一种枯草芽孢杆菌及其在乳糖酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程与微生物改造技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在乳糖酶生产中的应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶（β-D半乳糖苷水解酶，β-D-galactosido-galatohydrolase，EC3.2.1.23）通常被称为乳糖酶（Lactase）。这种酶能将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用（张树政等，酶制剂工业，科学出版社，1984，p818-819）。水解活性通过对牛奶和乳制品的乳糖进行水解，防止乳糖不耐症且增加甜度，糖转移活性用于制造低聚半乳糖，该低聚半乳糖可促进作为人体肠内有效微生物的乳酸菌的生长。

乳糖酶最初是利用其水解乳糖的特性降低乳制品中的乳糖含量，后来主要用来治疗乳糖不耐受症、处理加工牛乳、乳清等，以及生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及减少环境污染等，近年来，利用乳糖酶生产低聚半乳糖也受到重视。由此可见，乳糖酶无论是在工业生产还是在食品行业都有着广泛的应用前景。

乳糖酶广泛存在于植物、微生物以及动物肠道细胞中，目前工业生产的乳糖酶主要来源于曲霉（

目前乳糖酶并未在食品工业中得到广泛的应用，还有一个主要原因就是目前乳糖酶的产量较低，销售价格过高，添加成本昂贵。目前乳糖酶的表达系统一般采用大肠杆菌系统、酵母系统和乳酸菌表达系统等。其中，大肠杆菌系统虽然能表达，但大多数得到的是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基中仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质，且后续纯化复杂，得率低，因此该表达系统并不适合于大量生产重组乳糖酶。酵母系统表达的乳糖酶普遍耐热性差，适用范围窄，不能满足食品工业多方面的需要，且酵母一般用甲醇诱导表达外源蛋白，生产具备一定的危险性。乳酸菌表达系统表达产量低，且有时不分泌表达。因此，寻找一种合适的表达系统显得至关重要。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产乳糖酶的枯草芽孢杆菌突变菌及其应用。所述突变菌株是通过紫外诱变的方法筛选获得的，其乳糖酶产量得到明显提高，有利于大幅降低该酶的生产成本，市场前景广阔。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌，其携带有表达乳糖酶基因的重组载体。

所述乳糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种突变菌株，是以上述枯草芽孢杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述的突变菌株为枯草芽孢杆菌GAL-108-9（

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌突变菌株在乳糖酶生产中的应用。

本发明还提供了一种乳糖酶的生产方法，是以上述枯草芽孢杆菌突变菌为发酵菌株。

本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌GAL-108-9能显著提高乳糖酶的产量，摇瓶发酵酶活能达到255 U/mL，比出发菌株提高了34.2%；20L罐发酵酶活高达458.5 U/mL, 较出发菌提高了31%。多次发酵试验也证明突变菌GAL-108-9产乳糖酶的水平保持稳定。该突变菌株产乳糖酶的最适作用pH值为7.0，最适作用温度为45℃，较出发菌株没有发生改变，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于乳糖酶的生产，有利于降低乳糖酶的生产成本，从而促进该酶的广泛应用。

附图说明

图1为本发明构建的枯草芽孢杆菌工程菌F4-ly108发酵上清液 SDS-PAGE电泳检测图，其中，M为蛋白质分子量Marker；箭头所指为重组表达的乳糖酶；

图2为重组表达的乳糖酶作用pH-相对酶活曲线图；

图3 为重组表达的乳糖酶作用温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

一、本发明实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：

LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂2%；

LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；

1*最低盐溶液：K

GM I溶液：1*最低盐溶液 95.6 ml，20%葡萄糖 2.5 ml，5%水解酪蛋白 0.4 ml，10% 酵母粉汁 1 ml；

GM II溶液：1*最低盐溶液96.98 ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.08 ml，10%酵母粉汁0.04 ml，1 M MgCl

种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K

发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl

二、本发明实施例中所述乳糖酶酶活的测定方法如下：

1、酶活力单位定义

在 30℃，pH值为6.5的条件下，每分钟降解邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷溶液释放1umol邻硝基酚所需的酶量定义为一个酶活力单位（IU）。

2、原理

乳糖酶能将邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖降解成邻硝基酚。通过420nm比色测定释放的邻硝基酚的量，可以计算反应液中乳糖酶的活力。

3、标准曲线的制定

配置浓度分别为0mmol/mL，0.02mmol/mL，0.04mmol/mL，.06mmol/mL，0.08mmol/mL，0.10mmol/mL，0.12mmol/mL ，0.14mmol/mL的邻硝基酚标准溶液，420nm处比色测定吸光度。以邻硝基酚浓度为X轴，吸光值为Y轴，绘制标准曲线。

4、酶活测定

取1mL预稀释好的酶液，加入5mL 30℃预热的底物溶液，30℃反应10min，然后加入2mL 5%碳酸钠溶液终止反应，最后测定OD420值。

5、计算

X=(△A-C

式中：X——样品的酶活力（U/g或U/ml）

△A——酶反应液的吸光度-酶空白样的吸光度

K——标准曲线的斜率

C

8——反应试剂的总体积（mL）

n——稀释倍数

10——反应时间10min。

实施例1 重组表达乳糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建

1.1 提取环状芽孢杆菌的总基因组DNA

将环状芽孢杆菌（

1.2 乳糖酶序列克隆

（1）以实施例1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用表1中所述引物进行PCR扩增，扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30s；50℃ 40s，72℃ 3min，30个循环；72℃ 7min。将PCR产物进行核酸电泳，显示有三条特异性条带，利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR回收产物分别连接到质粒pVL-100，获得重组质粒pLY108。

表1 启动子扩增所用引物

1.3测序分析

将获得的重组质粒pLY108送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示，扩增得到的乳糖酶基因序列为SEQ ID NO：2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1，将该基因命名为GAL。

1.4转化

将新鲜活化的枯草芽孢杆菌1A751（Bacillus subtilis 1A751 (apr-, his-,npr-, eglSΔ102, bglT/bglSΔEV)）（Wolf M, et al. Microbiology. 1995 141:281-90）宿主由LB平板接种到5 mL GMⅠ溶液中，30℃、125 rpm振荡培养过夜；第二天取2 mL转接到18 mL GMⅠ溶液中，37℃、250 rpm培养3.5 h；再取上一步骤的2mL培养液转接到18 mL GMⅡ溶液中，37℃、125 rpm培养 90 min；5000 rpm、10 min离心收集菌体，用2 mL GMⅡ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0.2 mL感受态细胞中加入适量实施例1中的重组质粒pLY108，37℃、200 rpm 振荡培养30 min后涂布含5µg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。

1.5发酵验证

分别挑取平板上的单菌落接种于发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K

结果显示：其中一株重组菌发酵上清液中乳糖酶酶活高达190 U/mL，显著高于其他重组菌。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌F4-ly108（

1.6 20L罐发酵验证

将枯草芽孢杆菌F4-ly108接种于0.6L种子培养基（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%）中，34℃、210 rpm振荡培养8 h；将0.6L种子培养液完全接种到含12L发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K

结果显示，枯草芽孢杆菌F4-ly108菌株发酵上清液酶活高达350 U/mL。从而说明本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌F4-ly108能高效超表达外源乳糖酶基因GAL。

实施例2 乳糖酶高产菌株的紫外诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以实施例1构建得到的枯草芽孢杆菌F4-ly108为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其乳糖酶的产量。

2.1 菌悬液制备

将枯草芽孢杆菌F4-ly108在含5μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨斜面培养基上划线接种，37℃培养48 h；用5 mL 0.85%的生理盐水将斜面上的菌全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3 min收集菌体；去上清，用10 mL 0.85%生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10

2.2 紫外诱变处理

打开9 W紫外灯开关，预热约30 min。取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水按照10倍稀释法梯度稀释成10

挑取平板上长出的单菌落，在含5 μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；挑取单菌落，划线接种于含5 μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨斜面保种；共富集筛选到75株突变菌株。

摇瓶初筛

将富集到的75株突变菌株与出发菌株枯草芽孢杆菌F4-ly108同时在发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K

申请人按照上述方法继续进行了11轮紫外诱变筛选，最终获得1株乳糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌GAL-108-9（

罐发酵筛选

挑取突变菌株枯草芽孢杆菌GAL-108-9单菌落接种于0.6 L种子培养基（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%）中，34℃、210 rpm振荡培养8 h；将0.6 L种子培养液完全接种到含12 L发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K

结果显示，突变菌株枯草芽孢杆菌GAL-108-9的发酵酶活高达458.5 U/ml，较出发菌株提高了31%，取得了意料不到的技术效果。

多次发酵试验也证明突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9产乳糖酶的水平保持稳定。

实施例3 乳糖酶的酶学性质分析

3.1 最适pH分析

分别用pH值为2、2.5、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9的缓冲液分别稀释出发菌和突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9发酵上清液，在30℃条件下测定发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果如图2所示。结果表明，本发明提供的突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9产乳糖酶的最适作用pH为7.0，与出发菌产乳糖酶的最适作用pH值一致。

3.2 最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH 6.5的条件下测定出发菌和突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，结果如图3所示。结果表明，本发明提供的突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9产乳糖酶的最适作用温度为45℃，与出发菌产乳糖酶的最适作用温度一致。

综上，本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌GAL-108-9能显著提高乳糖酶的产量，20L罐发酵酶活高达458.5 U/mL, 较出发菌提高了31%，且该突变菌株产乳糖酶的酶学性质较出发菌没有发生改变。

申请人已于2020年6月19日将上述突变菌枯草芽孢杆菌GAL-108-9（

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

潍坊康地恩生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在乳糖酶生产中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> PRT

<213> 环状芽孢杆菌(Bacillus annularis)

<400> 1

Val Ile Asp Lys Thr Val Ala Asp Asn Arg Leu Leu His Gly Gly Asp

1 5 10 15

Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Leu Asp Tyr Pro Glu Ile Leu Lys Asp Asp

20 25 30

Leu Arg Leu Met Lys Leu Ala Lys Ala Asn Thr Phe Thr Leu Gly Val

35 40 45

Phe Ala Trp Ser Ala Leu Glu Pro Thr Glu Gly Glu Phe Gln Phe Asp

50 55 60

Trp Leu Asp Glu Arg Ile Glu Ala Ile Tyr Gln Met Gly Gly Arg Val

65 70 75 80

Ile Leu Ala Thr Pro Ser Gly Ala Arg Pro Ala Trp Met Ser Lys Lys

85 90 95

Tyr Pro Glu Val Leu Arg Thr Thr Glu Asn Arg Met Lys Met Leu His

100 105 110

Gly Gly Arg His Asn His Cys Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Glu Lys

115 120 125

Val Ala Ile Ile Asn Arg Lys Leu Ala Glu Arg Tyr Gly Asn His Pro

130 135 140

Ala Leu Leu Met Trp His Ile Ser Asn Glu Tyr Ser Gly Asp Cys His

145 150 155 160

Cys Gly Leu Cys Gln Asp Asn Phe Arg Asn Trp Leu Lys Lys Lys Tyr

165 170 175

Gly Thr Leu Asp Lys Leu Asn His Ala Trp Trp Gly Pro Phe Trp Ser

180 185 190

His Thr Ile Thr Asp Trp Ser Glu Val Glu Ser Pro Ser Ser Ile Gly

195 200 205

Glu Ser Met Val His Gly Leu Asn Leu Asp Trp Lys Arg Phe Val Thr

210 215 220

Asp Gln Thr Ile Asp Phe Tyr Lys His Glu Ile Val Pro Leu Arg Glu

225 230 235 240

Ile Ser Pro Ser Ile Pro Ile Thr Thr Asn Phe Met Ala Asp Thr His

245 250 255

Asp Leu Ile Pro Phe Gln Ser Leu Asn Tyr Ser Glu Phe Ala Lys His

260 265 270

Val Asp Ile Val Ser Trp Asp Cys Tyr Pro Ala Trp His Asn Asp Trp

275 280 285

Glu Glu Thr Lys Asp Leu Ala Ala Lys Val Gly Phe Ile Asn Asp Leu

290 295 300

Tyr Arg Ser Leu Lys Gln Gln Pro Phe Leu Ile Met Glu Ser Thr Pro

305 310 315 320

Ser Gly Val Asn Trp His Asp Val Asn Lys Thr Lys Arg Pro Gly Met

325 330 335

His Leu Leu Ser Ser Met Gln Phe Ile Ala His Gly Ser Asp Ser Val

340 345 350

Leu Tyr Phe Gln Trp Arg Lys Ser Arg Gly Ser Ser Glu Lys Phe His

355 360 365

Gly Ala Val Val Asp His Asp Asn Ser Glu Thr Ser Arg Val Phe Gln

370 375 380

Glu Val Ser Ala Val Gly Gly Ala Leu Glu Lys Ile Ala Glu Val Lys

385 390 395 400

Gly Thr His Lys Gln Ala Arg Val Ala Ile Val Tyr Asp Trp Glu Asn

405 410 415

Asn Trp Ala Leu Asn Asp Ala Gln Gly Phe Ser Asp Ser Thr Lys Gln

420 425 430

Tyr Pro Gln Thr Leu Gln Lys His Tyr His Ser Phe Trp Lys Lys Asp

435 440 445

Ile Ser Val Asp Ile Val Thr Leu Asn Gln Glu Leu Ala Ser Tyr Asp

450 455 460

Leu Val Ile Ala Pro Met Leu Tyr Met Met Ser Leu Asp Thr Ile Ser

465 470 475 480

Lys Leu Glu Asn Tyr Val Ala Asn Gly Gly Thr Leu Val Ser Ser Tyr

485 490 495

Ile Ser Gly Leu Val Asn Glu Thr Asp Leu Ala His Leu Ser Gly Trp

500 505 510

Pro Ala Thr Leu Lys Arg Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Thr Asp

515 520 525

Thr Leu Tyr Pro Lys Asp Arg Asn Thr Leu Thr Tyr Asn Gly Lys Gln

530 535 540

Tyr Glu Ile Lys Asp Tyr Cys Thr Ile Phe Glu Arg Lys Glu Ala Asn

545 550 555 560

Ile Leu Ala Thr Tyr Met Glu Asp Phe Tyr Gln Gly Asn Pro Ala Val

565 570 575

Val Glu Asn Cys Tyr Gly Lys Gly Lys Ala Tyr Phe Ile Gly Ala Arg

580 585 590

Thr Glu Gln Ala Phe Leu Asp Asp Phe Tyr Glu Glu Leu Gln Lys Glu

595 600 605

Gly Asn Leu Asp Ser Glu Arg Glu Ile Leu His Lys Glu Gly Val Ser

610 615 620

Val Gln Arg Arg Asp Ser Ala Glu Cys Tyr Tyr Leu Phe Val Met Asn

625 630 635 640

Phe Thr Glu Gln Lys Gln Thr Val Thr Leu Lys Glu Ser Phe Phe Asp

645 650 655

Leu Leu Thr Gln Glu Ile Lys Gln Glu Gln Ile Glu Leu Leu Pro Tyr

660 665 670

Glu Val Arg Val Leu Lys Arg Glu Lys

675 680

<210> 2

<211> 2046

<212> DNA

<213> 环状芽孢杆菌(Bacillus annularis)

<400> 2

gtgatagata aaacagtagc agataatcgc ttattgcatg gtggagatta taatccagat 60

caatggctcg attatccaga aatattgaaa gatgatttac gattgatgaa attagcaaaa 120

gcaaatacgt tcactttagg ggtatttgca tggagtgcac ttgaaccaac agaaggggaa 180

ttccagtttg actggctcga tgaaagaata gaggccattt atcaaatggg cgggagagtt 240

atcttagcta ctccaagtgg cgctagacca gcatggatgt ctaagaagta tccagaagtc 300

ttaagaacca ccgaaaatcg catgaaaatg ttacatgggg gacgccataa tcattgtctt 360

tcttccccta tctatcgtga aaaagtagca attattaata gaaagctagc ggagcgctat 420

ggaaatcatc ctgcgttact aatgtggcat atttccaatg agtatagcgg cgattgtcac 480

tgtggacttt gccaagataa tttccgtaat tggctgaaaa agaagtatgg gaccttagat 540

aaactaaatc atgcttggtg gggaccattt tggagtcata cgatcacaga ttggtcagaa 600

gttgaatctc cttcttccat tggagaaagt atggttcatg gtttgaattt agattggaaa 660

cgttttgtca ctgaccaaac aattgatttt tacaagcatg aaatagtgcc attaagggaa 720

atctctccat ctatccctat tacaacaaac tttatggcag acacgcatga tttaataccc 780

tttcaaagtt tgaattatag tgagtttgca aagcatgtgg atattgttag ttgggattgc 840

tatcctgctt ggcacaatga ttgggaggaa acaaaggact tagctgcaaa agttggtttt 900

atcaatgatt tgtatcgctc tttaaaacaa cagccttttc tcattatgga aagtacacca 960

agtggcgtca actggcatga tgtgaataaa acgaagagac ctggtatgca tttgctatcc 1020

tccatgcaat ttatcgcaca tggttcagac agtgttctgt attttcaatg gagaaaatca 1080

agaggatcct ccgagaaatt tcatggggca gtagtggatc atgataatag tgaaacgagt 1140

cgagtctttc aagaggtttc agcagttggt ggagctctag agaagattgc tgaagtaaag 1200

ggaacacata aacaagcaag agtagcaatt gtatatgatt gggaaaataa ctgggcgtta 1260

aacgatgcac aaggattctc cgattcaaca aagcaatatc ctcaaacgtt gcaaaagcat 1320

tatcacagtt tttggaaaaa ggatattagt gtcgatatag ttacattaaa tcaagagctt 1380

gcttcctatg atttagttat tgctccaatg ctctacatga tgtctcttga tacaatttct 1440

aaattagaaa actatgttgc aaatggagga acacttgtaa gttcatatat tagcggcctt 1500

gttaatgaaa cggatcttgc ccatttatca ggttggccgg caacgctaaa acgaatattt 1560

ggcattgatg taaaagaaac agatactctt tatccaaaag atagaaatac ccttacctat 1620

aacgggaagc aatatgaaat aaaagattat tgcaccattt ttgaaaggaa agaagcgaat 1680

attttagcga cgtatatgga ggacttttat caagggaatc ctgctgttgt agaaaactgc 1740

tacgggaaag gaaaagccta ttttataggg gcaagaacgg aacaggcctt tttagatgat 1800

ttttatgagg aattgcaaaa agaaggtaat cttgacagcg aaagggaaat tctgcataaa 1860

gaaggtgttt ccgtccaaag aagggattcg gctgagtgct actatttatt tgtcatgaat 1920

tttacagaac aaaagcaaac agtaacgtta aaagaatcct ttttcgattt acttacacaa 1980

gaaataaagc aagaacagat agaacttttg ccatatgaag taagggtgtt aaaaagagaa 2040

aaataa 2046