作用，将分离得到的菌株GZ连续培养三代，并重新接种到含有青枯雷尔氏菌的平板上，其结果如图5所示。在接种菌株GZ的周围可以明显观察一道明显的透明圈，表现对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用。证明菌株GZ对青枯雷尔氏菌的拮抗作用能够稳定遗传，排除了偶然获得的可能。

实施例5菌株GZ对其他病原菌的抑制作用

用平板试验进行检测。在本试验中选取了番茄叶霉菌的病原物，黄褐孢霉菌以及造成番茄灰霉病的病原物，灰葡萄孢。试验结果显示，在放置了黄褐孢霉菌的平板上，病原物几乎长满了整个平板，但是在滴加菌株GZ滤纸片周围出现了比较明显的抑菌圈，且滤纸片上以及滤纸片周围有菌株GZ形成的菌落(A)。在放置了灰葡萄孢的平板上，除了带菌的菌饼周围长有少量真菌菌丝，平板的其余地方没有真菌生长(B)。不放置菌株GZ的对照平板上，灰葡萄孢在菌饼周围形成了明显的菌丝(C)。我们的试验结果表明GZ对黄褐孢霉菌以及灰葡萄孢病原菌都有抑制作用(见图6)。

总之，菌株GZ能够产生蛋白酶、铁载体，具有解磷能力和固氮能力，能产生类生长素，含有合成硝吡咯菌素的Prn相关基因。该细菌属于无致病性种，最适生长温度为32℃，最适pH为7.5。

该菌株有两条染色体和一个质粒，与其亲缘关系最近的菌种为洋葱伯克霍尔德氏菌和双向伯克霍尔德氏菌，经过氨基酸和核苷酸共线性分析，确定该菌株属于洋葱伯克霍尔德氏菌。

盆栽试验表明，施加菌株GZ后，番茄青枯病病情指数下降，病情减轻，防治效果达到70.21％。施用菌株GZ对番茄茎部中的青枯雷尔氏菌起到抑制效果。利用反转录荧光定量PCR结果显示菌株GZ会诱导番茄抗性相关基因PR1、PR5等的表达，同时对番茄水杨酸信号途径和茉莉酸信号途径相关基因表达有影响。

施加菌株GZ后的盆栽试验结果显示，番茄的株高、根长、鲜重、干重都有所提升，叶片中累积的有机物提升。证实菌株GZ具有促进番茄生长的效果，反转录荧光定量PCR结果显示菌株GZ可诱导番茄的生长素途径相关基因IAA9和ARF3表达。

洋葱接种试验无明显致病现象，且基因组中不存在BCESM毒力基因，表明菌株GZ不属于致病性种，其安全性得到验证，未来能够用于农作物防治病害。

显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。