一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法。

背景技术

烟碱是烟草制品的重要化学成分，其含量高低与烟的品质和口感密切相关。天然烟碱(>99％(S)-(-)-烟碱)主要来源于烟草植物，例如烤烟和卷烟。随着技术的发展，含有合成烟碱的新型烟草制品已成为传统烟草产品的替代品。合成烟碱与天然烟碱不同，含有等量的两种立体异构体(R,S-(±)-烟碱)，其主要通过化学原料制备。由于天然烟碱不是来源于烟草植物，这便给食品药品监督管理局对烟草制品的监督管理带来了极大的挑战。因此，迫切需要开发一种可靠的方法来识别天然和合成烟碱的来源。

目前，基于手性柱的液相色谱-质谱分析是较为常用的烟碱鉴定方法，然而该技术不能鉴别高纯度的天然(S)-(-)-烟碱与合成(S)-(-)-烟碱。近年来，稳定同位素比值技术在人工合成和天然提取的牛磺酸、咖啡因、麻黄碱的鉴定中发挥着重要作用。此外，Hu等人基于氢核磁光谱的位点特异性峰强度比分析技术研究了天然与合成烟碱不同(Liu B,AnalBioanal Chem，2019,411(24):6427-6434)。然而，这两种方法要求操作者有较高的专业知识，并且实验过程复杂、成本高。

化学计量统计分析对于数据的解释和未知来源样品的分类模型构建非常重要。典型的化学计量学数据分析包括无监督的主成分分析、层次聚类分析；以及有监督的线性判别分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析等。与PLS-DA相比，OPLS-DA可以滤除与分类信号无关的噪声，提高模型的分析能力和有效性。本研究通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然与合成烟碱的来源，实现市场上合成烟碱的烟草产品的准确识别、标签和监管。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术不足，建立了鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，首次利用串联质谱的同位素模式区分鉴定烟碱来源，具有操作简单、快速、无需定量等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，首先采用超纯水将烟草中的天然烟碱提取出来，合成烟碱直接使用超纯水稀释；随后进行上样，采用液相色谱将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用液相色谱-串联质谱检测，其中：通过对比烟碱的[M+H]

本发明具体包括以下步骤：

(1)烟碱提取：采用超纯水溶液将烟草中的天然烟碱提取出来，并将合成烟碱进行稀释；具体方式为：

天然烟碱：准确称取0.01g(精确到0.0001g)的天然烟草制品，加入50mL的超纯水，于30℃下超声萃取20min，静置过夜，取适量的萃取液过0.22μm水系滤膜；

合成烟碱：烟碱纯品用水稀释至20μg/mL。

(2)采用超高效液相色谱将烟碱和萃取液中的其他杂质分开；

液相色谱条件为：流动相A：10mM甲酸铵，pH为3.5的水溶液；流动相B：乙腈。流速：0.4mL/min，洗脱方式：70％ B等度洗脱7min。色谱柱：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×150mm,1.7μm，美国Waters公司)，柱温为40℃。进样体积为2μL。

(3)通过质谱分析，对比烟碱的[M+H]

质谱条件为：离子源为电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子源，正离子模式下进行数据采集，碰撞气体为氩气；其毛细管的电压、雾化器气的压力和干燥气的温度分别是-4.5kV、1.8bar和220℃；质谱内标为甲酸钠溶液，m/z范围为50-1300Th；随后，分别对烟碱m/z为163和164进行MS/MS碎裂分析，且二级碎裂中碰撞能量(CID)为10eV；m/z为163的碎片离子为84和130，m/z为164的碎片离子为85和131。

(4)通过结合化学计量学的方法构建天然与合成烟碱鉴别的OPLS-DA评价模型，并筛选影响两者差异的主要变量；

采用OPLS-DA样品分类模型用于计量统计分析，由VIP值可以看出变量164-85/84和164-85/(84+85)可以代表天然烟碱样本，而变量163-131/131和163-131/(130+131)代表合成烟碱样本。该模型的总预测准确率为97.87％；天然烟碱预测准确率为95.45％，合成烟碱样本预测准确率为100％。

本发明的方法无需复杂的烟碱提取纯化等复杂的样品前处理过程，通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然与合成烟碱的来源，实现市场上合成烟碱的烟草产品的准确识别、标签和监管。

附图说明

图1为质子化烟碱母离子分别为m/z 163和m/z 164的MS/MS质谱图。

图2.天然与合成烟碱鉴定OPLS-DA模型的(A)得分图和(B)载荷图。图中圆点代表天然烟碱样本，方块代表合成烟碱样本。

图3天然与合成烟碱鉴定的12个变量的VIP值。

图4.5种烟碱的天然与合成性。

具体实施方式：

本发明通过一下具体实施做进一步描述：

1.仪器与试剂

本实验所有的质谱数据均在impact II四极杆飞行时间质谱仪(德国Bruker公司)质谱仪上完成。该仪器配备了Ultimate 3000 UHPLC液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

甲酸铵(纯度≥99.99％)和色谱级甲酸(纯度≥98.0％)购买自美国Sigma-Aldrich公司；色谱级乙腈购买自德国Merck公司。实验用水均由Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司)制得。

天然烟碱从不同类型的烟草制品中提取：4种传统卷烟样本、4种加热卷烟样本和2种电子烟样本。将从TRC公司购买的R-烟碱、R,S-(±)-烟碱和5种不同合成路线烟碱样本等7种作为合成烟碱。进行模型构建。

2.样品前处理

准确称取0.01g的卷烟烟丝或5ul电子烟烟液加入到50mL的水，于30℃下超声萃取20min，静置过夜，萃取液过0.22μm水系滤膜。

合成烟碱使用超纯水稀释至20μg/mL。

3.仪器分析条件

色谱条件：含有10mM甲酸铵，pH为3.5的水溶液作为流动相A；纯乙腈作为流动相B。洗脱方式：流速为0.4mL/min，在70％ B条件下等度洗脱7min。色谱柱：ACQUITY UPLC BEHHILIC(2.1×150mm,1.7μm，美国Waters公司)，柱温：40℃。进样体积为2μL。

质谱条件：离子源为电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子源，正离子模式下进行数据采集，碰撞气体为氩气。其毛细管的电压、雾化器气的压力和干燥气的温度分别是-4.5kV、1.8bar和220℃。质谱内标为甲酸钠溶液，m/z范围为50-1300Th。随后，分别对烟碱m/z为163和164进行MS/MS碎裂分析，且二级碎裂中碰撞能量(CID)为10eV

4.数据处理

所有原始的质谱数据均使用Data Analysis 4.0软件(Bruker，Germany)进行分析。提取MS质谱图中m/z为163和164的丰度比和峰面积比。随后，分别提取母离子为163和164的MS/MS质谱图中m/z为84、85、130和131的丰度比。将收集数据分别导入SPSS 23.0(IBM，美国)和SIMCA 14.0(Umetrics，Sweden)进行单变量和多变量分析。

5.实验结果

首先使用10个天然烟碱和7个合成烟碱进行OPLS-DA模型构建，模型得分图和载荷图如图2所示，天然与合成烟碱鉴定的12个变量的VIP值如图3所示，丰度比和峰面积比如表1所示。模型所得天然烟碱与合成烟碱的准确度均为100％。为了进一步验证该判别模型的可预测性，进行了200次模型置换交叉检验。置换检验的R

表1.天然烟碱和合成烟碱样本分别在MS质谱图、m/z 163的MS/MS质谱图以及m/z164的MS/MS质谱图条件下各碎片峰的同位素丰度比。

实施案例：5种烟碱的天然性鉴别

本实验使用的烟碱来源：对3个天然样本：TN1,TN2,TN3和2个合成样本：TS1,TS2进行检验，天然烟碱从不同类型的烟草制品中提取：1种传统卷烟样本、1种加热卷烟样本和1种电子烟样本。将从TRC公司购买的R-烟碱、R,S-(±)-烟碱作为合成烟碱，进行测试。样品前处理方法及仪器分析条件均参考具体实施方案。根据上述模型筛选的VIP值大于1的8个参数(FD164/163、FD164/(163+164)、MJ164/163、MJ164/(163+164)、163-131/130、163-131/(130+131)、164-85/84、164-85/(84+85))进行测试分析，其分析结果如表2所示。使用上述建立的模型对其5种烟碱样本进行分析。结果如图4所示，左上角的3个样为天然烟碱，右下角2个样为合成烟碱，由此可以证明，该方法可以准确鉴定天然与合成烟碱。

表2.5种样本分别在MS质谱图、m/z 163的MS/MS质谱图以及m/z 164的MS/MS质谱图条件下8种参数的碎片峰的同位素丰度比/面积比。

/>