基于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因多态性的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因多态性的试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌是目前所知能在人胃中生存的唯一微生物种类，它是一种呈螺旋弯曲状、单级多鞭毛、末端钝圆、微需氧菌的革兰氏阴性菌，生存于人体胃幽门部位。1994年，世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。有研究认为，90％左右的胃癌可归因于幽门螺杆菌的感染。然而，全球约50％的人感染了幽门螺杆菌，但是感染者终身罹患胃癌的风险为1-5％。目前已有的研究认为，主要影响因素是遗传背景、居住环境、饮食习惯和生活方式等。不过，这些因素显然不能很好地解释这一现象。近几年来，研究发现幽门螺杆菌的一些遗传变异显著增加了它与胃癌之间的关系。其中幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA中一个碱基的替换，会导致第171位氨基酸从丝氨酸变成亮氨酸(171S→L)，蛋白水解活性提高了3-5倍，与胃癌的发生显著相关。从机制上讲，幽门螺杆菌的171L变异会导致更严重的胃上皮损伤，让幽门螺杆菌更容易钻进胃上皮的深部，注入毒素和促炎的能力更强，还会促进宿主胃上皮细胞的DNA双链断裂。所以分型检测对于胃癌的防治有重要意义，171L型幽门螺杆菌感染者需要尽快开展根治性治疗。

目前幽门螺杆菌核酸检测主要涉及毒力分型核酸检测与特定位点的耐药基因检测，如幽门螺杆菌两种基因检测将其分为一型与二型：VacA基因和CagA基因；特定位点的耐药基因：大环内酯类和喹诺酮类药物(cagA、vacA)、克拉霉素(23S rRNA)、喹诺酮类药物(gyrA)、四环素(16S rRNA)、利福平(rpoB)、阿莫西林(pbp-1a)和甲硝哒唑(rdxA、frxA、frxA)等的突变进行检测。但是尚未出现关于高危型幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA SNP检测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA的基因多态性的试剂盒，该试剂盒采用特异性引物对和双标荧光探针对高危型幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA的基因型(C584T)进行准确鉴定。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；探针2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；每个所述探针的两端分别标记有荧光报告基团/荧光淬灭基团。

进一步地，所述试剂盒中还包含以下组分中的一种或几种：PCR反应液、酶反应液、无核酸酶水，阴性对照、或阳性对照。

进一步地，所述PCR反应液包括缓冲液、MgCl2和dNTPs；所述酶反应液包括Taq酶。

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC或HEX、ROX、NED、CY3或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra、Quencher、或MGB。

进一步地，所述试剂盒PCR扩增条件为：95℃300s；95℃10s，60℃30s，收集荧光，45个循环。

进一步地，两个所述探针上荧光报告基团互不相同。

进一步地，所述上游引物、下游引物、探针1、探针2的摩尔比为：2：3：3：2。

本发明的另一方面提供了上述试剂盒在制备幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA的基因多态性的检测产品中的应用。

如上所述，本发明的基于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因多态性的试剂盒，具有以下有益效果：

(1)本发明的试剂盒采用MGB核酸扩增方法区分检测高危型幽门螺杆菌(丝氨酸蛋白酶HtrA基因分型)，方法操作简便且能有效防止污染：PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为1小时；PCR荧光检测是全封闭操作，加样后可不再打开管盖，大大避免了污染发生；

(2)本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、抗干扰且可节约成本等优点，具有极大的应用前景。

附图说明

图1a显示为野生型基因检测灵敏度(梯度稀释)示意图。

图1b显示为野生型基因检测灵敏度(检测限20次重复)示意图。

图2a显示为突变型基因检测灵敏度(梯度稀释)示意图。

图2b显示为突变型基因检测灵敏度(检测限20次重复)示意图。

图3显示为检测试剂特异性(交叉试验)试验示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1试剂盒组分及其使用方法

试剂盒成分

PCR反应液、酶反应液、丝氨酸蛋白酶HtrA基因检测液(即位点反应液)、无核酸酶水。

PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl

本实施例中使用的丝氨酸蛋白酶HtrA基因的引物和探针的核苷酸序列可参见表1。

表1

注：X1、X2为荧光报告基团，Y1为荧光淬灭基团。

HtrA基因genbank登录号：KF773839.1。

使用方法

一、检测方法

1、PCR试剂准备(试剂准备区)

1.1从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，位点反应液用手轻弹混匀(勿涡旋震荡)，低速离心5s。

在本实施例中，各组分需要的量为：

1.2将各组分震荡混匀，低速离心5s，按照19μL/孔分装至八联管内备用。

2、DNA提取(样品制备区)

2.1将待测样品(胃黏膜或胃液或唾液或牙菌斑或粪便或水源)在涡旋混匀器上混匀，取800μL混合液，12000转每分钟离心2分钟，弃上清，加入提取液，放置5分钟，12000转每分钟离心2分钟后取上清液备用。

2.2加样：将提取好的待测样品DNA稀释到20ng/μL。用带滤芯吸嘴分别吸取待测样品DNA、无核酸酶水(阴性质控)、阳性对照样本各1μL加入八联管各孔中，盖紧管盖，低速离心数秒后转移至PCR扩增区。

3、PCR扩增区

ABIPrism 7500仪器设置

a)打开“Set up”窗口，按样品对应顺序设置阴性质控(negative control)、阳性对照(positive control allel1/allel1、allel2/allel2)以及待测样品(unknown)，并在“sample name”一栏中设置样品名称。探针检测模式设置为：FAM/VIC。

b)打开RUN Method窗口，设置循环条件如下：

95℃300s；95℃10s，60℃30s，收集荧光，45个循环；保存文件，运行。

二、结果判读

在仪器正常，阴性参考品、阳性参考品扩增曲线均正常的情况下，FAM野生型(胃癌低危型)和VIC突变型(胃癌高危型)通道按下面方式判断：

1.在CT≤36，判断为对应通道病原体为阳性。

2.在36＜CT≤40，再重复一次实验，结果相同的情况下，判断为阳性。

3.在Ct＞40或无扩增，此次结果判断为阴性。

以上要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。

实施例2试剂盒的灵敏性试验

阳性对照参考品为幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因的C584T野生型与突变行序列的非复制型腺病毒，通过专业机构合成；10倍梯度稀释至500拷贝每毫升(图1中右面起跳的扩增曲线)。

阴性参考品为无DNA酶水。无DNA酶水1000ml，然后在灭菌锅中121℃，20min高温灭菌，做好标记，室温保存。

采用本发明试剂盒按照上述方法进行检测。

检测结果表明：本发明试剂盒对于幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因的C584T野生型与突变行序列的检测具有良好的灵敏性，达到500拷贝每毫升，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，见图1a-1b、图2a-2b。

实施例3试剂盒的特异性试验

为了检测幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因的C584T野生型与突变行序列核酸检测试剂盒(荧光PCR法)的特异性，用本发明幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因的C584T野生型与突变行序列基因核酸检测试剂盒(荧光PCR法)检测鼻病毒、肠道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流行性感冒病毒(A及B型)、副流感病毒等。

检测结果表明：本试剂盒能特异性扩增幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA基因的C584T野生型与突变行序列，而不与呼吸道内其它病毒的核酸发生交叉反应，见图3。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。