催产素的纯化方法、测定方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种催产素的纯化方法、测定方法及试剂盒。

背景技术

催产素为在下丘脑合成并由从垂体后叶分泌的9个氨基酸组成的肽类激素。作为活体试样中的催产素浓度的测定法，惯用免疫学测定方法、HPLC(高效液相色谱法)、LC/MS(液相色谱质谱分析法)等。但是，活体试样中所包含的催产素为微量，并且活体试样中所包含的白蛋白等蛋白质或肽、黏蛋白等测定干扰物质与催产素结合，因此难以进行催产素的准确定量。

在市售中的催产素的ELISA试剂盒(非专利文献1)及非专利文献2中记载的预处理方法中，将TFA(三氟乙酸)与包含催产素的活体试样混合，使催产素与测定干扰物质的复合体吸附于凝胶(C18柱)，利用0.1％TFA-H

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：D.Schams、Oxytocin ELISA kit(Enzo Life Sciences Inc.USA)Catalog#:ADI-901-153A

非专利文献2：European Journal of Endocrinology,volume 103:Issue 2,180-183,1983

发明内容

发明要解决的技术课题

非专利文献1-2中所记载的预处理方法为了防止TFA对测定产生的坏影响，工序数量多且复杂，预处理需要长时间。此外，在不具备离心分离机的医院等，难以实施非专利文献1-2的预处理方法。本发明鉴于上述状况，其课题在于提供一种简便的催产素的纯化方法。

用于解决技术课题的手段

[1]一种催产素的纯化方法，其包括如下步骤：用酸或其盐处理试样；及使用疏水性载体处理所述用酸或其盐处理的试样，其中，

所述酸或其盐为选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸或其盐，且

所述疏水性载体为在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体。

[2]根据[1]所述的方法，其中，所述酸或其盐为盐酸。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述疏水性载体为在表面具有碳原子数4～6的烷基的疏水性载体。

[4]根据[1]所述的方法，其中，所述酸或其盐为盐酸，且所述疏水性载体为在表面具有碳原子数4～6的烷基的疏水性载体。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述试样为选自包括血液试样、尿液及唾液的组中的试样。

[6]一种催产素的测定方法，其包含[1]至[5]中任一项所述的催产素的纯化方法。

[7]一种催产素的纯化用试剂盒，其包含：选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸或其盐；以及在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体。

发明效果

根据本发明，能够简便地纯化催产素。

具体实施方式

在本说明书中，当表示范围的上限和下限时，除了特别记载的情况以外，A～B表示A以上且B以下。并且，本说明书中的“测定”中可包括定量、半定量、定性的含义。本说明书中的“纯化”表示使试样中所包含的催产素量成为能够测定的状态，可包括分离或回收、提取、浓缩、预处理的含义。

＜本发明的催产素的纯化方法＞

本发明的催产素的纯化方法(以下，称为本发明的纯化方法)为包括如下步骤的催产素的纯化方法：用选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸处理试样(以下，称为酸处理工序)；及使用在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体处理用所述酸处理的试样(以下，称为疏水性载体处理工序)。根据本发明的纯化方法，不依赖于纯化环境的设备而能够简便地纯化催产素。

催产素为由具有Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的序列(序列号1)的9个氨基酸组成的多肽。本发明中的催产素可以为从活体试样得到的催产素(天然的催产素)，也可以为通过基因重组法制造的催产素，并且可包含催产素的前体。并且，催产素也可以为导入有功能与天然的催产素相同的突变的肽(突变型)。作为该突变，包括一个或多个氨基酸的缺失或取代、或者一个或多个氨基酸的添加。突变型的催产素的氨基酸序列与天然的催产素具有至少80％以上的序列同源性，可具有85％以上、90％以上、95％以上的序列同源性。

作为本发明所涉及的试样，可以举出从受检动物得到的活体试样，例如可以举出血清、血浆、全血、血沉棕黄层等血液试样、脑脊液、尿液、唾液、精液、胸腔渗出液、泪液、痰液、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱清洗液、支气管肺泡清洗液等体液试样，优选血液试样、尿液、唾液。并且，本发明由于富含作为测定干扰物质的与催产素结合的黏蛋白，因此对唾液特别有用。作为所述受检动物，可以举出人、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、猪、兔、黑猩猩等哺乳动物，优选人、猴、小鼠或大鼠，更优选人。本发明所涉及的试样可以为源自培养细胞或微生物的培养基(培养液)的试样，例如可以举出通过基因重组法将动物细胞或植物细胞、细菌细胞作为宿主而使催产素重组表达的培养基的培养上清液、通过溶解或粉碎细胞等而得到的提取液等。由于在培养基中可包含白蛋白等与催产素结合的动物性蛋白质等，因此本发明对培养基也有用。本发明所涉及的试样可以直接使用从受检动物采集的试样或培养基，也可以为进行了回收、浓缩、基于缓冲液等的稀释、过滤灭菌等预处理的试样。这些预处理只要按照常规方法适当进行即可。

本发明所涉及的酸处理工序为用选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸或其盐(以下，称为本发明所涉及的酸)处理试样的工序。具体而言，在本发明所涉及的酸处理工序中，只要通过使本发明所涉及的试样与本发明所涉及的酸共存而设为例如共存后的溶液的pH小于7的酸性条件即可，优选设为pH1.5～6.0，更优选pH2.0～6.0。作为与本发明所涉及的试样共存的本发明所涉及的酸的量，相对于包含催产素的试样，例如为1～50倍(v/v)，优选5～20倍(v/v)，更优选8～15倍(v/v)。作为本发明所涉及的酸，优选盐酸，因为不依赖于试样的种类而能够以高回收率得到催产素。本发明所涉及的酸可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。根据本发明所涉及的酸处理工序，认为通过用特定的酸处理被检体，可从与试样中的蛋白质或肽等测定干扰物质结合而形成的复合体中分离出催产素。

本发明所涉及的疏水性载体处理工序为使用在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体(以下，称为本发明所涉及的疏水性载体)处理本发明所涉及的酸处理工序后的试样(以下，称为酸处理完毕试样)的工序。具体而言，通过使酸处理完毕试样与本发明所涉及的疏水性载体接触、使催产素与酸处理完毕试样中的其他成分分离来进行。本发明所涉及的疏水性载体处理工序例如通过在填充于柱等中的本发明所涉及的疏水性载体(悬浮液)中添加酸处理完毕试样而使其溶出，或者在容器内使酸处理完毕试样混合或/和悬浮于本发明所涉及的疏水性载体(悬浮液)中，必要时，离心分离之后，回收上清液等来进行。

作为本发明所涉及的疏水性载体中的碳原子数4～6的烷基，可以为直链状、支链状或环状中的任一种。作为这种烷基的具体例，例如可以举出正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基等丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、新戊基、2-甲基丁基、1,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、环戊基等戊基、正己基、异己基、仲己基、叔己基、新己基、2-甲基戊基、1,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、环己基等己基，优选碳原子数4～6的直链状或支链状的烷基，更优选丁基。

作为本发明所涉及的疏水性载体中的亚烷基二醇基，例如可以举出低聚乙二醇基、低聚丙二醇基、低聚1,3-丙二醇基、低聚1,4-丁二醇基、聚乙二醇基、聚丙二醇基、聚1,3-丙二醇基、聚1,4-丁二醇基。聚乙二醇基、聚丙二醇基、聚1,3-丙二醇基及聚1,4-丁二醇基可以举出例如具有100个以上其重复单元(亚烷基二醇或链烷二醇)的基团，可以为具有100～500个其重复单元的基团。低聚乙二醇基、低聚丙二醇基、低聚1,3-丙二醇基及低聚1,4-丁二醇基可以举出具有例如2～99个其重复单元(亚烷基二醇或链烷二醇)的基团，可以为具有10～99个其重复单元的基团。

本发明所涉及的疏水性载体在固相(基材)的表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团。作为固相，只要为不溶性，则不受特别限定，例如可以举出聚苯乙烯、羧基化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚丙烯、聚烯烃、聚酰亚胺、聚氨酯、聚酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、硅酮树脂、硅橡胶、琼脂糖、葡聚糖、乙烯-马来酸酐共聚物等有机物；玻璃、氧化硅、硅藻土、多孔性玻璃、毛玻璃、氧化铝、硅胶、金属氧化物等无机物质；纤维素衍生物；多孔聚合物；铁、钴、镍、磁铁矿、铬铁矿等磁性体等；及将这些磁性体的合金作为材料而制备出的材料等。所述固相的形态例如可以举出凝胶状(聚合物凝胶)、微孔板、管、盘状片、粒子(珠)等，优选凝胶状(聚合物凝胶)。本发明所涉及的疏水性载体可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。本发明所涉及的疏水性载体可以填充于柱中，也可以容纳于微管等容器中。

作为市售的本发明所涉及的疏水性载体，例如可以举出TOYOPEARL

本发明所涉及的疏水性载体在表面所具有的官能团优选碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基，更优选碳原子数4～6的直链状或支链状的烷基、低聚乙二醇基、聚乙二醇基、低聚丙二醇基、聚丙二醇基，进一步优选丁基。本发明所涉及的疏水性载体在表面所具有的官能团可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。

本发明所涉及的疏水性载体处理工序可以在盐的存在下实施，优选在盐的存在下的实施。作为盐，例如可以举出钠盐、钾盐、镁盐、铵盐。作为使酸处理完毕试样与本发明所涉及的疏水性载体接触时的盐浓度，例如为0.10M～5.0M，优选0.30M～1.0M。通过使盐共存，通过本发明所涉及的疏水性载体处理工序得到的溶液(上清液或溶出液)成为中性，从而容易测定催产素。并且，通过调整催产素和酸处理完毕试样中的其他成分对本发明所涉及的疏水性载体的结合力，容易使催产素与其他成分分离。具体而言，本发明所涉及的疏水性载体处理工序例如通过使包含本发明所涉及的疏水性载体及终浓度在上述范围内的量的盐的悬浮液与酸处理完毕试样接触、使含有终浓度在上述范围内的量的盐的酸处理完毕试样与本发明所涉及的疏水性载体(必要时，与本发明所涉及的疏水性载体的悬浮液)接触等来进行。

具体而言，本发明所涉及的疏水性载体处理工序例如通过在容器内使酸处理完毕试样(必要时，0.30M～1.0M的所述盐的存在下)混合或/和悬浮于作为本发明所涉及的疏水性载体的在表面具有碳原子数4～6的烷基或亚烷基二醇基的聚合物凝胶的悬浮液中，必要时，离心分离之后，回收上清液等来进行。并且，本发明所涉及的疏水性载体处理工序例如通过在作为填充于柱等中的本发明所涉及的疏水性载体的在表面具有碳原子数4～6的烷基或亚烷基二醇基的聚合物凝胶的悬浮液中(必要时，在0.30M～1.0M的所述盐的存在下)添加酸处理完毕试样，并回收从柱中溶出的溶液等来进行。

＜催产素的测定方法＞

本发明的催产素的测定方法(以下，称为本发明的测定方法)为使用进行了本发明的纯化方法的试样测定催产素的方法。本发明的测定方法例如可以举出免疫学测定法、HPLC(高效液相色谱法)、质谱分析法等为了蛋白质或肽的测定而惯用的方法。作为这些测定方法的原理，例如可以举出夹心法或竞争法、凝集法(免疫比浊法)、免疫色谱法、发光氧通道免疫分析(Luminescent Oxygen ChannelingImmunoassay(LOCI法))、液相结合分析-电驱动转运分析(Liquid-phase Binding Assay-ElectroKinetic Analyte TransportAssay(LBA-EATA法))、凝集素电泳法等毛细管电泳法、蛋白质印迹法、表面等离子共振法(SPR法)、凝集素柱法等，并且可以为同质测定系统，也可以为异质测定系统。根据本发明，估计通过抗催产素抗体容易结合于催产素，因此免疫学测定法更加有用。免疫学测定方法中的标志并不受特别限定，例如可以举出酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、酶免疫测定法(EIA法)、放射免疫测定法(RIA法)、荧光酶免疫法(FEIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、化学发光免疫测定法(CLIA法)、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)等。

＜本发明的催产素的纯化用试剂盒＞

本发明的催产素的纯化用试剂盒(以下，称为本发明的试剂盒)包含：(i)选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸或其盐(本发明所涉及的酸)；以及(ii)在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体(本发明所涉及的疏水性载体)。通过将本发明的试剂盒用于本发明的方法，能够简便地纯化催产素。

本发明的试剂盒中的选自包括盐酸、乙酸、硫酸、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢锂、硫酸铵及它们的混合物的组中的至少一种以上的酸或其盐以及在表面具有选自包括碳原子数4～6的烷基、亚烷基二醇基及苯基的组中的至少一种以上的官能团的疏水性载体与本发明的催产素的纯化方法的酸或其盐、疏水性载体相同，优选例、具体例也相同。

本发明的试剂盒中的本发明所涉及的酸也可以为除了酸以外还包含其他成分的组合物。作为其他成分，例如可以举出防腐剂(例如，叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、反应促进剂、赋形剂、缓冲剂等。根据本发明，除了本发明的试剂盒以外，还提供包含为了通过免疫学测定法或质谱分析法等各种测定法测定催产素而使用的任意成分的催产素的测定用试剂盒。作为该任意成分，例如可以举出试样稀释液(用于稀释试样的溶液)、对催产素的抗体、载体、标志物质、缓冲液、酶液、底物液等。并且，本发明的试剂盒可以包含记载有本发明的纯化方法的操作说明书等。

实施例

以下，根据实施例及比较例对本发明进行具体的说明，但本发明并不受这些例子的任何限定。

实施例1.催产素的纯化方法的评价

(1)酸处理

在1.5mLPP小瓶内，向尿液被检体(FUJIFILM Wako Shibayagi Corporation)中以成为已知浓度(4.0～1000pg/mL的范围内)的方式添加了催产素(Anygen公司)。向所得到的含有催产素的尿液被检体和未添加催产素的该尿液被检体各200μL中分别添加20μL室温化的1M盐酸并搅拌之后，静置10分钟，作为酸处理完毕试样。

(2)疏水性载体处理

然后，将凝胶悬浮液[50％(w/v)TOYOPEARL

(3)基于ELISA法的测定

将通过ProteinG(cytiva公司)色谱法纯化的Anti Rabbit IgG Goat IgG(FUJIFILM Wako Shibayagi Corporation)在96孔微孔板(ThermoFisher公司)上固相化，并添加抗催产素兔多克隆抗体(AIRPLANTS BIO公司)溶液100μL/well，并且在室温下静置了2小时。去除抗体溶液并进行清洗之后，分别添加催产素标准溶液{以成为4.0～1000pg/mL催产素的范围的方式由Tris-HCl缓冲液[0.1M Tris-HCl(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)、0.15M NaCl(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，0.1％ BSA(Merck公司)、0.01％ Tween20(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)、1mg/mEDTA(Kagaku-Dojin Publishing Company,Inc.)]制备的催产素标准溶液}50μL/well或测定用被检体50μL/well以及10pg/mL生物素标志催产素溶液[使生物素(Kagaku-Dojin Publishing Company,Inc.)与催产素(Anygen公司)结合而溶解于该Tris-HCl缓冲液而成的溶液]50μL/well并进行搅拌，并且在室温下静置了2小时。去除反应液并进行清洗，接着，添加由该Tris-HCl缓冲液制备的Avidin-HRP(ThermoFisher公司)100μL/well，并且在室温下静置了30分钟。去除反应液并进行清洗，然后，分别添加发光试剂(ELISA-StarChemiluminescent Peroxidase Substrate，FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)100μL/well，使用Infinite M200 PRO(Tecang公司)通过终点(endpoint)测定法分别测定出发光强度。通过上述ELISA法，根据催产素标准溶液的测定值制作校准曲线，基于各被检体的发光强度计算出催产素浓度。回收率(％)如下计算出：由从“添加了已知浓度的催产素的尿液被检体”的测定值减去“未添加催产素的该尿液被检体的测定值”的值通过校准曲线计算出的催产素浓度除以“添加了已知浓度的催产素的尿液被检体”中的催产素浓度(所添加的已知浓度的催产素值)的值乘以100。将所得到的回收率示于下述表1中。

[表1]

实施例2-15.催产素的纯化方法的评价

按照上述表1中所记载的条件，除此以外，通过与实施例1相同的方法进行催产素的纯化之后，进行基于ELISA法的测定，计算出回收率。

表1中的试剂类如下。

TOYOPEARL

TOYOPEARL

TOYOPEARL

血清被检体(BioIVT公司)、唾液被检体(FUJIFILM Wako ShibayagiCorporation)

将所得到的回收率示于表1中。

比较例1-5.催产素的纯化方法的评价

未进行催产素的纯化(酸处理及疏水性载体处理)而将血清被检体本身作为测定被检体，除此以外，通过与实施例1(3)相同的方法进行基于ELISA法的测定，计算出回收率(比较例1)。并且，按照上述表1中所记载的条件，除此以外，通过与实施例1相同的方法进行催产素的纯化之后，进行基于ELISA法的测定，计算出回收率(比较例2-5)。表中，“-”表示未进行对应的处理。

表1中的试剂类如下。

Sep-PakC8(Waters公司)

将所得到的回收率示于表1中。

根据表1，若在未进行纯化的状态下进行催产素的测定，则成为异常高值而无法测定。并且，在仅进行基于盐酸的酸处理的情况、仅进行基于在表面具有丁基的疏水性载体的处理的情况或组合了基于盐酸的酸处理与基于C8的疏水性载体处理的情况下的纯化中，成为异常高值而无法测定。另一方面，可知若利用组合了基于盐酸、硫酸或乙酸的酸处理及基于在表面具有丁基、己基或低聚乙二醇基的疏水性载体的处理的纯化，则以高回收率纯化催产素，能够进行准确度高的测定。尤其，在组合基于盐酸的酸处理和基于在表面具有丁基的疏水性载体的处理的情况下，将血清被检体、尿液被检体、唾液被检体中的哪一个被检体作为试样，都能够以高回收率纯化催产素，因此可知特别有用。

产业上的可利用性

根据本发明的催产素的纯化方法、测定方法、纯化用试剂盒，能够简便地纯化催产素，因此在测定催产素的领域、尤其在临床检查领域中有用。