检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌双基因的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体提供检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌双基因的试剂盒及方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是引起人类感染的主要病原体，感染后会引起皮肤和软组织感染(脓疱疮、毛囊炎和烫伤样皮肤综合征)，以及严重的全身性疾病，如菌血症、心内膜炎、骨髓炎、溶血性肺炎和中毒性休克综合征。

金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，目前已出现了具有多重耐药性的一种分离株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)。随着分离率和流行范围不断扩大，MRSA的感染和流行已成为一个严重的临床医学及公共卫生问题。由于MRSA的多耐药性，目前仅有万古霉素一种抗生素可以选用单独并能有效治疗，故进行耐药基因早期监测研究和诊断对MRSA的防控至关重要。

传统病原体实验室检测方法包括涂片、染色、培养和生化鉴定等，其所需时间较长，且操作繁琐、检测周期长。对于金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的诊断“金标准”药敏试验，往往需要耗费十二小时以上的时间才能有结果，不利于早期的监测和诊断。相比较于传统病原体鉴定方法，核酸检测技术具有特异性好、操作简便、灵敏度高等的优点，是早期临床检测诊断的利器。

现已开发出不少病原微生物核酸检测方法，如荧光定量PCR、普通PCR、LAMP等。但是这些方法均需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，这对于没有设备使用的地区或资源有限的环境来说总是难以实现的。

诊断的可靠性尤为重要，这受到很多因素的影响，假阴性结果会造成严重感染者死亡，病原体传播无法控制等后果。目前的大多数检测MRSA的方法仅证明了它们在单基因分析中的应用，极易产生假阴性结果。因多种类型的临床样本中通常含有较多的杂质，病原体含量较少，直接检测的难度较大，目前的检测方法主要检测的是病原体的临床分离株而非直接检测多种类型的临床样本。以上的检测方法可能无法准确分辨MRSA和SA，还需要进一步优化反应来准确判断检测结果。

发明内容

本发明提供一种基于RPA-技术结合CRISPR-Cas12a系统的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的双基因位点快速检测方法。

RPA是利用重组酶-引物复合物靶向模板，并使用DNA聚合酶通过链置换DNA合成扩增目标区域的技术。CRISPR Cas12a(LbCpf1)是Cas效应蛋白家族的成员，它可以在CrRNA的引导下检测DNA靶标的存在形成5'粘性末端，并具有Cas12a的非特异性单链DNA反式切割活性，能够通过引导CrRNA识别合适的DNA靶标来激活切割附近非靶向报告单链DNA的活动。

本发明要解决的技术问题是克服现有MRSA早期监测防控技术的缺陷和不足，如检测周期长、特异性和灵敏度低、操作复杂和需专业实验设备等的问题，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方法简单、快速、精准的双基因检测MRSA的方法。

第一方面，本发明提供RPA引物组合，所述RPA引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.3-4和SEQ ID NO.17-18所示。

其中，SEQ ID NO.3-4用于扩增femA基因，SEQ ID NO.17-18用于扩增mecA基因。

femA和mecA基因是金黄色葡萄球菌属中两个关键的基因。femA基因编码的酶在细菌细胞壁合成过程中起着重要作用，是SA的种属基因；而mecA基因则编码了甲氧西林耐药相关的蛋白质PBP2a，是MRSA的耐药基因。通过检测femA基因可了解到细菌对于β-内酰胺类抗生素的敏感性或耐药性。检测mecA基因能够确认是否存在MRSA，因为该基因是MRSA的一个特征标志。通过同时检测femA和mecA基因，能够快速而准确地区分SA和MRSA，并且同时检测两个基因通常比单基因检测更准确，它可以更有效地避免由部分基因降解、基因拷贝数差异和扩增错误引起的潜在假阴性结果。

因此，在单个实验中同时检测双基因的快速核酸检测诊断技术的发展将有助于提高检测的准确性、效率和临床适用性。这对于控制细菌感染的传播、预防耐药菌株的扩散以及确保患者得到有效治疗至关重要。

第二方面，本发明提供RPA-cas12a检测体系，所述RPA-cas12a检测体系中，包含上述RPA引物组合的扩增产物和如SEQ ID NO.19-20所示的crRNA序列。

在本发明提供的RPA-cas12a检测体系中，以终浓度计，所述RPA-cas12a检测体系中，Cas12a蛋白、crRNA序列和ssDNA reporter的比例为(1-2)：(1-5)：(2.5-5)。

由本发明实施例的结果可知，本发明建立的检测方法设计了效果好的CrRNA并且优化了Cas12a的检测体系，使本发明建立的方法灵敏度进一步提高。优选地，所述RPA-cas12a检测体系中，Cas12a蛋白、crRNA序列和ssDNA reporter的比例为1：1：5。

第三方面，本发明提供上述RPA引物组合或上述RPA-cas12a检测体系在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂、检测试纸或检测试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供一种检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有上述的RPA引物组合或上述的RPA-cas12a检测体系。

本发明还提供了上述RPA引物组合或上述的RPA-cas12a检测体系或上述检测试剂或试剂盒在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

更具体地，所述引物组合或所述RPA-cas12a检测体系或所述检测试剂或试剂盒用于区分金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

在本发明所提供的应用中，使用RPA-cas12a检测体系进行PCR反应，反应结束后采用侧向流动试纸条显示检测结果，试纸条至少存在一条测试线(T)出现条带，代表样品呈现阳性；试纸条仅控制线(C)出现条带，代表样品呈现阴性。

侧向流动试纸条由层析系统(根据混合物组分通过反应膜的运动差异进行分离)和抗体-抗原组成。标准横向流动分析有四个部分：样品垫，样品滴落的区域；结合垫，其上标记标签与生物识别元件结合；反应膜(通常为硝酸纤维素膜)，其上含有用于抗原-抗体相互作用的测试线和对照线，以及吸水垫。在核酸检测后可用侧向流动试纸条可视化检测结果，从而实现快速简便的检测。

在本发明所提供的应用中，样品类型为尿液、痰液或分泌物。

第五方面，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法，基于RPA-技术结合CRISPR-Cas12a系统，以种属基因femA和耐药基因mecA基因作为目标基因进行检测；所用RPA引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.17-18所示；所用crRNA的序列如SEQ ID NO.19-20所示；采用侧向流动试纸条显示检测结果，若femA基因与mecA基因的试纸条同时呈现阳性，则待测样品携带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果在于：

本发明首提供了一种双基因检测MRSA的RPA-CRISPR/Cas12a的方法，这种技术可作为早期监测诊断MRSA的检测方法。其最大优势为可进行双基因femA基因和mecA基因检测，避免假阳性或假阴性情况产生，并且可以有效区分SA和MRSA。

本发明建立的检测方法筛选到了效果最好的RPA扩增引物，使灵敏度进一步提高。在RPA扩增时引物2和引物5的组合和优化后的反应体系能在短时间内就有明显的扩增产物，有利于后续的CRISPR/Cas12a检测。

本发明建立的检测方法再一优势为检测时间短。目前传统的微生物培养方法大约需2-3天，而核酸检测的反应时间为1.5-2h，而本发明建立的方法：RPA 37℃扩增15min，再通过Cas12a检测37℃反应15min，共计30min。故本发明建立的检测方法更有利于早期快速检测MRSA，对早期MRSA防控非常重要。

本发明建立的检测方法检测灵敏度高。检测的最低限度为10copies/μL，与荧光定量PCR法的检测灵敏度相当。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的技术路线示意图。

图2为本发明的RPA-CRISPR/Cas12a法检测MRSA和SA的原理图。

图3为RPA引物筛选和反应条件优化。其中，(A)单重基因femA的RPA引物筛选。(B)单重基因mecA的RPA引物筛选。(C)双重基因femA和mecA的RPA扩增引物筛选。(D)双重基因RPA扩增的反应条件优化，其中，泳道135的模板是MRSA，泳道246的模板是SA。

图4为Cas12a检测体系的优化。其中，(A)Cas12a检测体系中Cas12a,CrRNA和ssDNAreporter的最适比例探索试纸条结果示意图，T线代表测试线，C线代表控制线，左边为femA，右边为mecA，NTC：no template control，无模板水对照。(B)Cas12a检测体系Cas12a,CrRNA和ssDNA reporter试纸条结果T线和C线的相对信号强度，用Image J对试纸条T线和C线的信号强度进行半定量，比较线和C线的信号强度比值。(C)Cas12a检测MRSA和SA的试纸条结果示意图。(D)Cas12a检测体系检测MRSA和SA的试纸条结果。T线和C线的相对信号强度。统计学分析采用Dunnet-T检验，n＝3个生物学重复，p<0.0001，标记为****。

图5为使用4种常见病原体测定RPA-CRISPR/Cas12a检测MRSA和SA的特异性。其中，(A)RPA-CRISPR/Cas12a检测不同病原体的试纸条结果示意图。T线代表测试线，C线代表控制线。左边为femA，右边为mecA。(B)RPA-CRISPR/Cas12a法试纸条检测不同病原体的相对信号强度示意图。使用ImageJ软件生成T线和C线的信号强度，比较T线和C线的信号强度比值。1.MRSA，2.SA，3.大肠杆菌，4.铜绿假单胞菌，5.鲍曼不动杆菌，6.肺炎克雷伯氏菌，7.MRSA+SA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动菌+肺炎克雷伯氏菌，8.MRSA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动菌+肺炎克雷伯氏菌，9.SA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌，10.大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌。NTC：no templatecontrol，无模板水对照。统计学分析采用Dunnet-T检验，n＝3个生物学重复，p<0.0001，标记为****。

图6为RPA-CRISPR/Cas12a法的灵敏度测定。用试纸条测定MRSA质粒(10

图7为荧光定量PCR法检测mecA基因。检测的循环数为35个循环。R

图8为RPA-CRISPR/Cas12a法检测临床样本。其中，(A)MRSA的临床样本试纸条检测示意图。临床样本包括4例尿液，6例痰液和8例分泌物。T线代表测试线，C线代表控制线。左边为femA，右边为mecA。(B)MRSA的临床样本试纸条检测的相对信号强度示意图。使用ImageJ软件生成T线和C线的信号强度，比较T线和C线的信号强度比值。(C)SA的临床样本试纸条检测示意图。临床样本包括3例分泌物。(D)SA的临床样本试纸条检测的相对信号强度示意图。使用ImageJ软件生成T线和C线的信号强度，比较T线和C线的信号强度比值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例的技术路线示意图如图1所示。RPA-CRISPR/Cas12a法检测MRSA和SA的流程图如图2所示。

实施例1 SA和MRSA的RPA检测方法的建立

(1)SA和MRSA基因组DNA的获取

SA和MRSA的标准菌株购于北纳生物。37℃培养12h后取1mL菌液，用细菌基因组DNA(捷倍斯)试剂盒提取基因组DNA，NanoDrop测浓度后保存于-20℃冰箱。

(2)RPA引物的设计

为了鉴定SA和MRSA，选择种属基因femA和耐药基因mecA基因作为目标基因，从GeneBank下载这两个目标基因的序列。根据RPA引物设计的原则，采用prime primer 5.0软件设计各靶基因的RPA反应引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。RPA引物序列如表1所示。

表1候选RPA引物信息

(3)RPA单基因扩增和引物的筛选

购买英国TwistAmp Basic试剂盒，按照试剂盒中优化好的反应体系和反应程序(表2)进行操作进行检测，比较引物和模板的匹配结果，筛选出较好的引物组合。

表2 RPA单基因扩增反应体系

RPA操作程序：将RPA试剂按照上述体系加到PCR反应管中，放置恒温水浴锅或PCR仪中，37℃反应30min进行恒温扩增。

(4)RPA双重基因扩增

RPA双基因扩增反应体系如表3所示。

表3 RPA双基因扩增反应体系

(5)RPA体系与反应条件的优化

进行反应时间的优化时保持其他体系成分不变，分别在恒温水浴锅或PCR仪反应10min,15min和20min，等待反应结束后通过2％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。

RPA单基因扩增时，femA2、femA5和mecA5的引物扩增效果较好，选择组合femA2-mecA5和femA5-mecA5进行双基因扩增。双基因扩增时引物组合femA2-mecA5的扩增效果较好，因此选择这对引物进行RPA反应条件的优化。测试了RPA反应的时间10min，15min和20min，在15min时已有较为明显的目的片段，因此将RPA的反应时间缩短为15min，优化后的RPA反应条件为37℃，15min(图3)。

实施例2CRISPR-Cas 12a系统检测femA和mecA基因的方法建立

(1)确定femA和mecA基因CRISPR-Cas核酸检测靶点

CRISPR-Cas12a系统的核酸检测目的基因序列5’端需要存在TTTN/TTN的PAM序列。

(2)设计合成各检测靶点的crRNA和单链报告基因

crRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。单链报告基因5’端用FAM荧光基团，3端由Biotin修饰。序列均由生工生物公司合成，见表4。

表4crRNA和单链报告基因序列信息

(3)CRISPR-Cas12a检测反应体系的优化

使用本发明建立的CRISPR-Cas12a核酸检测体系对RPA技术扩增出的MRSA的femA和mecA基因靶点分别进行检测，检测的Cas12a、CrRNA和ssDNA reporter终浓度分别设为100μM或200μM；100μM，200μM或500μM；500μM或250μM。它们的比例设为1：1：5，1：2：5，2：1：5，1：5：5，1：1：2.5，1：2：2.5，2：1：2.5和1：5：2.5，探索最合适的CRISPR-Cas12a检测反应体系。

检测的反应体系见表5。CRISPR-Cas12a核酸检测反应条件：恒温水浴锅或PCR仪中，37℃反应15min。反应结束后采用侧向流动试纸条(Milenia HybriDetect,Germany)显示检测结果。取20μL反应产物加入80μL试纸条检测缓冲液，混匀后放入试纸条静置3-5min，观察试纸条显示结果并拍照记录，结果见图4。

基于侧向流动试纸条中，质控线(C)与检测线(T)的强度对比来确定最佳的CRISPR-Cas12a检测反应体系，更具体地，采用ImageJ软件生成T线和C线的信号强度，比较T线和C线的信号强度比值。

表5 CRISPR-Cas12a预检测体系

(5)CRISPR-Cas12a检测体系优化后反应体系及操作程序

CRISPR-Cas12a检测体系优化后反应体系及操作程序见表6。

表6 CRISPR-Cas12a检测体系优化后反应体系

CRISPR-Cas12a检测反应条件：恒温水浴锅或PCR仪中，37℃反应15min。反应结束后采用侧向流动试纸条显示检测结果。取20μL反应产物加入80μL试纸条检测缓冲液，混匀后放入试纸条静置3-5min，观察试纸条显示结果并拍照记录。

CRISPR-Cas12a检测反应条件优化后的Cas12a，CrRNA和ssDNA reporter的最适比例为1：1：5。

CRISPR-Cas12a检测femA2-mecA5的RPA扩增产物能区分出MRSA和SA，其中MRSA检测的试纸条测试线处呈双阳性显色，SA的测试线呈单阳性显色，而阴性对照的测试线处无阳性显色。

实施例3检测体系特异性和灵敏度分析

(1)特异性测试

CRISPR/Cas12a检测反应体系的特异性，选取除MRSA和SA外的4种细菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌)进行特异性检测，以上细菌均购于北纳生物。另外还测试了该反应能否检测出多种细菌混合中的MRSA和SA，共设置了4种组合：组合1(MRSA+SA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌)，组合2(MRSA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌)，组合3(SA+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌)和组合4(大肠杆菌+铜绿假单胞菌+鲍曼不动杆菌+肺炎克雷伯氏菌)。

用细菌基因组DNA提取试剂盒(捷倍斯)，按照操作步骤进行处理，分别提取以上细菌的基因组DNA。再按优化后的RPA扩增方法和条件，进行RPA扩增。最后按照CRISPR/Cas12a检测方法和条件进行反应，反应结束后用试纸条进行检测。

CRISPR/Cas12a反应后试纸条检测结果见图5，结果显示，体系中含MRSA和SA能被检出，其余不能被检出，当MRSA和SA与其他细菌混合时也能被检测到，证明体系具有良好的特异性。

(2)灵敏度测试

以提取的MRSA和SA的基因组DNA为模板，RPA反应扩增femA和mecA基因，RPA扩增产物加入3％琼脂糖凝胶中进行电泳，切胶回收电泳分离的目的条带，使用切胶回收试剂盒对DNA片段进行纯化。将目的片段和载体pESI-blunt进行连接构建质粒标准品。将构建好的质粒标准品的浓度换算成copies/μL以10倍进行梯度稀释，共6个浓度梯度(10

检测结果见图6，结果显示该方法的检测最低限度为质粒稀释到10copies/μL。且它在10

此外，购买了商品化的金黄色葡萄球菌mecA基因染料法qPCR试剂盒(北京天净沙)进行荧光定量PCR检测，与RPA-CRISPR/Cas12a核酸试纸条检测法的灵敏度进行对比。反应体系为参照试剂盒说明书略有修改：5μL 2×SYBR qPCR Master Mix，1μL引物混合液和4μLDNA或超纯水，共10μL反应体系。反应程序为95℃5min；95℃10s,60℃40s,35cycle。

当mecA基因的浓度大于或等于10copies/μL时，各实验组的CT值均小于30，当mecA基因的浓度为1copies/μL时，3次重复中有1次检出(CT值为33.80)，2次未检出(无CT值)。当样本为水时，3次重复均未检出。荧光定量PCR法对mecA基因的稳定检出限为10copies/μL。结果见图7，结果表明，RPA-CRISPR/Cas12a核酸试纸条检测法在检测灵敏度上与荧光定量PCR相当。

实施例4临床样本验证检测体系

收集了21例临床已经过培养和药敏试验鉴定出MRSA或SA的临床样本，其中包括18例MRSA(其中包含4例尿液、6例痰液和8例分泌物)，3例SA(3例分泌物)。对不同类型的临床样本进行简单的前处理：①尿液样本：取1mL尿液于离心管中，4℃6000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，加入1mL无菌生理盐水溶解沉淀，盖紧管口。②痰液：挑起约1mL浓痰液至已标记的15mL离心管中，加入1mL的痰消化液(leagene)进行均质化处理，涡旋震荡20s，37℃静置20min。加入无菌PBS(pH 6.8左右)至约10mL，3000rpm离心15min后弃上清，加入1mLPBS重悬沉淀。③分泌物标本：在EP管中放入1mL无菌生理盐水，将带有分泌物的棉签插入离心管中并旋转，折断棉签盖紧管口，剧烈震荡以利于细菌的洗脱。

接着用微生物核酸提取试剂盒(BIOG)进行基因组DNA提取，RPA-cas12a检测体系和荧光定量PCR法对收集到的临床样本进行验证，结果见图8和表7、表8。

表7qPCR法检测临床样本的结果

注：/为未检测到Ct值。

对于上述21例临床样本，其中MRSA的检测结果RPA-CRISPR/Cas12a法与荧光定量PCR法的检测结果一致。由于荧光定量PCR法的试剂盒只能检测MRSA的mecA基因，而SA的样本中不含mecA基因，因此SA的样本检测结果均为阴性。

表8RPA-CRISPR/Cas12a法临床样本检测与药敏试验的符合度

使用RPA-CRISPR/Cas12a法与荧光定量PCR法检测临床样本时，对于药敏试验鉴定为MRSA的临床样本，结果均为阳性，与药敏试验结果一致，见表8；对于药敏试验鉴定为SA的临床样本，RPA-CRISPR/Cas12a法的结果为阳性，与药敏试验结果一致，见表8。对于药敏试验鉴定为SA的临床样本，荧光定量PCR法因只能检测mecA基因，无法检测出femA基因，结果为阴性。表8结果表明本发明建立的方法相比荧光定量PCR法能够有效区分MRSA和SA。

目前核酸检测的仪器较为昂贵，本发明建立的检测方法成本低，无需昂贵仪器设备，不受检测场地限制。本发明提供的检测方法只需水浴锅或恒温培养箱及小型离心机，成本较低，采用侧向流动试纸条快速可视化检测结果，不需专业规范的实验室，随处可进行检测实验。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。