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表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒研究技术领域，涉及一种表达SARS-CoV-2纤突蛋白(S)或其变异体的假型化VSV病毒及其构建和应用；尤其涉及一种表达SARS-CoV-2的纤突蛋白(S)或其羧基末端发生缺失的重组水泡性口炎病毒(VSV)及其构建和应用。

背景技术

根据血清型和基因组特点，冠状病毒科被分为α、β、γ和δ四个属。CoV-2属于β冠状病毒属，该属冠状病毒还包括中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV),对CoV-2全长基因组进行的系统进化分析表明，该新型冠状病毒与SARS病毒的相似度高于MERS病毒。

CoV-2基因组为单股正链RNA，长度约为29.8Kb，其5’端为编码复制酶复合物的开放阅读框(Open reading frame，ORF)1ab，占基因组全长约2/3，编码聚合酶等非结构蛋白；后1/3区域编码纤突蛋白(Spike,S)、小囊膜蛋白(Envelope,E)、膜蛋白 (Membrane,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)。纤突蛋白(S)以三聚体的形式嵌入病毒粒子囊膜的表面，负责病毒与宿主细胞表面受体结合，是冠状病毒最重要的中和保护性抗原，也是疫苗研制的最主要靶抗原。最新的研究表明，CoV-2的受体与 SARS-CoV相同，均为血管紧张素转换酶2(ACE2)，然而，冠状病毒S蛋白氨基酸序列分析也显示，SARS病毒S蛋白与ACE2互作的5个关键氨基酸位点，在冠状病毒CoV-2 中有4个发生了改变。这提示病毒的二者间免疫原性可能发生了显著变化。

防范病毒感染最有效的方法是使用疫苗，但目前仍缺乏控制人冠状病毒感染的有效疫苗和成熟技术。冠状病毒具有高度的变异性，这一方面是由于该类病毒属于RNA病毒，其RNA复制酶纠错能力低，易导致基因突变，另一方面，冠状病毒毒株之间可发生基因重组，更增加了疫苗研制的难度。因此，如能构建一个快速研制疫苗的通用技术平台，将有助于应对突发疫情。目前常用的研制疫苗方法包括灭活疫苗和减毒疫苗，灭活疫苗的制备需对病毒进行大量培养，并经灭活后使用，这种方法对高致病性病毒如 SARS等的生产安全要求极高，需在生物安全3级实验室进行。病毒大规模培养，一旦泄漏将产生巨大灾难；此外，灭活疫苗须多次接种，产生效力所需时间长，且无法有效激发粘膜免疫。人新型冠状病毒(CoV-2)虽然已经VeroE6细胞体外分离培养成功，但病毒高水平生产仍需对培养条件进行充分优化，包括合适的细胞系等。减毒活疫苗病毒株的获取方法有传统细胞传代法和通过基因工程技术使病毒毒力基因缺失，但失去致病力的减毒活疫苗有可能逆转为致病株，冠状病毒在野外易发生重组，减毒突变株在自然条件下可与野毒株重组重新获得毒性，这些缺点使得难以在短时间内获得传统意义上的人新型冠状病毒疫苗，需寻找新的研制方法。这其中，借助安全和技术成熟的病毒载体来高效表达CoV-2关键保护性抗原可能是一种有效的解决途径。目前，常用的病毒载体包括：DNA病毒载体(如腺病毒、痘病毒)；反转录病毒载体(如慢病毒)以及RNA病毒载体(如水泡性口炎病毒和麻疹病毒)等。

1996年，John Rose课题组建立了水泡性口炎病毒(VSV)拯救(Rescue)技术，经过基因工程改造，VSV目前已成为一个安全、高效的疫苗载体，已在用于那些难以体外培养、致病性强的病原体，如HIV、HCV等疫苗的研发。VSV病毒载体的优点主要包括：1.对人无致病性，比较安全；作为一种RNA病毒，不会引起宿主细胞的转化； 2.可高效表达大分子外源蛋白；3.单次接种即可快速激发机体产生全面的免疫应答，包括粘膜免疫、细胞和体液免疫应答；4.扩增VSV所用BHK21细胞可高密度悬浮培养。这为VSV重组疫苗进行工业化生产提供了得天独厚的优势。近年来，重组VSV已在人用应急免疫疫苗的研制和应用上取得突破，以其为载体表达Ebola病毒囊膜糖蛋白(GP) 研制的疫苗，已投入临床应用，灵长动物单次接种该疫苗5天后即可获得有效免疫保护力，并经受住致死剂量Ebola病毒的攻击；在冠状病毒方面，课题申请人前期也研制了表达猪冠状病毒——猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白(S)的VSV活载体疫苗，动物实验显示出其能在猪体内激发出良好的免疫保护力。这些成功的经验显示出，VSV 病毒载体可能是研制CoV-2冠状病毒疫苗的良好平台。与腺病毒载体不同，人自然状态不接触VSV，体内不会有VSV的抗体，因此，接种的疫苗不会受到干扰。

VSV属于弹状病毒，其基因组约为11kb，编码5个结构蛋白，包括RNA复制酶(L)、磷酸化蛋白(P)、核衣壳蛋白(N)、囊膜蛋白(G)和基质蛋白(M)。G蛋白负责识别病毒受体并介导病毒入侵宿主细胞，它决定了VSV病毒的嗜性；M蛋白可分布于细胞核，阻断宿主细胞mRNA向细胞质的转运，从而起到抑制I型干扰素表达等作用，是病毒的最重要毒力因子。对病毒载体而言，安全性最受关注。目前，申请人以及其他学者围绕M和G蛋白构建了一系列高度弱化的VSV病毒载体，如课题申请人前期成功地构建了M蛋白和G蛋白双位点突变型重组VSV病毒(VSV

冠状病毒的纤突蛋白(S)是一个分子量约为200kDa的I型跨膜糖蛋白，其结构包括N末端的信号肽,胞外区段(Ectodomain,ET),跨膜区段(Transmembrane domain,TM) 以及胞内区段(cytoplasomic tail,CT)。研究显示，S蛋白诱发中和保护性抗体高度依赖其空间构象的完整性，甚至是蛋白嵌入囊膜形成三聚体的完整性，单独或串联表位以及 S1或S2亚基均难以发挥有效保护性作用，因此，如何利用基因工程技术大量制备具有天然构象的S蛋白一直是困扰相关疫苗研制的难题。课题申请人在PEDV的研究表明，PEDV 全长S基因克隆到VSV基因组后，无法拯救出病毒，但当S蛋白的胞内区段羧基末端19 个氨基酸敲除后，则可成功嵌入VSV囊膜。这与蛋白上羧基末端一个保守双碱基基序 (motif)结构：KxHxx有关。这个基序结构使得S蛋白定位于内质网高尔基体中间区室 (ERGIC)，而非细胞膜表面，由于VSV的出芽发生在细胞膜，这会影响到冠状病毒S 蛋白有效插入VSV的囊膜并最终干扰了重组VSV的拯救。我们的研究还显示，由于PEDV S蛋白只是去除了羧基末端若干氨基酸，其胞外和跨膜结构域仍完整保留，因此其能整合嵌入VSV囊膜，动物实验也证实S蛋白免疫原性未受影响。CoV-2S蛋白含有1273个氨基酸，蛋白结构分析表明，其羧基末端也存在一个KxHxx基序结构(AA1269-1273)，这极有可能干扰重组VSV的拯救，因此，如何对CoV-2的S蛋白的胞内区段长度进行优化，将是构建VSV活载体疫苗的关键之一。

此外，在目前缺乏疫苗和有效药物的情况下，对患者进行准确、快速的诊断是控制疫情的关键。病原体感染常用的诊断方法包括：(1)针对病原体蛋白、核酸的检测； (2)感染者体内特异性抗体检测，如：ELISA、胶体金敏感试纸以及中和抗体检测。目前，对CoV-2感染或疑似患者的确诊基本依赖核酸检测，但该方法使用受制于能够承担临床检测的生物安全3级实验室(P3)的数量以及能进行熟练稳定操作的工作人员；此外，样本的类型，样品的收集运输和储存方法，核酸(RNA)提取方法，检测设备(PCR 仪或real-time PCR仪)的准确性和稳定性都会影响到检测效果。

针对这些问题，已有公司开始研发针对体内特异抗体的检测方法，包括敏感试纸条以及ELISA试剂盒。与常规ELISA检测的是血清中总IgG或IgM抗体不同，中和抗体检测反映的是体内具有保护性作用抗体的水平，因此在临床上具有独特的诊断意义，该方法对结果的判断无须针对特定抗体类型，如IgA、IgG和IgM等。因此，适用于类型广泛的样品，包括灭活病毒的血液、呼吸道粘液以及肺灌洗液等。此外，相比核酸检测，中和抗体检测受环境及器械污染的干扰较小，具有很高的特异性，可用于筛查无症状或潜伏期等难以用核酸方法确认的患者，这将有助于从源头控制新冠病毒的传播。未来，中和抗体检测还将能用于追溯COV-2病毒的动物天然宿主和中间宿主，而不必对每一种动物都开发相应的ELISA试剂盒；对于抗体疗法、疫苗研制等依赖中和抗体进行评价的临床和科学研究，其也具有广泛的应用前景。

然而，基于中和抗体的检测方法也存在一些瓶颈问题，包括：(1)中和抗体检测通常需要使用原始活病毒，对于像CoV-2这样的高致病性病毒，这意味着需要在P3实验室才可开展相关检测；(2)结果判断有赖于细胞出现明显的病变(CPE)，具有一定的主观性；(3)冠状病毒复制速度较慢，CPE判定时间通常要72小时。这些问题都极大地限制了中和抗体检测方法的使用和推广。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种表达SARS-CoV-2纤突蛋白(S) 或其变异体的重组VSV病毒及其构建和应用。本发明实施所需SARS-CoV-2病毒S基因按NCBI上公布的病毒株序列(GenBank accession no.MN908947)进行全基因合成，合成的基因的密码子按人细胞密码子优化，在此基础上，通过对SARS-CoV-2S蛋白的胞内区段长度进行优化，去除其羧基端的KxHxx基序结构活性，实现S蛋白高效嵌入VSV 囊膜，构建重组VSV病毒，并以此构建活载体疫苗，以及建立高通量、快速检测 SARS-CoV-2特异性中和抗体的检测方法及产品。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于高效表达和用于基于重组水泡性口炎病毒的新型新冠疫苗的构建的SARS-CoV-2病毒S基因，所述SARS-CoV-2病毒S基因系全基因人工合成，合成的基因的密码子按人细胞密码子优化。序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明还提供了一种表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，所述方法包括：敲除VSV负责识别宿主细胞受体的G蛋白基因，通过SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体SΔ21蛋白构建假型化VSV病毒；SΔ21为胞内区(CT)缺失21个氨基酸的S蛋白变异体。

作为本发明的一个实施方案，所述方法包括：

S1、采用野生型VSV病毒为载体，构建表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒；SΔ21为胞内区(CT)缺失21个氨基酸的S蛋白变异体；

S2、采用M三位点突变的高度弱化和安全的VSV病毒为载体，构建表达 SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒；SΔ21为胞内区(CT)缺失21个氨基酸的S蛋白变异体；由于M蛋白的突变导致VSV载体的高度弱化，从而使得制备的重组新冠疫苗更加安全。

作为本发明的一个实施方案，编码所述SARS-CoV-2的S蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的一个实施方案，本发明的表达人新型冠状病毒SARS-CoV-2纤突蛋白S的重组水泡性口炎病毒VSV的构建方法，具体步骤如下：

A1、重组质粒构建：

a11、对SARS-CoV-2病毒S基因进行碱基敲除(并获得优化的长度)，获得S蛋白突变体SΔ21；

a12、构建克隆VSV Indiana株全长基因组序列的质粒pVSV

a13、将S或SΔ21基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有MluI和XhoI 酶切位点，经双酶切后分别克隆到pVSV

A2、病毒制备：

a21、用痘病毒vTF 7-3感染BHK21细胞，感染浓度为MOI＝5，1-1.5小时后去除痘病毒；

a22、将重组质粒pVSV

a23、将质粒转染混合液共转染步骤a21的BHK21细胞；

a24、用表达VSV G蛋白的质粒pVSV-G转染新鲜BHK21细胞，得BHK-G细胞；

a25、收集步骤a23获得的细胞上清，滤去vTF 7-3病毒，所得滤液加入到BHK-G 细胞中进行扩增，2-3天后收集出现病变的细胞上清；

a26、将步骤a25收集的细胞上清经空斑纯化后，后续用VeroE6细胞扩增、鉴定，得假型化VSV病毒。

第三方面，本发明还提供了一种前述方法构建的表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体的重组VSV病毒。

第四方面，本发明还提供了一种表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体的重组VSV病毒在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

第五方面，本发明还提供了一种表达SARS-CoV-2的S蛋白或其变异体的重组VSV病毒在制备新型冠状病毒特异性中和抗体诊断产品中的应用。

作为本发明的一个实施方案，所述诊断产品包括诊断试纸、诊断试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明成功构建了表达SARS-CoV-2S蛋白或其突变体的重组VSV病毒，针对SARS-CoV-2病毒的S蛋白进行，因此不涉及SARS-CoV-2活病毒，将不会产生生物安全方面的问题。

2、本发明通过构建的重组VSV病毒，成功研制出了可快速激发SARS-CoV2特异性免疫力尤其是粘膜免疫力的VSV活载体疫苗,为未来研制新发冠状病毒提供一个快速和高效研制疫苗的平台；且该VSV载体疫苗易于体外扩增,扩增该病毒所用BHK-21细胞可高密度悬浮培养,这为未来疫苗工业化、规模化生产提供了较大的优势。

3、本发明通过构建的重组VSV病毒，由此建立了相应的新冠病毒特异性中和抗体检测方法及相应的诊断产品。该检测无需在P3实验室进行，结果判定通过荧光信号进行，客观、准确；VSV在细胞内侵染、复制速度快，因此，整个检测过程可在16-24小时内获得结果并实现高通量化，适合于大规模筛查、确认人群中是否存在无症状或潜伏期患者；此外，研究者可以使用该方法，在储存的人血样本寻找曾被感染的证据，有助于追溯新冠肺炎的爆发时间和地点。而且该方法适用于不同类型样品的检测，如血清、呼吸道粘液以及肺灌洗液所含中和抗体进行检测，由于其不针对特定的抗体类型，尤其适用于感染早期的IgM以及粘膜IgA抗体的检测，有助于提高检测的特异性和敏感性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为新型冠状病毒S蛋白结构图；其中，SS:信号肽序列；Ectodomian：蛋白胞外区；TM：蛋白跨膜区；CT：蛋白胞内区；

图2为本发明重组VSV病毒的基因组结构示意图；其中，(A)为SΔ21蛋白假型化各重组VSV；(B)为S蛋白假型化各重组VSV；N:核衣壳蛋白；P:磷酸化蛋白；M：基质蛋白；G：囊膜蛋白；L：病毒RNA复制酶；S：CoV-2S蛋白(密码子优化)；SΔ21：新冠病毒SARS-CoV2 S蛋白突变体(S蛋白胞内区(CT)缺失21个氨基酸的变异体)； M

图3为不同机制的重组VSV病毒载体表达新冠病毒纤突蛋白鉴定示意图；不同制备机理表达新冠病毒S蛋白重组VSV感染VeroE6细胞，收集细胞裂解液后用特异性针对新冠病毒纤突蛋白S1亚基的抗体进行Western-blotting鉴定；其中，Lane1.未接种病毒细胞裂解液(阴性对照)；Lane 2.VSV

图4为VSV

图5为VSV

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中，根据病毒株序列(GenBank accession no.MN908947)按人细胞密码子优化的新冠病毒纤突蛋白全长序列如SEQ ID NO.1所示。根据病毒株序列(GenBankaccession no.MN908947)按人细胞密码子优化的新冠病毒纤突蛋白突变基因S

本发明的重组VSV病毒构建包括以下任一方法：

1、以野生型VSV病毒基因组为骨架(VSV

2、以高度弱化的M三位点突变VSV病毒基因组为骨架(pVSV

详见以下各实施例：

制备实施例1：优化SARS-CoV-2S蛋白胞内区段(cytoplasmic tail，CT)长度，使其高效嵌入VSV囊膜

本实施例所需SARS-CoV-2病毒S基因将按NCBI上公布的病毒株序列(GenBankaccession no.MN908947)进行全基因合成，合成的基因的密码子按人细胞密码子优化(SEQID NO.1)，该序列系首次公开发表，并经实验证明，该优化序列对比原始新冠病毒病毒株的纤突蛋白S基因序列，蛋白可以更高水平得到表达，这表现在我们成功地用该序列构建了基于重组水泡性口炎病毒的新型新冠疫苗。冠状病毒S蛋白结构如图1,它是一个I型跨膜蛋白，包含N末端的信号肽,胞外区(Ecotdomain,ET),跨膜区 (Transmembrane domain,TM)以及胞内区(cytoplasomic tail,CT)等四个部分。CoV-2 S蛋白羧基末端(AA1269-1273)存在一个KxHxx基序结构，本实施例对S蛋白羧基末端敲除其胞内段的21个氨基酸，从而消除了KxHxx基序结构，获得S蛋白突变体，命名为SΔ21(SEQ ID NO.2)。该S蛋白变异体能使S蛋白有效整合到VSV囊膜的胞内区段，因此用于后续重组VSV研制。

具体的，利用高保真PCR酶对密码子优化的S蛋白基因进行扩增，得相应的S蛋白基因；

引物设计：下划线为S蛋白基因对应序列

上游引物：5’CTAACAGATATCACG CTCGAG

下游引物：5’AACATGAAGAATCTG GCTAGC

对S蛋白羧基末端敲除其胞内段的21个氨基酸，得相应的S蛋白突变体SΔ21；

引物设计：下划线为S蛋白基因对应序列

上游引物：5’CTAACAGATATCACG CTCGAG

下游引物：

5’AACATGAAGAATCTG GCTAGC

制备实施例2：pVSV

1.构建pVSV

2.将S或SΔ21基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有MluI和XhoI 酶切位点，经双酶切后克隆到pVSV

制备实施例3：pVSV

1.构建pVSV

2.将S或SΔ21基因进行高保真PCR扩增，其5’和3’末端分别含有含有MluI和 XhoI酶切位点，经双酶切后克隆到pVSV

制备实施例4：重组VSV病毒制备

1.用表达T7 RNA多聚酶基因的痘病毒vTF 7-3感染BHK21细胞，感染浓度为 MOI＝5，1小时后去除痘病毒；

2.感染病毒的同时制备质粒转染混合液，由实施例2、3制备的重组质粒与辅助质粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L混合得到；

3.将粒转染混合液共转染步骤1的vTF 7-3感染BHK21细胞，转染后4小时左右更换细胞培养液；

4.用表达VSV G蛋白的质粒pVSV-G转染新鲜BHK21，得到的细胞称为BHK-G 细胞；

5.收集步骤3获得的细胞上清，用0.2um孔径的滤膜滤去vTF 7-3病毒，滤液加到步骤4制备的后续用VeroE6细胞上扩增病毒；观察细胞病变，2-3天后收获出现病变细胞上清，即获得相应的重组VSV病毒，分别为VSV

6.重组VSV病毒经空斑纯化以后，用VeroE6细胞进行扩增，鉴定后冻存备用。

鉴定实施例：

1.重组病毒结构蛋白的Western-blotting鉴定:将VSV重组病毒VSV

2.VSV

效果验证一：新型冠状病毒疫苗接种小鼠免疫效力的检测

对上述制备实施例2-3构建的4个重组VSV病毒接种转人ACE2基因C57小鼠，免疫效力评估的指标包括：特异性免疫(支气管肺泡灌洗液sIgA抗体)保护性抗体，采用S蛋白假型化慢病毒进行粘膜中和抗体检测。

1.动物分组与免疫

实验动物为体重约20g的转人ACE2基因C57小鼠，共分成5组，经滴鼻方式进行接种。如表1所示，实验组分为四组(组1-组4)，分别用上述重组病毒进行免疫，每组动物为各12只，分别接种10

2.实验动物样品的采集

免疫之前及免疫后第14天各组小鼠眼眶采血，分离血清；处死动物并收集支气管肺泡灌洗液，用于保护性粘膜免疫抗体检测，样品于-70℃保存。

3.特异性粘膜免疫保护性抗体检测

(1)上述采集样品于4℃下于2000r/min离心弃去红细胞及杂质；

(2)用DPBS缓冲液相应稀释样品,加入等体积的含100IU的表达GFP的新冠病毒假型化非复制型慢病毒，混合后置37℃培养箱中孵育1h，加入80％～90％满的96孔 293T-ACE2稳定细胞上；

(3)置于37℃孵育1-2h；弃去孵育液，并用DPBS洗1～2次，各孔加入新鲜无血清DMEM培养液，培养48小时，荧光显微镜观察，拍照，记录结果，有绿色荧光的为抗体阴性，无绿色荧光的为抗体阳性，计算中和抗体滴度。

5.通过对样品检测结果进行分析，结果显示:VSV

表1

效果验证二：人体免疫国产新冠疫苗中和抗体检测

1、将制备实施例2、3获得的pVSV

2.采集样品，可以是血液、呼吸道粘液等，灭活病毒后，4℃下于2000r/min离心弃去红细胞及杂质；

3.用DPBS缓冲液相应稀释样品，将收集到的全血血清按照1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320,1:640进行倍比稀释，以来自健康人血液为对照，加入等体积的含100PFU的VSV

4.37℃培养箱培养24小时，荧光显微镜观察，拍照，记录结果(如图5)，有绿色荧光的为抗体阴性，无绿色荧光的为抗体阳性，并计算抗体滴度；

5.通过对样品检测结果进行分析。接种国产新冠疫苗人血清中和抗体滴度检测结果如表2所示，该结果表明，用表达绿色荧光蛋白GFP的复制型假型化VSV

表2

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用

<130> DD16269

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 新冠病毒(SARS-CoV2 Wuhan-Hu-1)

<400> 1

atgttcgttt tccttgttct gttgcctctc gttagtagcc aatgcgtcaa ccttactact 60

agaacccagc tccctccagc atataccaac tctttcacca ggggcgtata ttacccggac 120

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actctggaga tattggacat tacaccatgt tctttcggcg gtgtgtctgt cattactccg 1800

ggcacgaata ctagcaacca ggtagccgtg ctgtaccaag acgtgaattg cacagaggtt 1860

cccgtcgcaa ttcacgctga ccagctgacc cccacgtgga gggtttacag cactggtagt 1920

aacgtcttcc agacgagagc cggttgcttg atcggagcgg aacatgtgaa taactcctac 1980

gagtgcgaca tccccatcgg agccggtata tgcgcctctt atcagacaca aactaactca 2040

cccaggagag cccgcagtgt ggcttctcaa agcattatag catacactat gtctcttggt 2100

gccgaaaatt ccgtggccta ttctaacaat tcaatcgcca tcccaaccaa cttcacaatt 2160

agcgtgacta ccgaaatact gcctgtgagc atgacgaaaa ccagcgtaga ctgcactatg 2220

tatatctgtg gagactccac tgagtgctcc aaccttctcc tgcagtacgg tagcttctgt 2280

acccaattga accgcgccct tacaggcatc gctgttgagc aagataagaa tacccaggaa 2340

gtttttgccc aggttaagca gatatacaaa acaccgccca ttaaggactt cggaggcttc 2400

aacttctctc agatactgcc tgacccctcc aagccatcaa aacgcagctt cattgaggac 2460

ctcttgttca acaaagtgac tctggctgat gctggcttca ttaagcagta cggagattgc 2520

ctgggagata ttgctgccag ggacctcatc tgcgcccaga agtttaatgg cctgacagtc 2580

ttgcccccac ttctgacaga cgagatgatt gctcagtaca catctgccct cctcgctggc 2640

accataacat ccggatggac atttggtgct ggtgctgccc tccagattcc cttcgcaatg 2700

cagatggcgt atcgctttaa cggcatcggt gtcacacaaa acgtgttgta tgagaaccaa 2760

aagctcatcg ctaaccagtt taattctgct attggtaaga ttcaggacag cctgtcatca 2820

accgcgtctg cccttggtaa gttgcaggac gtggtgaacc agaatgctca ggctttgaat 2880

actctggtga agcaactctc ttcaaatttc ggcgctatct cttctgtgtt gaacgacatc 2940

ctgagtcgcc ttgataaggt ggaagctgaa gttcaaattg atagattgat tactggcagg 3000

ctccagtctt tgcagaccta cgttacacag cagctgatta gggcggctga aattagagct 3060

tccgccaatc tggctgcaac caagatgtcc gaatgcgtcc tgggtcagtc aaagcgcgtt 3120

gacttttgtg gtaaaggcta ccacctcatg tcatttcccc agtcagcacc tcacggagta 3180

gtgttcctcc acgtcaccta cgttccagca caggaaaaga attttaccac tgcgccggca 3240

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cattggttcg tcacacagag aaacttctat gagcctcaga tcattaccac cgacaataca 3360

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cttcagccag aactggatag cttcaaggaa gaattggaca aatatttcaa aaatcacact 3480

tcacccgatg tggacctggg tgacattagt ggtatcaatg cgtccgtggt caatattcaa 3540

aaagagattg acaggctcaa cgaagtggcc aagaacctga acgaaagtct tatcgatctg 3600

caagaattgg gaaagtatga gcagtacatc aagtggccgt ggtacatttg gttgggtttt 3660

atcgccggtc tgatcgccat cgttatggtt accattatgc tttgctgcat gacgagctgt 3720

tgctcctgtc tgaagggatg ctgctcttgc ggatcatgtt gcaagttcga tgaagacgat 3780

agcgaaccag ttctgaaggg cgtcaagctg cattacacat aa 3822

<210> 2

<211> 3759

<212> DNA

<213> 新冠病毒(SARS-CoV2 Wuhan-Hu-1)

<400> 2