水稻抽穗期基因DHD3功能以及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域和植物育种领域，更具体涉及水稻抽穗期基因

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。水稻的产量与我国的粮食安全息息相关。随着人口的不断增加，耕种面积的逐渐减少，增加水稻的单位面积产量一直是育种工作者们的重要任务。水稻的产量受多种遗传因素、环境因素及其相互作用的影响。水稻开花期(又称抽穗期)是影响水稻产量的重要农艺性状之一，不同的水稻品种的抽穗期可以适应不同地区的光照气温条件，从而获得最佳的产量。水稻植株较晚抽穗可以使植株获得较长时间的营养生长积累，在生殖生长阶段获得更充足的养分发育出更大的稻穗及更多的单穗籽粒数，从而提高水稻的单位面积产量。因此，挖掘延迟水稻抽穗时间的基因，探究其作用机制及与环境因素的相互作用关系，并以此开发相应的生物技术，如转基因、分子标记辅助育种或基因编辑，对水稻品种进行改良，获得合适的抽穗期水稻新品种并提高单位面积的水稻产量，对于水稻育种及改良工作具有重要意义。

水稻作为一种短日照植物，其开花时间主要受到日照长度，即光周期的影响。现有报道的调控水稻抽穗期的基因大多与光周期有关。除光周期外，营养、温度、干旱、盐和激素等都对水稻的抽穗期有影响。短日照下，

寻找更多与环境影响相关的抽穗期功能基因，解析其分子机制和与其他抽穗期基因的相互关系，完善抽穗期的调控网络，对于优化水稻抽穗期的品种培育及具有重要意义。

发明内容

本发明人通过大规模的水稻转录因子过表达库的筛选，经过筛选从抽穗期表型中选取的了抽穗期相关蛋白（DHD3），并通过后续实验研究表明当过表达

本发明首先提供DHD3蛋白或其编码基因在在植物育种中的应用，所述植物育种是下述任一个、两个、三个、四个或五个方面：

P1、调控植物抽穗期；

P2、调控植物穗长；

P3、调控植物穗粒数；

P4、调控植物初级枝梗数；

P5、调控植物次级枝梗数；

所述DHD3蛋白为如下任一：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

（A3）与（A1）-（A2）中任一所限定的氨基酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

（A4）在（A1）-（A3）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；

优选方式中，所述蛋白标签为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签。

其中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。

在具体实施方式中，在所述植物中所述DHD3蛋白的表达量和/或活性增加，所述植物的抽穗期增长和/或穗长变长和/或每穗粒数变多和/或初级枝梗数增多和/或次级枝梗数增多。

具体地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步地，所述禾本科植物为稻属植物；更加具体地，所述稻属植物为水稻；优选地，所述植物是禾本科植物，更优选为水稻、小麦。

本发明还提供一种培育抽穗期增长和/或穗长变长和/或每穗粒数变多和/或初级枝梗数增多和/或次级枝梗数增多的植物的方法，包括使受体植物中DHD3蛋白的表达量和/或活性增加的步骤；

所述DHD3蛋白为如下任一：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

（A3）与（A1）-（A2）中任一所限定的氨基酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

（A4）在（A1）-（A3）中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；

优选方式中，所述蛋白标签为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签。

在具体实施方式中，在受体植物中导入能够过量表达DHD3蛋白的核酸分子，得到转基因植物；或通过含有所述表达DHD3蛋白的核酸分子的植物材料作为父本或母本，通过杂交的方式导入受体植物中。

优选地，所述DHD3蛋白的核酸分子为如下任一：

（B1）SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（B2）在严格条件下与（B1）限定的DNA分子杂交且编码所述DHD3蛋白的DNA分子；

（B3）与（B1）-（B2）中任一限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述DHD3蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。

在通过转基因实现的方式中，所述导入能够过量表达DHD3蛋白的核酸分子是通过重组表达载体实现，其中含有的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达DHD3的DNA，该DNA不但可包括启动

构建含有所述

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。

所述重组表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的具体实施方式中，所述重组表达载体具体为pCAMBIA1390, 其结构如图1所示。本发明的重组载体为在pCAMBIA1390-

具体地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步地，所述禾本科植物为稻属植物；更加具体地，所述稻属植物为水稻；优选地，所述植物是禾本科植物，更优选为水稻、小麦。

进一步地，所述方法获得受体植物的第一代的基础上，还包括培育获得其子代。

本发明通过筛选找到抽穗期相关蛋白基因

附图说明

图1为pCAMBIA 1390 载体图谱。

图2中A为野生型水稻Kitaake和

图2中B为野生型水稻Kitaake和

图2中C为野生型水稻Kitaake和

图2中D为野生型水稻Kitaake和

图2中E为野生型水稻Kitaake和

图2中F为野生型水稻Kitaake和

图2中G为野生型水稻Kitaake和

图2中H为野生型水稻Kitaake和

**表示在

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的水稻Kitaake（也称为野生型水稻，简称WT）：记载在如下文献中，GaoH, ZhengXM, WanJM., et al.

pCAMBIA1390 载体为商业化载体，公众可通过商业渠道或相关机构获得，也可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

下述实施例中使用的的农杆菌为根癌农杆菌EHA105 (

实施例1、抽穗期相关蛋白DHD3可以调控水稻穗长、每穗粒数、初级枝梗数以次级枝梗数

发明人通过大规模的水稻转录因子过表达库的筛选，经过筛选从抽穗期表型中选取的了抽穗期相关蛋白，具体是来源于水稻Kitaake (

一、过表达载体pCAMBIA 1390-

1、

提取野生型Kitaake总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以

引物如下：

2、

用限制性内切酶Pst I单酶切pCAMBIA1390 载体，回收约10820bp的线性质粒，得到载体大片段，pCAMBIA1390 载体环状载体图谱如图1所示。利用Clontech公司的In-Fusion酶（www.clontech.com，货号：ST0344）将10820bp的线性质粒与上述步骤1获得的

经测序确认，重组质粒pCAMBIA1390-

二、构建

1、转基因植株的构建

将重组质粒pCAMBIA1390

2、

将EHA105/pCAMBIA1390

（1）用含50μmol/L卡那霉素的液体LB培养基悬浮培养重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1390

（2）将培养至一个月的水稻Kitaake的成熟胚胚性愈伤组织与步骤（1）的稀释菌液混合，侵染30min，采用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后转入N6固体共培养培养基（N6混合培养基配方为：硝酸钾(2800 mg/L)，硫酸铵(463 mg/L)，磷酸二氢钾(400 mg/L)，硫酸镁(MgSO

（3）将步骤（2）的共培养处理后的愈伤组织接种在含有质量浓度为150mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基（向N6固体培养基中加入潮霉素得到的培养基，该N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为150mg/L）上培养进行第一次筛选。

（4）在第一次筛选开始的第16天挑取健康愈伤组织转入含有质量浓度为200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基（向N6固体培养基中加入潮霉素得到的培养基，该N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为200mg/L）上培养进行第二次筛选，每15天继代一次，共继代1次，所得健康愈伤组织即为抗性愈伤组织。

（5）挑取步骤（4）获得的抗性愈伤组织转入含有质量浓度为150mg/L潮霉素的分化培养基上（分化培养基：6-BA2mg,NAA0.2mg, N6混合培养基 4g,水解酪蛋白1g,肌醇0.1g，蔗糖25g,山梨醇2.4g，琼脂粉7g，去离子水补至1L）进行分化培养，在24℃培养45d（此时植株地上部分高度约为15cm），打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为转pCAMBIA1390

3、转

分别提取T0代和T1代转

引物如下：

1390-F：5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'；

1390-F对应于图1载体上的10707-10730 bp，

对于某一T0代植株，如果该植株及其T1代植株PCR鉴定均为阳性，则证明该植株为纯合的

4、植株的mRNA表达量的检测

为检测转基因后代的

实时定量PCR鉴定所使用的引物如下：

部分检测结果如图2中C所示。与野生型水稻相比，转

三、转

1、抽穗期调查

将转

2、穗部性状调查

取待测植株（每个株系20株），种植收获后统计穗长、每穗粒数、初级枝梗数以及次级枝梗数。结果图2中B、E-H所示。结果表明，与野生型相比，

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>水稻抽穗期基因DHD3功能以及应用

<160> 3

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 1

MGSKKRSPQHPAAAAPPPAVGGGGGGEVSGDGGASTANGPVVPKPSEVAPFLTKVYDMVSDPATDNVISWAEGGGSFVIWDSHAFERDLHRHFKHSNFTSFIRQLNTYGFRKVHPDRWEWANEGFIMGQKHLLKTIKRRKKSSQESPSEIQKAPVKTAPGTENIEIGKYGGLEKEVETLKRDKALLMQQLVDLRHYQQTSNLEVQNLIERLQVMEQNQQQMMALLAIVVQNPSFLNQLVQQQQQQRRSNWWSPDGSKKRRFHALEQGPVTDQETSGRGAHIVEYLPPVPETSGQVNPVEGAICSANSQPVPSPAVATPMDMQTSNVADTLGSSEEPFADNSTLHEWDDNDMQLLFDDNLDPILPPFENDGQMGPPLSVQDYDFPQLEQDCLMEAQYNSNNPQYADVITEA

<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

ATGGGCTCTAAGAAGCGGTCGCCTCAGCATCCGGCCGCCGCGGCGCCCCCTCCCGCCGTCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGAGGTCTCCGGCGATGGTGGCGCCTCGACGGCGAACGGGCCGGTGGTGCCGAAGCCGTCGGAGGTGGCGCCGTTCCTGACGAAGGTGTACGACATGGTCTCGGACCCCGCGACCGACAACGTTATCTCGTGGGCCGAGGGCGGCGGCAGCTTCGTGATCTGGGACTCGCACGCCTTCGAGCGCGACCTCCACAGGCACTTCAAGCACAGCAATTTCACCAGCTTCATACGCCAGCTCAACACCTATGGATTTCGTAAAGTTCACCCTGATAGATGGGAGTGGGCCAATGAAGGTTTTATTATGGGCCAAAAACATCTTCTGAAGACCATTAAGAGGAGGAAGAAGTCTTCTCAGGAATCACCTAGCGAGATACAGAAGGCGCCTGTCAAAACTGCACCTGGTACTGAAAATATTGAGATAGGAAAATATGGTGGCCTTGAAAAGGAGGTTGAAACCCTTAAGAGGGATAAAGCTCTTCTCATGCAGCAGCTTGTAGATCTCAGGCACTACCAGCAAACATCTAACCTTGAAGTGCAGAATTTAATTGAACGGCTTCAAGTAATGGAACAGAACCAGCAGCAGATGATGGCACTTCTAGCAATCGTTGTCCAGAATCCTAGTTTTCTCAACCAGCTTGTGCAGCAACAGCAGCAGCAGCGCAGATCCAACTGGTGGAGTCCTGATGGAAGCAAGAAAAGGAGATTTCATGCTCTTGAGCAGGGCCCTGTAACTGATCAGGAGACCTCTGGCCGTGGGGCACATATTGTTGAATATCTCCCACCTGTCCCAGAAACATCAGGTCAAGTAAATCCAGTGGAAGGAGCCATTTGTTCGGCCAACTCACAACCAGTTCCAAGTCCTGCAGTTGCCACACCCATGGACATGCAAACGTCTAACGTTGCTGATACTCTCGGTTCATCTGAGGAGCCTTTCGCTGATAACTCTACTCTACATGAATGGGATGATAACGACATGCAGCTTCTGTTTGATGATAACCTAGACCCAATACTTCCACCATTTGAGAATGATGGTCAAATGGGCCCTCCTTTGAGTGTTCAAGATTATGATTTTCCGCAGTTAGAGCAGGATTGTCTGATGGAAGCACAATATAACTCCAACAATCCTCAATATGCTGATGTCATTACCGAAGCTTGA

<210> 3

<211> 3832

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

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