一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型的构建方法，属于动物模型构建技术领域。

背景技术

神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛，自发性疼痛及痛觉超敏是其主要临床特征，其发病机制复杂，有多种病理生理学特征。

现有技术中通过物理和化学因素造成神经损伤，进而模拟临床各种原因导致的神经病理性疼痛。比如通过坐骨神经慢性卡压或结扎等方法，模拟物理因素及炎症因素建立外周神经损伤的神经病理性疼痛动物模型，其卡压的松紧程度、力度等控制只能通过人为观察进行判断，存在一定的人为误差，难以均衡，不能完全确保损伤程度的一致性。化学因素造成神经损伤的情形包括通过高血糖对神经损伤建立糖尿病周围神经病变的病理性疼痛动物模型。

由于引起神经病理性疼痛的原因不同，尽管其临床表现相似，但其发病机制及治疗策略存在明显差异。当前，随着热效应临床治疗方式的广泛应用，随之产生的相关治疗后神经病理性疼痛的情况也随之增多。常见的热效应治疗方式包括微波消融术，射频消融术，经皮激光消融术，高强度聚焦超声，其工作机理均是通过不同的能量方式产生局部热效应作用于靶组织，通过高温作用使组织凝固坏死达到灭活细胞和组织的目的。由于治疗靶点与神经的密切关系及手术操作相关的问题，术后神经损伤引起的疼痛的发生难以避免。

尽管热损伤后神经痛存在，但少见神经热损伤后修复及治疗相关研究，其根本原因在于缺乏神经热损伤相关临床模型。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型的构建方法，实现以下发明目的：构建一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型，处理后5天形成机械性刺激神经痛，处理后7天形成热刺激神经痛，且神经痛的持续时间长。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型的构建方法，对成年雄性SD大鼠进行射频热凝处理；所述射频热凝处理的方法为采用双极射频模式，射频温度为65℃，脉率2Hz、脉宽20ms，持续时间为 1min，进行两次射频热凝处理，间隔5分钟。射频位置为大鼠坐骨神经分叉向头端方向0.5cm处和1cm处。

射频热凝针接触坐骨神经后，出现足部抽动，表明到达预设位置。

射频热凝处理之前通过超声定位大鼠坐骨神经分叉处向头端方向0.5cm处和1cm处的位置和深度，并在皮肤上做好标记。

在进行射频热凝之前对大鼠饲养5天；所述饲养方法为选取成年雄性SD大鼠，动物房及实验室的温度控制为23-26℃，相对湿度控制为40-60%，保证动物的生物节律，实行12小时的光照/黑暗循环环境设定，并自由提供食物和水；动物行为学实验均在白天进行，实验前3天每天将大鼠置于观察箱中适应30分钟。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）本申请通过射频热凝技术创建了一种稳定的热损伤后病理性神经疼痛的动物模型，可以应用于热损伤后神经修复和后续临床治疗研究。

（2）本发明构建得到热损伤致神经病理性疼痛动物模型，对机械性痛刺激反应敏感性和对热痛刺激的敏感性均提高，射频热凝处理后大鼠的行为学变化符合神经病理性神经疼痛的特征，射频热凝处理后5天形成机械性刺激神经痛，射频热凝处理后7天形成热刺激神经痛，神经痛持续至射频热凝处理后30天。光镜见坐骨神经损伤表现，背根神经节见Nav1.8（voltage-gated sodium channel 1.8 ）mRNA表达增加

附图说明

图1为对照组大鼠坐骨神经14天的20倍下的光镜图；

图2为65℃射频热凝后14天大鼠坐骨神经14天的20倍下的光镜图；

图3为对照组和65℃射频热凝后14天大鼠背根神经节Nav1.8mRNA的RT-PCR结果。

具体实施方式

实施例1一种热损伤致神经病理性疼痛动物模型的构建方法

（1）动物及饲养

选取成年雄性SD大鼠，动物房及实验室的温度控制为23-26℃，相对湿度为40-60%，保证动物的生物节律，实行12小时的光照/黑暗循环环境设定，并自由提供食物和水；动物行为学实验均在白天进行，实验前3天每天将大鼠置于观察箱中适应30分钟。

24只大鼠按随机数字表法随机分成四组：每组6只。

对照组仅放置射频针，不采取射频热凝处理。其余三组分别设定不同的射频温度，进行双极射频热凝处理，分别为55℃组（记为RF55），65℃组（记为RF65）和75℃组（记为RF75），其余射频参数相同。

（2）射频热凝处理

应用腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）的方法对大鼠进行麻醉，大鼠取俯卧位，伸展大鼠四肢，固定于固定架上，于大鼠右侧股骨附近清理大鼠表层鼠毛，于股后进行超声扫描，找到坐骨神经的分叉处，然后向头端方向定位0.5cm处和1cm处的位置和深度，并在皮肤上做好标记；碘伏消毒三遍。

射频热凝针（22G，长度5cm，裸露端 5mm）穿刺，足部抽动，表明穿刺到达预设预设位置。

对照组仅将射频热凝针穿刺到坐骨神经的预设位置，不采取射频热凝处理。其余三组进行进行双极射频处理，分别为55℃组，65℃组和75℃组，其余射频参数为：脉率2Hz、脉宽20ms和持续 1min，反复进行两次射频热凝，间隔5分钟。实验结束后将各组的射频针拔出。

实施例2自发性痛反应测定

实验前将大鼠放于试验箱中适应30min以上（目的为让大鼠熟悉后续设备，减少紧张恐慌等因素影响），于射频热凝处理后第1天和第3天观察大鼠20min内每5min自发缩足反射次数，并做好相应记录，评价大鼠自发性疼痛程度。评分标准：大鼠后足可正常平放地面上记0分；大鼠后足平放地面，足趾并拢向下记1分；大鼠后足仅后爪内侧缘着地记2分；大鼠仅有后跟触地，足趾向内卷起记3分；大鼠全脚抬高，远离地面记4分；大鼠出现舔舐足部的表现记5分。

结果见表1。

表1大鼠自发性痛评分（n=6）

从表1的结果可见，在射频热凝处理后第1天和第3天，大鼠自发性疼痛均高于处理前和对照组，射频热凝的温度越高，自发性痛的评分相应增加。

大鼠射频热凝处理后清醒后，经射频热凝处理的大鼠当天发生自发性痛行为，抬足舔足次数增加不明显。但射频热凝处理后1天开始自发性舔足次数增加，并出现啃咬射频热凝处理侧足部脚趾的情况。在休息姿势时，射频热凝处理后的大鼠间歇性地突然舔处理侧同侧后爪，同时用嘴轻轻咬或拉指甲，射频热凝处理后20天内常见，但在25-40天频率较低。RF65、RF75出现自噬现象，自噬现象从射频热凝后3-7天最明显，常处于滴血，反复啃咬状态，射频热凝处理后20天大鼠自噬现象好转，伤口结痂愈合。射频热凝处理侧大鼠足部多弯曲，脚趾聚拢，后爪外翻。

实施例3大鼠机械刺激缩足阈值测定（mechanical withdrawal threshold，MWT）

MWT是测定大鼠机械痛阈值的重要数据，为消除大鼠心理因素对测试结果的影响，于测试前大鼠放于测试箱内20min，实验环境控制在（23±2）℃，实验室维持在安静环境。然后在底为有孔金属网格的相互隔开的透明的容器内，选用不同质量的von Frey 纤维丝垂直刺激大鼠右侧后爪外侧部，设置单位为g，从小强度刺激开始，逐步上升，每个压力刺激10次，间隔3-5s，10次刺激中有5次以上发生缩足、抖动与舔足反应，即为大鼠的机械痛阈值。

每次测试都固定时间，于每日8:00-12:00点之间进行，分别于射频热凝处理后第1d，3d， 5d， 7d，10d，15d， 20d， 25d， 30d， 35d， 40d进行测试。

实验结果为：对照组整个观察期间MWT无明显变化，在到达刺激阈值时仅有短时间的回缩躲避反应。射频热凝处理后的大鼠对于阈值的刺激出现较长时间的躲避刺激的反应。RF55组射频热凝处理后， d3到d10，MWT敏感性增高（p<0.05），但射频热凝处理后d15前后即可恢复射频热凝处理前状态。 RF65组射频热凝处理后第1天MWT升高，d5-d30天敏感性增高（p<0.05），d35大鼠MWT回归射频热凝处理前的水平。RF75组，d1-d15阈值明显增高，对机械性痛刺激反应敏感性明显降低（p<0.05），在整个观测期间，MWT阈值均高于射频热凝处理前。可见，RF65组射频热凝处理后5天开始形成神经痛，持续25天，于射频热凝处理后30天逐渐消失，神经痛持续的时间明显长于RF55组。

表2 大鼠机械刺激缩足阈值比较（n=6，单位g）

与对照组比较* p<0.05，** p<0.01， 与同组的处理前比较，#p<0.05，##p<0.01

实施例4大鼠热刺激缩足潜伏期测定（Thermal Withdrawal Latency， HWL）

HWL是测定大鼠对热痛刺激的重要指标，测试前将大鼠处于静息状态20min，实验环境控制在（23±2）℃，实验室维持在安静环境。大鼠置于有机玻璃罩内，通过热痛刺激系统辐照大鼠的足底，设置参数为强度60%，中断时间30秒。当动物出现快速抬足反应时，记录开始照射至出现缩足逃避反应的时间，重复测量5次，每次间隔时间不低于10min，取5次平均值作为该大鼠的热痛潜伏期。

每次测试都固定时间，于每日8:00-12:00点之间进行，分别于射频热凝处理后第1d， 3d， 5d，7d，10d，15d， 20d， 25d，30d， 35d， 40d进行测试。

结果为：RF55于射频热凝处理后1天HWL有轻微上升，d7-d15天较射频热凝处理前有明显下降（p<0.05），第20天恢复射频热凝处理前水平。RF65射频热凝处理后d1-d3期间HWL较射频热凝处理前有明显的增高，d7-d30期间HWL较射频热凝处理前有明显的减低（p<0.05），d35天恢复至射频热凝处理前水平。RF75组HWL在整个观测期间大鼠的都明显高于对照组及射频热凝处理前。

可见，RF65组在射频热凝处理后第7天开始形成热刺激神经痛，于射频热凝处理后30天后逐渐消失，热刺激神经痛的持续时间明显长于R55组。

表3 大鼠热刺激缩足潜伏期比较（n=6，单位sec）

与对照组比较* p<0.05，** p<0.01， 与同组的射频热凝处理前比较，#p<0.05，##p<0.01

上述实施例3和4的结果可见，RF55神经痛的维持的时间较短，大鼠射频热凝处理后神经功能恢复较快，2周左右其神经功能即可恢复至射频热凝处理前状态。RF75组大鼠射频热凝处理后神经损伤较为严重，足底MWT和HWL明显上升，对机械性痛刺激反应敏感性和对热痛刺激的敏感性均降低，说明75℃对于大鼠坐骨神经出现了明显的损毁，不符合病理性神经痛相关的临床表现。

RF65组神经痛的维持的时间较长，对机械性痛刺激反应敏感性和对热痛刺激的敏感性均提高，射频热凝处理后大鼠的行为学变化更加符合神经病理性神经痛模型的临床表现，因此，RF65组的大鼠建模成功。

实施例5大鼠坐骨神经形态学观察

另取12只大鼠随机分为2组：6只对照组，6只为65℃射频热凝处理组（RF65）参照实施例1的方法进行建模，两组大鼠于射频热凝处理后14天取大鼠的坐骨神经。

将上述大鼠固定的坐骨神经行石蜡包埋，制备成5μm的切片进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eo

sin，HE）染色，在光镜下观察神经和周围组织的病理学变化，光镜图见附图1和2。

结果显示，RF65组大鼠出现神经断裂，空泡增多，组织水肿的情况，神经组织结构更为疏松，说明射频处坐骨神经出现病理改变。

实施例6背根神经节Nav1.8离子通道mRNA表达

射频热凝处理后14天，取实施例5的对照组和RF65组的大鼠的L4-L5背根神经节进行RT-PCR半定量分析Nav1.8mRNA含量。按Trizol（Invitrogen公司）法进行各组的RNA提取，分光光度法对提取的RNA进行质和量的鉴定。逆转录获得cDNA，再对Nav1.8基因与内参β-Action基因进行扩增。扩增后行水平电泳，用图像分析系统进行半定量分析，Nav1.8mRNA表达量见附图3。

结果显示：RF65组大鼠的背根神经节组织内的与神经痛相关的Nav1.8mRNA表达量较对照组显著增加，热损伤在外周神经，但是背根神经节参与了神经病理性疼痛的发生。