与大豆株高性状相关的SNP分子标记及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于大豆分子育种技术领域，尤其涉及一种与大豆株高性状相关的标记、特异性引物及其应用。

背景技术

大豆是重要的油料作物、食用蛋白质和工业原料，在世界上广泛种植。我国是大豆的原产国和消费大国，但单位面积产量却低于主产国。提高大豆产量显得尤为重要。

连锁分析和全基因组关联分析(GWAS)是检测数量性状基因位点(Quantitativetrait loci，QTL)或基因的两种主要方法。连锁分析是利用连锁的原理分析QTL或基因与遗传标记关系的一种研究方法，获得其在基因组中的位置。GWAS利用不同材料中存在的丰富突变和重组，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，能够鉴定出与目标性状显著相关的QTL或基因。定位其在基因组中的位置。因为GWAS具有检测精度高、高通量、低成本、节约时间等优势，广泛用于农作物主要性状的遗传分析。随着SNP检测技术的推广，QTL内对性状变异真正起作用的数量性状核苷酸(Quantitative trait nucleotide，QTN)也开始得到检测。多基因座GWAS方法一种是检测QTN的有效方法，并应用于多项研究中。

株高是大豆产量性状形成的重要因素，是由多个数量性状基因座(QTL)控制的复杂性状。在大豆基因组学和分子生物学数据库(SoyBase，https：//soybase.org/)中，已报告了超过250个株高相关的QTL，覆盖于大豆基因组的20条染色体。这些QTL主要通过连锁分析或GWAS方法获得。

在多个研究中发现，大豆株高性状不仅受基因型控制，还容易受到环境的影响。这容易造成株高测量上的误差，影响相关株高性状的鉴定。因此开发与大豆株高相关的分子标记，通过分子标记辅助选择可以节省育种时间，减少环境对株高性状鉴定的影响，加快大豆株高性状的选择和改良。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新的与大豆株高性状相关的SNP分子标记及其检测引物和应用。该SNP分子标记可用于检测大豆株高性状，以加快大豆优异品种的选育进程。

技术方案：本发明的目的可通过如下技术方案实现：

基于上述目的，申请人以339份中国江淮地区的大豆育成自交系为材料，连续5年在江苏省盐城市的6个不同环境中进行种植。试验采用随机区组设计，三次重复。在大豆成熟期，从每小区的中部位置随机选择3株植株来测量株高。株高的测量标准为从子叶节到主茎顶部的实际长度。为减少环境变化的影响，使用R程序lme4确定单个自交系株高值的最优线性无偏估计值(BLUE)。

使用CTAB法提取大豆自交系叶片的总DNA。根据标准实验步骤，由深圳华大基因股份有限公司进行基于酶切的简化基因组(RAD，Restriction-site associated DNA tags)测序，相关测序数据经分析后，共获得61174个最小等位基因频率＞5％的SNP。在软件GAPIT3.0版中，使用CMLM(压缩混合线性模型)和Farm CPU两种方法检测与株高性状显著关联的SNP标记。

分析结果共发现13个SNP与株高(BLUE值)性状显著相关，从SNPs中筛选出5个QTN区域。其中，8号染色体上检测到的QTL，在2个单独的环境中也被检测到，且在遗传图谱上没有与株高相关的报道，是一个新发现的QTL，将其命名为qPh08-1。

进一步研究发现，在QTL qPh08-1中，位于8号染色体第15,013,896bp处的SNP标记的碱基为A或G，与大豆株高性状显著相关。

本发明经过研究发现一段与大豆株高显著相关的序列，该序列内的SNP标记与大豆株高性状显著相关，这段序列位于8号染色体第15,013,823bp至15,013,985bp处。

本申请的一种实现方式中，具体披露了其中一个SNP标记，即qPh08-1S位点。该位点位于8号染色体的第15,013,896bp处，qPh08-1S位点所在序列如SEQ ID NO.3所示，为自5’端起第74位碱基。

本发明提供了与大豆株高显著相关的SNP分子标记，其特征在于，其为qPh08-1S，所述SNP分子标记的多态性是A/G，由序列SEQ ID NO.1-2所示特异性引物进行PCR扩增获得。

SNP标记qPh08-1S：

上游引物qPh08-1S-F：5′AGACGAAGCAGCTCAGGAGA-3′，SEQ ID NO.1；

下游引物qPh08-1S-R：5′GCCATTGAAATCCGTTTTGCCT-3′，SEQ ID NO.2。一种试剂盒，包含权利所述的特异性引物。

所述的SNP标记、所述的特异性引物或所述的试剂盒在大豆分子标记辅助育种中的应用。

所述的SNP分子标记、所述的特异性引物或所述的试剂盒在鉴定大豆株高性状中的应用。

一种鉴定大豆株高性状的方法，其特征在于，所述方法包含应用所述的SNP标记、所述的特异性引物或所述的试剂盒的步骤。

所述的鉴定大豆株高性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测大豆自交系的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，利用所述的特异性引物或所述的试剂盒进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行电泳鉴定后进行测序。

(4)当采用SEQ ID NO.1-2所示引物时，若扩增产物第74bp的碱基为G，则待测大豆株高较高，扩增产物第74bp的碱基为A，则待测大豆株高较低。

与大豆株高显著相关的QTL，名称为qPh08-1，位于大豆参考基因组Williams82V1.1的8号染色体上第14.97-15.07Mb处。

所述的QTL在筛选大豆株高性状中的应用。

有益效果：大豆株高性状不仅受基因型控制，还容易受到环境的影响。这容易造成株高测量上的误差，影响相关株高性状的鉴定。因此开发与大豆株高相关的分子标记，通过分子标记辅助选择可以节省育种时间，减少环境对株高性状鉴定的影响，加快大豆株高性状的选择和改良。

附图说明

图1是本发明的分子标记qPh08-1S在40个大豆自交系中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，M为Marker，1-40为40个大豆自交系，Marker从下往上条带大小依次为150bp、200bp、250bp和300bp。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求限定的范围。

实施例1大豆株高性状全基因组关联分析

选择339份中国江淮地区的大豆育成自交系，于2017年至2021年(其中2019年分两期种植)连续5年在江苏省盐城市进行种植。每年试验采用随机区组设计，三次重复。的6个不同环境中使用常规条件进行种植管理。在大豆成熟期，从每区的中部位置随机选择3株植株来测量株高。株高的测量标准为从子叶节到主茎顶部的实际长度。株高最终值为3次测量的平均值。为减少环境变化的影响，使用R程序lme4确定单个自交系株高值的最优线性无偏估计值(BLUE)。采用SAS 9.2中的PROC GLM程序对株高性状进行联合方差分析(ANOVA)。

339份大豆自交系的株高表型特征如表1所示。株高的BLUE值表现出较大的变化，范围值为36.40-82.60cm。株高的遗传变异系数(CV)范围值为14.20％-22.50％。BLUE值和6种单一环境的峰度和偏度的绝对值约为1。BLUE值与其他6种单一环境中株高值之间存在显著的正相关(r＞0.5，p＜0.001)。方差分析(ANOVA)表明(表2)，基因型、环境及其相互作用对性状的影响存在显著差异。其中，相对较高的遗传力(≥84.33％)，表明遗传效应在株高表型中起主要作用。

表1 339份大豆材料中六种不同环境下PH值的描述性统计

表2株高性状的方差分析

采集大豆自交系的新鲜叶片，在液氮中粉碎后，使用CTAB法提取总DNA。根据标准实验步骤，由深圳华大基因股份有限公司进行基于酶切的简化基因组(RAD，Restriction-site associated DNA tags)测序，相关测序数据经分析后，共获得61174个(最小等位基因频率＞5％)SNP。在软件GAPIT 3.0版中，使用CMLM(压缩混合线性模型)和Farm CPU两种方法检测与株高性状显著关联的SNP标记。

利用CMLM分析与株高(BLUE值)显著相关的SNPs。结果表明，13个SNPs与株高(BLUE值)性状显著相关[-log

其中，8号染色体上检测到的第15,013,896bp处的SNP所在QTL，被CMLM(压缩混合线性模型)和Farm CPU两种方法检测到，且在2个单独的环境中也被检测到。该QTL在遗传图谱上没有与株高相关的报道，是一个新发现的QTL，将其命名为qPh08-1。qPh08-1位于8号染色体上的第14.97-15.07Mb处。

表3利用CMLM和FarmCPU两种方法检测大豆株高性状相关QTL

实施例2与大豆株高性状显著相关的SNP标记开发及应用

在QTL qPh08-1中，8号染色体上的第15,013,896bp处存在1个SNP位点，选取该SNP位点前后200bp基因组序列，设计引物qPh08-1S，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示：

上游引物qPh08-1S-F：5′-AGACGAAGCAGCTCAGGAGA-3′，SEQ ID NO.1；

下游引物qPh08-1S-R：5′-GCCATTGAAATCCGTTTTGCCT-3′，SEQ ID NO.2。

在339份大豆自交系中随机挑选20份株高较高和20份株高较低自交系(表4)DNA，进行PCR扩增(图1)。

PCR反应体积如下：5μL

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃30s，引物退火温度30s，72℃30s，共32个循环；最后在72℃延伸5分钟；冷却至12℃。

扩增产物在8％的非变性丙烯酰胺凝胶上电泳检测，150V恒压60min，使用照相机拍照。

将PCR产物在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，检测扩增产物第74bp处的碱基类型。株高性状和SNP基因型结果如表4。基因型为A的材料平均株高为43.6cm，基因型为G的材料平均株高为66.5cm，说明该SNP标记可以用于鉴定大豆株高性状。

表4利用SNP标记qPh08-1S鉴定40个大豆自交系株高表现