黄酮醇苷衍生物及其用途和制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及藏药长梗金腰中2个高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物及其在制备治疗胆汁淤积型肝损伤疾病药物中的新用途，同时公开其制备方法。

背景技术

肝内胆汁淤积 (intrahepatic cholestasis, IC)，是一种由于肝细胞或毛细胆管结构与功能障碍，导致胆汁酸在肝脏内蓄积，从而引发肝脏病变的临床综合征。长期持续的IC将发展成原发性胆汁性肝硬化、原发性肝硬化性胆管炎、肝癌、肝衰竭等严重后果。现代医学认为，任何引起肝细胞和胆管细胞损害的因素均可导致IC，常见病因包括病毒和细菌感染、药物损伤、自身免疫性疾病、酒精中毒等。流行病学调查结果显示，IC发病率在我国正逐年升高。因此，寻找高效IC治疗药物对保障人们健康具有重要的意义。

现代医学对于IC尚缺乏特异性髙、疗效好、副作用小的治疗药物，主要以综合治疗为主。临床常用药物主要包括熊去氧胆酸、糖皮质激素和S-腺苷蛋氨酸等。熊去氧胆酸可明显改善胆汁淤积，但其价格贵，且疗效较慢，部分患者对其应答不佳。糖皮质激素（如地塞米松等）被认为是治疗急性IC的传统药物之一，但是服用后易产生反跳现象，并且长期服用激素会产生严重的不良反应，对于重症IC不能长期使用。总的来说，西医对IC的治疗是以改善症状和控制相关并发症为主，临床上尚无特效药，且可选药物不多，漫长的治疗过程、昂贵的医疗费用以及治疗过程所伴发的不良反应给患者造成了严重的身心负担。因此，研发治疗IC的新型药物具有重要意义。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物，同时公开其用途和制备方法，该衍生物具有抗IC型肝损伤的活性，可为治疗IC型肝损伤相关疾病的药物研究与开发提供新药物研发方向。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物，其具有以下所示的化学结构：

第二方面，本发明涉及高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物在制备治疗胆汁淤积型肝损伤疾病药物中的应用，所述高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物具有以下式（I）或式（ II ）所示的化学结构：

式（I） 式（II）

优选地，如上文所述的应用，所述药物是由式（I）或式（ II ）所示结构的化合物与药用辅料混合制成医学上可接受的制剂。

优选地，如上文所述的应用，所述胆汁淤积型肝损伤疾病为原发性胆汁性肝硬化、原发性肝硬化性胆管炎、病毒性肝炎、酒精及药物性肝损伤、妊娠期胆汁淤积症中的任一种或几种。

优选地，所述式（I）或式（ II ）所示结构的化合物是从长梗金腰全草中提取分离得到。

第三方面，本发明还涉及高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物的制备方法，所述高度甲氧基化黄酮醇苷衍生物为上述式（I）或式（ II ）所示结构的化合物，制备方法包括如下步骤：

S1、用体积浓度为60-80%(优选70%)的乙醇对长梗金腰全草在室温下渗漏提取，减压浓缩，得到浸膏；

S2、将步骤S1得到的浸膏加入分散剂分散，分散剂为0%-10%乙醇，其加入的比例为浸膏：分散剂为2-3:1-4，其中浸膏以千克计，分散剂以升计，得分散液；

S3、将步骤S2得到的分散液上大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，每梯度洗脱3~6个（优选5个）柱体积，得到10个流分frs.H0-H9；

S4、将步骤S3得到的40%乙醇洗脱流分fr.H5加入热甲醇捏溶，抽滤，获得甲醇不溶部分fr.H5-1和甲醇可溶部分fr.H5-2；

S5、将fr.H5-1经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-乙醇溶剂系统16:1洗脱，得7个流分frs.H5-1S1~H5-1S7；其中，fr.H5-1S3流分经制备色谱分离得到式（ II ）所示结构的化合物；

S6、步骤S4得到的甲醇可溶部分fr.H5-2进一步上Sephadex LH-20柱，90%甲醇洗脱，得8个流分frs.H5-2L1~H5-2L8；其中，H5-2L4流分经制备色谱分离得到式（I）所示结构的化合物。

优选地，步骤S3中，所述的大孔吸附树脂柱为HP-20大孔吸附树脂柱或D101大孔吸附树脂柱。

优选地，步骤S5-S6中，所述制备色谱为反相ODS HPLC制备色谱。

上述式（I）所示结构的化合物命名为chrysosplenoside I，式（ II ）所示结构的化合物命名为chrysosplenoside A，以下均以这个名称来说明。

（三）有益效果

本发明的有益效果是：

本发明对长梗金腰全草中的主要化学成分进行分离鉴定，筛选出了具有抗肝内胆汁淤积型肝损伤的活性物质，为治疗肝内胆汁淤积型肝损伤相关疾病的药物研究与开发提供基础。

通过急性毒性分级法分别评价了长梗金腰全草的分离物：

chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠单次经口给药的急性毒性。在此基础上，采用α-萘异硫氰酸酯（α-naphthylisothicoyanate, ANIT）诱导的小鼠肝内胆汁淤积（intrahepatic cholestasis，IC）型肝损伤模型，评价了两个受试单体（chrysosplenoside I和chrysosplenoside A）抗IC型肝损伤的活性。结果表明：①chrysosplenoside I和chrysosplenoside A的LD50（半数致死量）均为4-5g/kg，同属于低毒性化合物，但大剂量服用具有一定的肝毒性，且chrysosplenoside I的毒性低于chrysosplenoside A；② 受试的两单体在低、中、高（30 mg/kg，60 mg/kg，120 mg/kg）剂量灌胃给药条件下均可显著降低ANIT所致的急性IC型肝损伤模型小鼠的血清生化指标水平，抑制其体内的氧化应激和脂质过氧化反应，显著改善模型小鼠肝脏受损的状态。

值得一提的是，受试的两单体在中剂量（60 mg/kg）条件下抗ANIT所致小鼠IC肝损伤的效果整体均优于临床治疗IC型肝损伤类疾病的一线药物熊去氧胆酸（UDCA, 100 mg/kg），这表明本发明所述的chrysosplenoside I和chrysosplenoside A具有进一步开发成治疗IC型肝损伤药物的潜力，尤其是具有更低毒性的chrysosplenoside I。

附图说明

图1为chrysosplenoside I的结构式；

图2为chrysosplenoside A的结构式；

图3为长梗金腰醇提物的HPLC指纹图，其中图中1和2分别为chrysosplenoside I和chrysosplenoside A的指纹图；:

图4为chrysosplenoside I的核磁共振氢谱 (

图5为chrysosplenoside I的核磁共振碳谱 (

图6为chrysosplenoside I的主要HMBC(H→C)相关。

具体实施方式

实施例1 长梗金腰中主要成分的分离

本实施例为长梗金腰中主要成分的分离方法，包括：

（1）取长梗金腰干燥全草6.0 kg，适当粉碎，置于渗漉桶，加入70%乙醇渗漉提取，合并提取液，减压浓缩回收溶剂，得浸膏2.5 kg。取少量浸膏以70%甲醇溶解，过0.45 μM 滤膜，所得滤液取10μL注入高效液相色谱仪(HPLC)，得长梗金腰70%醇提物的HPLC指纹图(图3)。如图1、图2、图3所示，其主要成分为化合物1和化合物2。

（2）取浸膏2.4 kg，用500 mL 10%乙醇加热捏溶，然后加入500 mL蒸馏水使其分散。

（3）分散液上HP-20大孔吸附树脂柱，以蒸馏水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，每梯度洗脱5个柱体积，得到10个流分frs.H0-H9。

（4）经过HPLC分析，目标化合物1和2主要集中在40%乙醇洗脱部位fr.H5。取fr.H5(92.8 g)加入热甲醇捏溶，抽滤，获得甲醇不溶部分fr.H5-1和甲醇可溶部分fr.H5-2。

（5）取fr.H5-1 (32.4 g) 经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-乙醇溶剂系统16:1洗脱，得7个流分frs.H5-1S1~H5-1S7。其中，fr.H5-1S3流分经反相ODS HPLC制备色谱 (5 µm,i.d.20 mm × 250 mm, YMC股份有限公司, 流动相为30%乙腈) 反复制备得到化合物2(12.5 g,

（6）取fr.H5-2 (38.4 g) 进一步上Sephadex LH-20柱，90%甲醇洗脱，得8个流分frs.H5-2L1~H5-2L8。其中，H5-2L4流分经反相ODS HPLC制备色谱 (5 µm, i.d.20 mm ×250 mm, YMC股份有限公司, 流动相为30%乙腈) 反复制备得到化合物1(14.8 g,

实施例2 本实施例是对上述化合物1和化合物2的结构鉴定，包括两部分：

（1）化合物1的结构鉴定

化合物1为一种黄棕色不定形粉末，易溶于甲醇。HR-ESI-MS 给出准分子离子峰

化合物1的核磁共振(NMR)氢谱(

表1：

通过上述鉴定过程，确定化合物1的结构式如下：

（2）化合物2的结构鉴定

化合物2为一种黄棕色不定形粉末，难溶于甲醇，可溶于DMSO。HR-ESI-MS给出准分子离子峰

经比对，化合物2被确定为如下结构式，并将其命名为chrysosplenoside A。

实施例3

本实施例是关于chrysosplenoside A和Chrysosplenoside I急性毒性评价，评价方法为：按照中国食品药品监督管理局（China Food and Drug Administration, CFDA）发布的《化学药物急性毒性试验技术指导原则》以及急性毒性分级法的指导原则，以2 g/kg作为chrysosplenoside I和chrysosplenoside A的初始给药剂量，一次性经口灌胃小鼠，进行小鼠急性毒性试验。

动物分组及给药方案如下：随机选取小鼠40只，雌雄各半，用3%苦味酸溶液标记；实验分为4组，每组雄、雌各5只，分别为空白对照组、溶媒对照组、chrysosplenoside I给药组、chrysosplenoside A给药组；受试药物用0.5% CMC-Na溶液超声溶解，给药剂量为2g/kg，单次灌胃给药；溶媒对照组灌胃等体积的0.5% CMC-Na溶液，空白对照组灌胃等体积的水溶液，灌胃体积为40mL/kg，单次灌胃；给药前禁食12 h，不禁水。

结果如下：

（1）Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠健康状态的影响

单次灌胃给药后，与空白对照组和溶媒对照组小鼠相比，chrysosplenoside I给药组小鼠出现闭眼、呼吸急促、心跳加快、活动减弱等现象，5 min后，症状得到明显缓解，10min后，上述症状基本消失，小鼠活动行为均正常；chrysosplenoside A给药组小鼠给药后2min内，出现了行动迟缓、心跳加快、对外界刺激变弱等症状，且雌性小鼠的症状更明显；给药5 min后，chrysosplenoside A给药组小鼠的心跳逐渐平缓，对外界的刺激反应时间变短；10 min后上述症状基本消失，小鼠活动逐渐正常，在鼠笼内攀爬。灌胃后2 h后各组小鼠恢复进食，饮食情况无较大差异。观察期内，动物的行为活动、进食、饮水、呼吸正常，与空白对照组相比无显著差异，且没有出现中毒反应和死亡现象。与空白对照组相比，溶媒组小鼠的各项观察指标均无显著差异。说明 chrysosplenoside I和chrysosplenoside A同属于低毒性化合物。

（2）Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠体质量的影响

对各组小鼠的体质量进行统计，结果如表2所示。灌胃前各组小鼠的体质量无显著差异，单次灌胃给药后14 d内，所有小鼠均无死亡现象，且增长趋势与空白和溶媒对照基本一致，呈逐渐上升的趋势。Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A给药组在给药14 d内的体质量与空白和溶媒对照组相比均无显著差异（

表2：Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠体质量的影响

（3）Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠脏器指数的影响

给药后第14 d，采血后脱颈处死小鼠，解剖，肉眼观察小鼠肝、心、脾、肺、肾等主要脏器的病变情况，称取各脏器湿重，计算各脏器指数。脏器指数计算公式为：脏器指数=脏器质量/动物体质量×100%。Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A给药组小鼠各脏器的质地、颜色与空白和溶媒对照组小鼠相比，无明显差异，无明显毒性反应，各组织脏器系数无显著差异（

表3：Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠脏器指数影响

（4）Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠肝肾功能指标的影响

与溶媒对照组相比，chrysosplenoside I给药组雄性小鼠血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、BUN水平无显著变化，无统计学意义（

表4:Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A对小鼠血清指标水平的影响

实施例4

本实施例研究Chrysosplenoside I和chrysosplenoside A的对ANIT致小鼠IC型肝损伤的保护作用，实验方案如下：

将90只雄性昆明小鼠随机分为以下9组：对照组、模型组、阳性药组(熊去氧胆酸UDCA，临床治疗IC型肝损伤的一线用药）、chrysosplenoside I低剂量组（30mg/kg）、chrysosplenoside I中剂量组（60mg/kg）、chrysosplenoside I高剂量组（120mg/kg）、chrysosplenoside A低剂量组（30mg/kg）、chrysosplenoside A中剂量组 (60mg/kg)、chrysosplenoside A高剂量组(120 mg/kg)。

给药方案方案：chrysosplenoside I、chrysosplenoside A和UDCA混悬于0.5%CMC-Na溶液中。每组连续灌胃7天，每天1次，灌胃体积15 mL/kg，空白组和模型组灌胃同等体积的0.5% CMC-Na溶液，其余各组按对应溶液进行灌胃。灌胃第5天后1 h，除空白组灌胃等体积的橄榄油外，其余各组灌胃60 mg/kg ANIT的橄榄油溶液造模。48 h后小鼠腹主动脉取血，全血静置1 h后，于4°C，3500 r/min离心10 min，吸取上清液于EP管中，4°C冰箱保存，待测。解剖小鼠，于冰台上迅速分取小鼠肝脏，选取相同部位肝组织，置于﹣80°C冰箱保存，用于制备肝组织匀浆。

采用试剂盒检测血清和组织匀浆液生化指标成分，结果如下：

（1）受试化合物对ANIT致急性IC型肝损伤小鼠血清生化指标的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA、DBIL、TBIL水平均显著升高（

表5：受试化合物对ANIT致急性IC型肝损伤小鼠血清ALT、AST和ALP水平的影响

表6:受试化合物对ANIT致急性IC型肝损伤小鼠血清TBA、DBIL和TBIL水平的影响

由表5-6可知，与模型组相比，受试的两种化合物在低、中、高（30 mg/kg，60 mg/kg，120 mg/kg）剂量灌胃给药条件下均可显著降低ANIT所致的急性IC型肝损伤模型小鼠的血清生化指标水平，抑制其体内的氧化应激和脂质过氧化反应，显著改善模型小鼠肝脏受损的状态。而与UDCA（熊去氧胆酸）组相比，受试的两种化合物在中剂量（60 mg/kg）条件下抗ANIT所致小鼠IC肝损伤的效果整体更优。

（2）对ANIT致急性IC型肝损伤小鼠肝匀浆中SOD、MDA、GSH-Px水平的影响

与对照组相比，模型组小鼠肝组织匀浆中SOD和GSH-Px含量显著降低（

表7：受试化合物对ANIT致急性肝损伤小鼠肝组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px影响

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。