一种改良的星形胶质细胞培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，更具体的是涉及星形胶质细胞培养技术领域。

背景技术

细胞培养技术越来越被当今许多学科所重视与应用，获得较纯的星形胶质细胞是进行其功能及其他研究的基础。在中枢神经系统中，胶质细胞的数量超过神经元的十倍，其中星形胶质细胞(astrocytes)是数量最多、分布最广的一种胶质细胞。它们形状不规则，有多个突起，充填于神经细胞的胞体及其突起之间，起支持、引导和分隔神经细胞的作用，并且通过调节细胞外离子和神经递质水平而调节神经兴奋性和神经传递。星形胶质细胞，还是哺乳动物脑内分布最为广泛的一类胶质细胞，也是所有胶质细胞中体积最大的一种。近年来，越来越多的研究表明星形胶质细胞在大脑中还有许多更加重要和复杂的功能，它们可以分泌一些神经营养因子和细胞因子，调节神经元功能，星形胶质细胞以及反应性星形胶质细胞在神经系统疾病、感染、创伤的修复等病理生理过程中起到重要的作用。

原代星形胶质细胞在分离早期与体内情况接近，随着培养时间的延长，原代细胞的活性和功能易丧失，细胞易老化。其长期培养以及活性和功能维持是一个制约细胞模型成功建立的关键。而在进行细胞分离的早期，获得活性较好的细胞是原代长期培养中的活性和功能的维持的前提。因此建立一个合适的神经星形胶质细胞胞的分离培养方法显得尤为重要。由于星形胶质细胞生长缓慢，提取原代消耗大量样本，耗费人力物力，成本高。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供一种改良的星形胶质细胞培养方法。

本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种改良的星形胶质细胞培养方法，包括如下步骤：

步骤1、制备星形胶质细胞悬液；

步骤2、将细胞培养板用L-多聚赖氨酸包被过夜，细胞培养板在包被之前每个孔内均放入爬片(使细胞培养板和爬片一同被包被)，之后用磷酸缓冲盐溶液清洗；

步骤3、将星形胶质细胞悬液种植于步骤2清洗后的细胞培养板中，后置于培养箱培养；

步骤4、培养3-6天后将细胞培养板中的爬片取出放入新的细胞培养板中，新的细胞培养板的每个孔放入一个爬片，然后加入胶质细胞培养基，将取出爬片的细胞培养板和放入爬片的新的细胞培养板同时置于培养箱继续培养14-42天。

本申请的技术方案中，细胞培养板在包被之前每个孔内均放入爬片，使细胞培养板和爬片一同被包被，可将细胞培养板上每个孔的底部和爬片同时包被，后将星形胶质细胞悬液种植于细胞培养板的孔内，L-多聚赖氨酸通过多聚赖氨酸多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力，培养3-6天后贴壁后将爬片取出放入新的细胞培养板中，新的细胞培养板的每个孔放入一个爬片，然后加入胶质细胞培养基，将取出爬片的细胞培养板和放入爬片的新的细胞培养板同时置于培养箱继续培养，因爬片直径小于细胞培养板上的孔径，未被爬片覆盖的位置已有贴壁细胞贴壁，又因该细胞是群居细胞，所以之前未被爬片覆盖的位置且已经贴壁的细胞有利于在移出爬片后，星形胶质细胞悬液中的细胞继续在孔的底部继续贴壁生长，最终得到双倍的细胞，大大缩短了培养星形胶质细胞所需要的时间，在原试验成本上，培养的星形胶质细胞数量明显提高，实质降低了神经细胞培养所需的费用，降低了成本。

本申请的技术方案中，Hibernate-A为海波纳特；Hibernate-A-Ca为去钙去钙海波纳特；HABG为提取细胞时所需要的试剂；B27为无血清补充剂；

Glutamax为谷氨酰胺；DMEM/F12为德尔贝科(氏)改良基本培养基，均来自市售。

进一步的，细胞培养板包括包括六孔板、12孔板、24孔板或48孔板中的任一种；爬片厚度为0.17mm，直径为8mm、14mm、20mm或25mm中的任一种。

进一步的，星形胶质细胞悬液的制备方法包括如下步骤：

步骤a、在冰上培养皿内加入5ml Hibernate-A分离脑组织，具体为除去小脑脑干，分离去除海马，剥离脑膜和血管，切碎皮质后连同Hibernate-A一并转移至50ml离心管中，置于冰上备用；

步骤b、将24mg木瓜蛋白酶置于15ml离心管中，用12ml Hibernate-A-Ca溶解，后20ml一次性注射器抽取溶液，用过滤器过滤细菌，将木瓜蛋白酶溶液置于37℃的水浴箱内20-30分钟，之后置于冰上备用；

步骤c、将步骤a中50ml离心管和步骤b中15ml离心管一同置于30℃的水浴箱中8分钟，之后取出并静置1分钟；

步骤d、将50ml离心管中的细胞提取液吸出丢弃，后将15ml离心管中的木瓜蛋白酶溶液移至该50ml离心管中，并置于摇床上30分钟，30℃，170转/分；

步骤e、配制分层液，从倒数第一层开始依次取1ml各分层液置于15ml离心管中；

步骤f、将步骤d中15ml离心管在室温下静置5分钟，吸出木瓜蛋白酶溶于，在剩下的组织碎片中加入4ml HABG，后用巴氏管吸打3分钟，每5秒一次，静置1分钟，吸出上清液置于新的15ml离心管中，再在剩下的组织碎片中加入4ml HABG，并重复上述步骤，得8ml上清液；

步骤g、取步骤e的离心管，并将步骤f得到的上清液6ml置于分层液的顶部，将该离心管置于离心机内，在800g，22℃下离心15min，后从离心管中从下至上吸取2-3ml置于另一离心管中，并加入10ml HABG并用巴氏管吹打均匀，后置于离心机内，在22℃，200g，离心10分钟，弃上清液，留下底部白的沉淀，向白色沉淀中加入6ml胶质细胞培养基，用巴氏管吹打混匀，即得。

更进一步的，分层液包括倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层，倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层的密度梯度离心液体积分别为1038μL、744μL、594μL和444μL；倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层的HABG分别为4962μL、5256μL、5406μL和5556μL。

更进一步的，HABG包括50ml Hibernate-A，1ml B27和0.125ml Glutamax。

更进一步的，胶质细胞培养基包括40ml DMEM/F12，4.8ml胎牛血清，0.4ml双抗，其中双抗为青霉素和链霉素的混合液。

进一步的，步骤2中，用磷酸缓冲盐溶液清洗三次。

更进一步的，脑组织来自小鼠或大鼠。

本发明的有益效果如下：

1.对于神经细胞原代培养中，尤其针对星形胶质细胞的培养，在细胞培养数量低时间长是普遍现象，其中数量低无法完成后续试验，影响后续的试验进度，通过本申请的方法，获得的细胞数量是之前的一倍，大大缩短了培养细胞所需要的时间；

2.本申请的发明并不会影响过多的实验的步骤，并不会为试验带来过多的负担；

3.在原试验成本上，培养的星形胶质细胞数量明显提高，实质降低了神经细胞培养所需的费用，降低了成本。

附图说明

图1是本发明六孔板的结构示意图；

图2是本发明六孔板底部的成年大鼠星形胶质细胞200倍镜下的显微结构图；

图3是本发明爬片上的成年大鼠星形胶质细胞200倍镜下的显微结构图。

附图标记：1-六孔板，2-爬片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1-3所示，一种改良的星形胶质细胞培养方法，包括如下步骤：

步骤1、制备星形胶质细胞悬液，具体步骤如下：

步骤a、在冰上培养皿内加入5ml Hibernate-A分离脑组织，脑组织来自成年大鼠，具体为除去小脑脑干，分离去除海马，剥离脑膜和血管，切碎皮质后连同Hibernate-A一并转移至50ml离心管中，置于冰上备用；

步骤b、将24mg木瓜蛋白酶置于15ml离心管中，用12ml Hibernate-A-Ca溶解，后用20ml一次性注射器抽取溶液，用过滤器过滤细菌，将木瓜蛋白酶溶液置于37℃的水浴箱内20-30分钟，之后置于冰上备用；

步骤c、将步骤a中50ml离心管和步骤b中15ml离心管一同置于30℃的水浴箱中8分钟，之后取出并静置1分钟；

步骤d、将50ml离心管中的细胞提取液吸出丢弃，后将15ml离心管中的木瓜蛋白酶溶液移至该50ml离心管中，并置于摇床上30分钟，30℃，170转/分；

步骤e、配制分层液，从倒数第一层开始依次取1ml各分层液置于15ml离心管中；分层液包括倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层，倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层的密度梯度离心液体积分别为1038μL、744μL、594μL和444μL；倒数第一层、倒数第二层、倒数第三层和倒数第四层的HABG分别为4962μL、5256μL、5406μL和5556μL；

步骤f、将步骤d中15ml离心管在室温下静置5分钟，吸出木瓜蛋白酶溶于，在剩下的组织碎片中加入4ml HABG，后用巴氏管吸打3分钟，每5秒一次，静置1分钟，吸出上清液置于新的15ml离心管中，再在剩下的组织碎片中加入4ml HABG，并重复上述步骤，得8ml上清液；

步骤g、取步骤e的离心管，并将步骤f得到的上清液6ml置于分层液的顶部，将该离心管置于离心机内，在800g，22℃下离心15min，后从离心管中从下至上吸取2-3ml置于另一离心管中，并加入10ml HABG并用巴氏管吹打均匀，后置于离心机内，在22℃，200g，离心10分钟，弃上清液，留下底部白的沉淀，向白色沉淀中加入6ml胶质细胞培养基，用巴氏管吹打混匀，即得。

步骤2、将细胞培养板用L-多聚赖氨酸包被过夜，细胞培养板在包被之前每个孔内均放入爬片2(使细胞培养板和爬片2一同被包被)，爬片2厚度为0.17mm，直径为8mm，之后用磷酸缓冲盐溶液清洗三次；

步骤3、将星形胶质细胞悬液种植于步骤2清洗后的六孔板1中，后置于培养箱培养；

步骤4、培养4天后将细胞培养板中的爬片2取出放入新的细胞培养板中，新的细胞培养板的每个孔放入一个爬片2，然后加入胶质细胞培养基，将取出爬片2的细胞培养板和放入爬片2的新的细胞培养板同时置于培养箱继续培养30天。

细胞培养板为六孔板1。

HABG包括50ml Hibernate-A，1ml B27和0.125ml Glutamax。

胶质细胞培养基包括40ml DMEM/F12，4.8ml胎牛血清，0.4ml双抗，其中双抗为青霉素和链霉素的混合液。

图1和图2中，箭头所指为成年大鼠星形胶质细胞。

实施例2

在实施例1的基础上，脑组织来自小鼠，将取出爬片2的细胞培养板和放入爬片2的新的细胞培养板同时置于培养箱继续培养14天，其余同实施例1。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。