一种大豆蛋白来源的多肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，尤其涉及一种大豆蛋白来源的多肽、制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种危害性极大的代谢性疾病，以高血糖为主要表征。胰岛素分泌缺陷或其生物功能受损是造成高血糖的主要原因，长期高血糖容易造成眼、肾、肝脏、血管及神经慢性损伤，引起功能障碍，严重时可危及生命。

有研究表明，较高的血糖水平可以诱导非酶糖基化蛋白质的形成，从而导致糖尿病慢性并发症的产生，如冠心病、高血压、脑血管病等。因此，应该注意糖尿病患者餐后血糖含量的控制，对于治疗糖尿病和减少一系列糖尿病伴随的慢性并发症至关重要。降低人体餐后高血糖的治疗方法关键是降低餐后碳水化合物的吸收。人体一般只吸收单糖等小分子，淀粉等多糖一般要经过水解才可以被人体吸收，而α-葡萄糖苷酶可以将多糖水解为单糖等小分子，是人体糖代谢中最重要的酶组成。因此，防治T2DM的一种潜在有效方法是调节进入循环系统的葡萄糖释放，可通过采用药理手段阻碍α-葡萄糖苷酶的活性来实现。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过与低聚糖竞争葡萄糖苷酶结合位点，延缓低聚糖的消化和吸收速度，从而延长碳水化合物的消化过程，减少和延缓葡萄糖的吸收，达到维持血糖平衡的目的。

目前许多降糖药物已被批准用于商业用途，如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。然而，服用这些药物可能会导致不良反应，从而大大限制了它们的使用。

大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂。大豆分离蛋白中蛋白质含量在90％以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。其营养丰富，不含胆固醇，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种大豆蛋白来源的多肽、制备方法及其应用。本发明提供的多肽分离自大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物，对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，可以用于制备降糖药物，用于防治糖尿病，且溶解性好、无毒性。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种大豆蛋白来源的多肽，选自P1、P2和P3中的一种或几种；P1的氨基酸序列包括：DAMDGWFR；P2的氨基酸序列包括：PDFKNPIGW；P3的氨基酸序列包括：KDPGQDPFTF。

采取上述技术方案的有益效果包括：本发明筛选获得的多肽，以大豆分离蛋白为原料制备获得，无毒性，溶解性好；经α-糖苷酶抑制活性检测，结果表明，对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC

本发明提供一种大豆蛋白来源的多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将大豆分离蛋白采用碱性蛋白酶水解；

(2)超滤，选择分子量小于3kDa的组分；

(3)采用蛋白纯化色谱法对分子量小于3kDa的组分进行分离，根据洗脱液体积由小到大对应的出峰情况，分别命名为组分F1至组分F4组分，选择组分F3；

(4)筛选组分F3含有的多肽。

采取上述技术方案的有益效果包括：本发明经过研究发现，大豆蛋白的酶解产物可以释放出具有良好抗糖尿病特性的活性肽。本发明检测了并证实了碱性蛋白酶处理后的大豆分离蛋白酶解物具有有效的α-糖苷酶抑制能力，进一步采用超滤结合FPLC(快速蛋白液相色谱)两步纯化方法，结合计算机辅助筛选技术从大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解液中筛选具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性多肽，并通过体外α-葡萄糖苷酶抑制实验进行验证。经实验证明，本发明筛选的多肽相比未纯化的大豆蛋白的酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制作用明显增强。

进一步，步骤(1)中，水解条件包括：pH 9.0,水解温度为55℃，水解时间为4h。

进一步，步骤(3)中，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，溶剂B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序包括：0-30min内使用100％的溶剂B进行洗脱，30-90min内使用100％-60％的溶剂B进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min；在214nm处监测洗脱峰。

进一步，步骤(4)中，筛选方法包括以下步骤：针对组分F3含有的多肽，使用PeptideRanker预测生物活性概率，选择评分≥0.8的肽序列进行筛选；使用peptideproperty calculator评估肽序列的溶解度，通过Toxinpred对肽序列进行毒性预测。

采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法获得的多肽对α-葡萄糖苷酶抑制效果更好，溶解性好且无毒性。

本发明提供上述大豆蛋白来源的多肽在作为或制备α-葡萄糖苷酶抑制剂(包括α-葡萄糖苷酶抑制肽等)中的应用。

本发明提供上述大豆蛋白来源的多肽在制备降糖药物、食品、保健品中的一种或几种中的应用。

本发明提供上述大豆蛋白来源的多肽在制备防治糖尿病药物、食品、保健品中的一种或几种中的应用。

采取上述技术方案的有益效果包括：本发明经实验验证，本发明提供的大豆蛋白来源的多肽具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，并且溶解性好、无毒性，可以用于食品、药品、保健品等领域。

附图说明

图1为超滤后两个组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测结果；每组中由左到右分别依次为MW＜3kDa、MW＞3kDa。

图2为分子量<3kDa的大豆分离蛋白水解物的FPLC色谱图。

图3为FPLC纯化后四个组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测结果，每组中从左至右依次为F1、F2、F3、F4。

图4为三种多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性的实验结果。

图5为三种多肽和α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk图。

图6为α-葡萄糖苷酶与三种多肽(P1、P2、P3)在不同浓度下相互作用的荧光光谱，其中，在横坐标为Wavelengthz的图中，波长为325nm对应的曲线由上到下依次为0、0.1、0.5、1、1.5、2μg/mL。

图7为三种多肽和α-葡萄糖苷酶的对接结果,A-1、B-1和C-1分别表示P1、P2和P3分别与α-葡萄糖苷酶(3WY1)相互作用的分子对接的三维图；A-2、B-2和C-2分别表示P1、P2和P3分别与α-葡萄糖苷酶(3WY1)相互作用的分子对接的二维图。

图8为关于训练集药效团模型的分析结果。

图9为药效团模型热图。

图10为三种多肽和最优药效团模型的匹配图，从上到下分别依次为P1、P2、P3的匹配图。

图11为三种多肽的溶解度的测定结果。

图12为三种多肽对细胞活性的影响的测定结果，每组中由左到右分别依次为P1、P2、P3的测定结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明证实了碱性蛋白酶处理后的大豆分离蛋白酶解物具有有效的α-糖苷酶抑制能力。进一步采用超滤结合FPLC(快速蛋白液相色谱)两步纯化方法，结合计算机辅助筛选技术从大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解液中筛选具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性多肽，并通过体外α-葡萄糖苷酶抑制实验进行验证。通过抑制动力学和荧光猝灭分析多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，探讨其抑制机制。并通过分子对接和药效团模拟，可视化了这些肽与α-葡萄糖苷酶之间的分子相互作用，说明本发明提供的多肽对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，并且具有溶解性好、无毒副作用等优点。

本发明中，若未经特殊说明所使用的实验方法均为本领域的常规实验方法。所用材料、试剂、仪器均为本领域常规材料、试剂和仪器，可通过商业渠道获得或常规方法制备。

对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)购自上海源叶生物科技有限公司；PBS磷酸缓冲液购自上海源叶生物科技有限公司。

人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院细胞库。

完全培养基配方包括胎牛血清、DMEM高糖培养基和青霉素-链霉素双抗；胎牛血清与DMEM高糖培养基的体积比为1:9，青霉素-链霉素双抗的体积为胎牛血清、DMEM高糖培养基二者体积和的1％。DMEM高糖培养基购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，青霉素-链霉素双抗购自大连美仑生物技术有限公司。

下面通过具体实施例进行介绍。

实施例1制备多肽

制备大豆分离蛋白碱性酶解液(A-SPIHE)，包括以下步骤：将浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白(SPI)溶液在pH 9.0,55℃的环境条件下，用碱性蛋白酶(6000U/g)水解4h，最终得到A-SPIHE。制备A-SPIEH溶液(5mg/mL)，采用BONA-GM-03超滤系统(济南博纳生物科技有限公司)进行超滤，选择3kDa的膜，分别得到两个组分：M1＜3kDa和M2＞3kDa。

实施例2测定α-葡萄糖苷酶抑制率

分别测定Ml组分和M2组分的α-糖苷酶抑制活性，以筛选最有效的组分。

检测α-糖苷酶抑制活性包括以下步骤：以对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)为底物测定每一种纯化组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。反应体系依次加入0.1mol/L pH6.8的PBS磷酸缓冲液(40μL)，纯化组分样品(20μL)和0.4U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(10μL)，37℃保温10min，再加入10mmol/L PNPG溶液(50μL)，37℃反应20min后加入0.2mol/L的Na

式中:A

为了分离出具有降血糖活性的多肽，通过超滤纯化手段，依据分子量对碱性蛋白酶水解物进行了分组，并对其α-葡萄糖苷酶的抑制效果进行比较。如图1所示，两种组分(M1、M2)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与浓度呈正相关，在相同浓度下，相同浓度下，分子量较低组分(M1)的抑制率较高。经检测，M1组分的IC

实施例3

考虑到分子量小于3kDa组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，接来下将M1组分进行分离纯化，筛选降血糖多肽。

使用FPLC系统(上海闪谱生物技术有限公司，中国)，使用反相LXMS-15色谱柱(10×300mm，西安兰晓科技新材料有限公司，中国)对分子量＜3kDa的馏分进行进一步纯化。流动相为溶剂A(0.1％v/v三氟乙酸TFA溶于水)和溶剂B(0.1％v/v TFA溶于乙腈)。洗脱程序：0-30min内使用100％的溶剂B进行洗脱，30-90min内使用100％-60％的溶剂B进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。在214nm处监测洗脱峰，然后参照实施例2的方法评估纯化后的部分对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

使用蛋白纯化色谱(FPLC)法，依据分子疏水性对小于3kDa的多肽组分进行了分离。图2显示了使用FPLC方法将超滤得到的组分根据分子疏水性分离成四个组分，其中亲水化合物倾向于首先洗脱，而疏水分子则表现出延迟洗脱，根据洗脱液体积(按由小到大的顺序)对应的出峰情况，分别命名为F1至F4，F3组分对应的洗脱液的体积为73.9-77.9mL之间。如图3所示，4个组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与浓度呈正相关，其中F3组分在相同浓度下抑制活性最有效(P＜0.05)。α-葡萄糖苷酶的抑制效果显示，4个组分中，因F3组分的IC

实施例4多肽的鉴定

肽段的氨基酸序列采用Eksigent纳米lc系统(AB SCIEX,USA)与Triple TOF5600plus质谱联用进行鉴定。流动相为溶剂A(2％乙腈和0.1％甲酸水溶液)和溶剂B(0.1％甲酸乙腈溶液)。进样液5.0μL，扫描60分钟。质谱仪的原始MS/MS文件上传到ProteinPi lot进行肽测序。

为了明确F3组分中具有降血糖活性多肽的结构，采用LC-MS/MS对其进行分析。通过上述方法共鉴定出了121条多肽，其分子量为1665.85-866.06Da，氨基酸长度为8-14个氨基酸，得分在0.0472281至0.944908之间。

实施例5α-葡萄糖苷酶抑制肽的筛选、合成

使用PeptideRanker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)预测所有实施例4的鉴定肽的生物活性概率，选择评分≥0.8的肽序列进行进一步筛选。然后，使用peptide property calculator(http://www.pepcalc.com/ppc.php)评估肽序列的溶解度。最后，通过Toxinpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php)对肽序列进行毒性预测。

121个多肽中有8个多肽的预测分数大于0.8，如表1所示。利用Peptide Ranker用于预测获得的肽序列的活性，从8个多肽中进一步筛选出3个多肽，分别为DAMDGWFR[P1]、PDFKNPIGW[P2]、KDPGQDPFTF[P3]，经Peptide property calculator和Toxin Pred在线数据库预测，具有良好的溶解性和无毒性。

表1序列、分子量、分数、溶解度和毒性预测

将筛选出的三种多肽，分别是：DAMDGWFR、PDFKNPIGW、KDPGQDPFTF，由武汉捷创生物工程有限公司采用标准固相合成法分别合成，纯度超过98％。

采用实施例2的方法对上述三种多肽进行α-葡萄糖苷酶抑制率检测。检测结果如图4所示，每组中由左到右依次分别为P1、P2和P3的α-葡萄糖苷酶抑制率的检测结果。从图4可以看出，上述3种多肽对α-葡萄糖苷酶表现出明显的剂量依赖性抑制活性，提示其具有治疗意义。从表2可以看出，P1的IC

表2纯化后具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽段IC

实施例6酶催化反应动力学

制备不同浓度的样品溶液(0、0.5、1.5、2.0mg/mL)，与0.5U/mLα-葡萄糖苷酶混合后，设置不同浓度的PNPG(0.8、1、2、3、4mM)孵育，进行糖苷酶抑制实验(实验方法参照实施例2)。每3分钟记录一次，持续15分钟。采用双倒数Lineweaver-Burk图测定了抑制α-葡萄糖苷酶作用下的Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。此外，竞争性抑制常数(Kic)和非竞争性抑制常数(Kiu)采用基于公式的二次线性拟合确定。

式中:V

本发明采用pNPG作为底物得到α-葡糖苷酶的Lineweaver-Burk图，并确定其抑制类型，结果见图5和表3。在这3种多肽中，线性回归呈现出相似的趋势，即在不同多肽浓度下，回归线均在第二象限相交。随着多肽浓度的增加，Km增加，而Vmax基本不变。这结果表明，3种多肽对α-葡萄糖苷酶表现出竞争性抑制，即α-葡萄糖苷酶的活性位点被多肽和底物竞争性占据，与阿卡波糖的作用机制类似。Ki值在评价α-葡萄糖苷酶与抑制剂的结合能力中起着关键作用，既是抑制剂结合的解离常数，也是酶与底物亲和力的指标。Ki值越低，表明酶与底物的相互作用越强。相比P1和P3，P2的Ki值最小，说明P2对α-葡萄糖苷酶的结合能力优于P1和P3。

表3用Lineweaver-Burk图测定α-葡萄糖苷酶的动力学常数

实施例7荧光猝灭反应

分别在298K、304K、310K条件下，将0、0.1、0.5、1、1.5、2μg/mL多肽与α-葡萄糖苷酶孵育5min后，监测α-葡萄糖苷酶的荧光变化。激发波长选择280nm，狭缝宽度选择5.0nm。为了解假设的肽与α-葡萄糖苷酶之间的猝灭机制，利用Stern-Volmer方程(5)和Scatchard方程(6)(即下述2个方程式)对荧光猝灭数据进行分析:

式中，分别为在不存在猝灭剂和不存在猝灭剂时的荧光强度，分别为:Kq表示生物分子的猝灭速率常数，μg/mL；Ksv表示通过对[Q]进行线性回归计算得到的动态猝灭常数,μg/mL；τ0为不存在猝灭剂时生物分子的平均寿命(10

荧光测量提供了有关发色团分子附近分子环境的信息。蛋白质荧光强度的降低称为蛋白质荧光猝灭，这种猝灭可通过不同的机制：动态猝灭(碰撞猝灭)是激发态荧光团与溶液中的其它分子(猝灭剂)接触而失活时发生。静态猝灭为荧光团与猝灭剂形成非荧光配合物。

图6反映了不同浓度的三种多肽在不同温度下对α-葡萄糖苷酶之间的荧光光谱图。随着多肽浓度的增大，α-葡萄糖苷酶的荧光强度呈现不同程度的降低，即荧光猝灭现象。为了阐述作用机制，使用Stern-Volmer方程分析荧光数据。荧光猝灭结果表明，三种多肽均为静态猝灭，这归因于非发光基态配合物的形成，而不是通过碰撞动态猝灭。此外，K值作为评估抑制剂与酶之间结合亲和力程度的可靠指标，K值越高表明亲和力越强。与P1和P3相比，P2的K值更高(表4)，说明P2相比P1和P3具有更强的抑制能力，这与之前的IC

表4三种多肽(P1-P3)对α-葡萄糖苷酶在不同温度下的猝灭参数

实施例8分子对接

使用Discovery Studio 2019软件，以了解受体(α-葡萄糖苷酶)与配体(多肽)之间的相互作用。α-葡萄糖苷酶的三维晶体结构从蛋白质数据库下载，序列号为3WY1。随后，在该结构中加入极性氢和水分子，获得α-葡萄糖苷酶蛋白作为配体分子。用ChemDraw 20.0软件绘制作为受体分子的肽结构。在配体能量最小化的基础上，利用Discovery Studio2019进行肽与α-葡萄糖苷酶的分子对接。

分子对接结果预测表明，三种多肽与α-葡萄糖苷酶非催化位点的氨基酸残基发生了相互作用，可能扰乱蛋白质结构，进而改变酶活力。预测的最小结合能为负，这表明三种肽与α-葡萄糖苷酶的结合可以自发发生，形成复合物，最终实现结构稳定(图7和表5)。根据对接结果的分析表明，每个多肽与α-葡萄糖苷酶之间存在多种相互作用，主要包括氢键、静电相互作用和疏水相互作用，这些相互作用对肽段与α-葡萄糖苷酶形成的复合物的稳定性至关重要。其中，P1-α葡萄糖苷酶的平均氢键距离最近，P2-α葡萄糖苷酶的结合能最低，P3-α葡萄糖苷酶的相互作用位点最多。Asp346、Arg450和Asp441被鉴定参与所有肽-α-葡萄糖苷酶复合物的键形成。

表5分子对接得到的参数

实施例9药效团模拟

药效团模型是指对特定药物的活性有重要影响的“药效学表征因子”之间的空间关系。一种化学物质的活性可以用它的分子结构和物理化学特征来描述，包括电子、疏水和空间性质。在此基础上，建立了构象关系模型。药效团模型是研究不同糖苷酶抑制肽之间构象关联的定性方法。

选择6种α-葡萄糖苷酶抑制肽的训练集进行模型开发，用于训练的相关数据集如表6所示。样品在训练集中观察到的范围内显示出抑制活性。

表6药效团模型的训练集数据集

注:为了便于IC

从肽训练集中，生成10个药效团模型。然后将样品与这些模型进行匹配，得到的药效团热图描述了模型与肽之间的相似程度。红色表示匹配度高，蓝色表示匹配度低。训练集的结果如图8所示。共提出10个假设，“Rank”得分在62.879-61.225之间。Max Fit值为4，这意味着这些模型的“签名”由四种模式组成。Hypro 1符合“PHDD”模式，即包含一个正离子中心、一个氢键给体和两个氢键给体。Hypro 2和Hypro 4符合“PDAA”模式，但空间结构不同，均含有一个正离子中心、一个氢键给体和两个氢键受体。Hypro 3、Hypro 7和Hypro 10符合“PDDA”模式，即含有1个正离子中心、2个氢键给体和1个氢键受体。Hypro 5符合“PHDA”模式，即含有1个正离子中心、1个疏水中心、1个氢键给体和1个氢键受体。Hypro 8和9符合“PDDD”模式，即它们含有1个正离子中心和3个氢键给体。

为了确定多肽中存在可比较的结构属性，与十个假设进行了比较。使用热图和肽分子匹配图直观地说明了这些发现。热图中红色和橙色区域的存在表明肽与药效团模型之间存在有效的对应关系。如图9所示，药效团模型中大部分活性肽与药效团模型匹配良好，其中匹配最好的是Hypro 5。如图10所示，三种多肽与Hypro 5的匹配结果良好。这表明这3种肽具有与训练集相似的较强α-葡萄糖苷酶抑制活性。药效团结果进一步证实了氢键和静电相互作用对这些肽抑制α-葡萄糖苷酶的作用的重要意义。

实施例10测定溶解度

将3个多肽样品(P1、P2和P3)分别分散于去离子水中使其浓度为2mg/mL，室温下搅拌1h充分溶解，静置2min后，将上清液倒入离心管中，在10000r/min条件下离心20min。溶解度通过公式计算：

式中：S—溶解度(％)；m

为了验证在线数据库预测的准确性，进一步测定了三种多肽的溶解度。由图11所知，P1、P2和P3的溶解度分别为86.7％、82.97％和87.4％，结果表明三种多肽均具有很好的溶解性，与在线数据库的预测结果相符合。

实施例11测定毒性

采用CCK-8试剂盒测定多肽对细胞的毒性，CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司，该试剂盒包括CCK-8培养液。将HepG2细胞以1×10

细胞存活率(％)＝(A

式中：A

为了验证在线数据库预测的准确性，采用CCK-8法测定多肽给药后HepG2细胞存活率，由此来表征多肽的毒性。有图12所知，三种多肽的细胞存活率均在100％以上，表明P1、P2和P3这三种多肽均不影响细胞的生长，与在线数据库预测的无毒性结果相符合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。