米托蒽醌纳米药物制备及在胰腺癌靶向治疗中的应用

技术领域

本发明涉及米托蒽醌纳米药物的制备及在胰腺癌靶向治疗中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

胰腺癌是消化系统中致死率最高的恶性肿瘤之一，具有高度侵袭性和转移性，每年死亡人数超过20万例。由于胰腺癌早期缺乏典型临床表现，诊断困难，80％的患者在确诊时已是晚期，失去手术的最佳时机。因此，化疗起着非常重要的作用，但疗效较差，并具有严重的副作用，临床应用受到很大的限制。为了改善目前的情况，研究者们开发了各种聚合物纳米粒子来作为药物运载体，直径普遍在10-200nm左右，并利用其各种各样的优点，包括靶向性、刺激反应释放等，以有效提高肿瘤的治疗效果。如何提高胰腺癌患者的生存率一直是困扰国内、外学者的难题。由于胰腺癌淋巴液引流不畅，利用高渗透长滞留及靶向效应，适宜大小的纳米药物可以通过小血管和相对不紧密的细胞间隙进入肿瘤，在肿瘤中停留数天的时间，并被动及主动富集至一个相对高的浓度。聚合物纳米粒子治疗胰腺癌的研究目前并不常见，尚处于探索研究阶段。透明质酸(HA)是一种酸性粘多糖，是细胞外基质的主要组成部分，其结构是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺构成的重复单元，具有较好的水溶性和生物相容性，可生物降解。更重要的是，透明质酸还具有CD44受体靶向性，可以积累聚集于CD44受体过表达的多种恶性肿瘤组织中，增加局部药物含量，因而被广泛研究应用于纳米载药领域。米托蒽醌盐酸盐(Mitoxantrone HCl，MITO)，通过和DNA分子结合，抑制核酸合成而导致细胞死亡，是为细胞周期非特异性药物。本发明在前期研究工作基础上，构建以透明质酸为靶向药物载体，包裹米托蒽醌合成MITO@HA纳米药物，用于胰腺癌抗肿瘤治疗(如图1)。

发明内容

本发明的目的是为解决如何制备米托蒽醌纳米药物，以及该纳米药物在胰腺癌靶向治疗上应用的技术问题。

为达到本发明的目的，本发明提供一种米托蒽醌纳米药物的制备方法，包括将米托蒽醌盐酸盐溶液加入透明质酸钠溶液中，通过透析，冻干，得到米托蒽醌-透明质酸纳米药物粉末。

本发明提供一种米托蒽醌-透明质酸纳米药物，包括米托蒽醌和透明质酸，米托蒽醌和透明质酸结合形成米托蒽醌-透明质酸纳米靶向药物。

本发明提供一种米托蒽醌-透明质酸纳米药物在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。

本发明提供一种治疗胰腺癌的治疗系统，包括：用药系统；所述用药系统中含有米托蒽醌-透明质酸纳米药物。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

在本发明中，HA被选择合成透明质酸/米托蒽醌/MITO@HA纳米药物，与传统的化疗药物相比，聚合物纳米颗粒负载的抗肿瘤药物具有优势：(1)靶向治疗；(2)增强在肿瘤中的积累。MITO@HA纳米药物可以通过积极靶向胰腺癌肿瘤表面的CD44受体和EPR作用(实体瘤的高通透性和滞留效应enhanced permeability and retention effect)，增强其抗肿瘤疗效，减少毒副作用。

与MITO组比较，MITO@HA对胰腺癌细胞周期G0/G1期阻滞、细胞凋亡增加、细胞克隆减少、细胞迁移及侵袭抑制。动物实验结果显示：MITO@HA纳米药物对胰腺肿瘤有明显抑制效果。通过血液生化指标检测，进一步证实了MITO@HA纳米粒子的生物安全性，可有效降低化疗药物对动物的损伤，同时MITO@HA还能增强化疗药物抗肿瘤效果。具有CD44受体靶向性的MITO@HA纳米粒子能够有效降低药物系统毒性，同时增强对胰腺癌肿瘤的治疗效果，为临床靶向治疗胰腺癌提供了可能。

附图说明

图1为MITO@HA体外和体内抗肿瘤作用研究示意图。

图中缩写：MITO：米托蒽醌；HA：透明质酸。

图2为CD44在胰腺癌症细胞中的表达相关实验结果图。

图3为MITO@HA纳米药物制备完成的验证实验相关结果图。

图4为MITO@HA纳米药物体外研究相关实验结果图。

图5为MITO@HA纳米药物体内研究相关实验结果图。

图6为MITO@HA纳米药物体内毒性评估相关实验结果图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明提供一种米托蒽醌纳米药物的制备方法，包括将米托蒽醌盐酸盐溶液加入透明质酸钠溶液中，通过透析，冻干，得到米托蒽醌-透明质酸纳米药物粉末。

本发明提供一种米托蒽醌-透明质酸纳米药物，包括米托蒽醌和透明质酸，米托蒽醌和透明质酸结合形成米托蒽醌-透明质酸纳米靶向药物。

本发明提供一种米托蒽醌-透明质酸纳米药物在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

上述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。

本发明提供一种治疗胰腺癌的治疗系统，包括：用药系统；所述用药系统中含有米托蒽醌-透明质酸纳米药物。

实施例

一、MITO@HA纳米药物制备：

用天平称取300mg透明质酸钠，将其溶于50ml去离子水中，搅拌10min使其充分溶解。然后称取30mg米托蒽醌盐酸盐并溶解于5ml去离子水中，待溶解充分，逐滴加入透明质酸钠溶液中(3-4滴/min)，搅拌过夜。额外游离的药物通过透析法(MWCO 3500Da)透析24小时去除，最后将溶液冻干，得到MITO@HA粉末。所有过程都需避光处理。MITO@HA的粒径、载药量(DLC)和载药率(DLE)通过紫外光谱法和电感耦合等离子体原子发射光谱法测定。DLC和DLE通过以下公式计算：

DLC(wt.％)＝(纳米粒子负载的药物的质量)/(药物总量-纳米粒子质量)×100％

DLE(wt.％)＝(纳米粒子负载的药物的质量)/(总投入的药物的质量)×100％

二、CD44在胰腺癌症细胞中的表达：

通过流式细胞仪测定PANC-1胰腺癌细胞CD44表达水平；结果显示(如图2中A图)显示99.9％的胰腺癌细胞显著的过表达CD44。胰腺癌细胞及组织免疫组化均显示高表达CD44。(如图2中B图、C图)。

三、MITO@HA纳米药物应用的相关实验：

3.1MITO@HA纳米药物制备完成的验证实验：

首先，用盐酸米托蒽醌标准水溶液配置为不同浓度(10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、35μg/ml、50μg/ml、75μg/ml)，以610nm为最大吸收峰的紫外分光光度计测定紫外吸收光谱，确定不同浓度药物与吸光度的线性关系为标准曲线(如图3中A图和B图)。通过测量MITO@HA在610nm处的吸光度，计算出MITO@HA的包封速率和载药量分别为45.82±1.72％和4.15±0.82％(如图3中C图)。说明透明质酸和米托蒽醌通过静电相互作用成功自组装。为胰腺癌的后续主动靶向治疗提供了依据。然后，分析了纳米离子的形态特征和粒径分布。MITO@HA通过动态光散射纳米激光粒径MITO@HA仪测量的平均水合粒径为51.4±2.3nm，透射电镜图中的粒径与粒度分析测量的粒径一致。同时，它在MITO@HA zeta电位(-26.1±3.2mV)的表面具有较高的静电稳定性(如图3中D图)。

3.2筛选MITO@HA有效浓度：

CCK-8法用MITO和MITO@HA分别以不同浓度，1μg/ml、2.5μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL体外治疗胰腺癌细胞，发现MITO@HA组相对于MITO组更加显著抑制了细胞的增殖(如图3中E图)。将μg/mL的浓度转换为μmol/L，通过疗效和毒性评估七个不同浓度的MITO@HA治疗胰腺癌细胞在0天，1天，2天和3天的情况，结果显示：MITO@HA最合适的浓度和时间为0.5μmol/L和2天(如图3中F图)。

3.3体外研究相关实验：

胰腺癌细胞实验显示：MITO@HA最合适的治疗浓度和时间为0.5μmol/L和2天；与MITO组相比，MITO@HA对胰腺癌有细胞周期G0/G1期阻滞，细胞凋亡增加，细胞克隆性减少，细胞迁移和侵袭抑制。

3.3.1细胞周期实验：

细胞周期实验结果(如图4中A图)显示，对照组、MITO组和MITO@HA组各组的平均百分比分别为24.91±1.42％、39.37±1.27％和42.67±0.944％，说明纳米颗粒影响了PANC-1胰腺癌细胞的循环活性，导致大部分细胞处于G0/G1期阻断(P<0.0001)。

3.3.2细胞凋亡实验：

凋亡实验结果显示(如图4中B图)；Control、MITO和MITO@HA组的总凋亡率(早期凋亡率Q4和晚期凋亡率Q2)的平均百分比分别为3.01±0.12％、5.30±0.49％和7.28±0.59％(P<0.0001)。MITO@HA对PANC-1胰腺癌细胞凋亡的影响最大。

3.3.3细胞的迁移和侵袭实验：

细胞迁移和侵袭的结果(如图4中C图所示)，对照组中PANC-1细胞的平均迁移和侵袭率为280.75±18.51％，这与胰腺癌快速转移的特征相一致。MITO@HA组和MITO组的迁移率分别显著低于对照组(P<0.0001)。MITO组与MITO@HA组(P＝0.3539)之间的差异无统计学意义。同样，与对照组相比，MITO@HA组和MTO组的细胞侵袭率显著降低。以上结果表明，MITO对肿瘤生长过程有明显的抑制作用。此外，透明质酸HA在胰腺癌中靶向识别CD44受体，HA包被的MITO也能紧密粘附CD44受体，靶向抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。

3.3.4细胞克隆实验

细胞克隆结果显示(如图4中D图所示)；对照组、MITO组和MITO@HA组各组细胞克隆的平均百分比分别为100.00±3.56％、47.02±9.53％和45.02±7.38％。MITO@HA组中PANC-1胰腺癌细胞的克隆数量最小，明显低于对照组和MITO组。因此，我们认为透明质酸HA在胰腺癌中靶向CD44受体的识别，并在胰腺癌细胞的杀死中起着最重要的作用。此外，构建的MITO@HA纳米药物靶点集中在胰腺癌细胞的血浆中，释放MITO，从而显著阻断胰腺癌的G0/G1细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡，显著减少细胞克隆，抑制细胞迁移和侵袭。

3.4.体内研究的相关实验：

动物实验结果表明，MITO@HA纳米药物对胰腺肿瘤有显著的抑制作用。胰腺癌裸鼠肿瘤生长曲线(如图5中A图所示)，可以看出，对照组裸鼠肿瘤体积生长最快，而MITO@HA组的肿瘤生长速度较慢，说明其肿瘤抑制效果显著。各组裸鼠肿瘤的肿瘤质量(如图5中B图所示)显示，对照组的平均肿瘤质量为(2313.22±94.61)g，MITO@HA组的肿瘤质量为(1480.64±242.95)g；(P＝0.0052)。

为了进一步验证靶向肿瘤的抗肿瘤效果，我们对肿瘤组织进行了固定、切片、HE染色(如图5中C图所示)。结果显示，与对照组相比，MITO@HA组的肿瘤细胞出现了明显的大面积液化坏死，而对照组则未见明显的肿瘤坏死。以上结果表明，MITO@HA组对肿瘤有明显的抑制作用，并具有良好的肿瘤治疗效果。其原因是MITO@HA可以使更多的药物通过EPR作用(实体瘤的高通透性和滞留效应enhanced permeability and retention effect)到达肿瘤组织，而HA可以与细胞膜融合，将脂质吞入细胞中，增加肿瘤细胞的摄取。体内抗肿瘤实验进一步证明，表面修饰的HA可以通过被动和主动靶向进一步促进MITO@HA在肿瘤部位的积累和摄取，从而更好地发挥抑制肿瘤的作用。

3.5.体内毒性评估实验

在治疗过程中，每个组裸鼠的生化指标结果显示(如图6所示)，重要参数如白细胞、红细胞、PLT、ALT、AST、TBIL、ALB、CK、CK、CK-MB、LDH、LDB1、URES、肌酐、UA；MITO@HA组均显示正常，表明MITO@HA组具有良好的安全性。本研究通过血液生化指标的检测，进一步证实了MITO@HA纳米颗粒的生物安全性，可以有效降低化疗药物对动物的损伤，同时，MITO@HA也能增强化疗药物的抗肿瘤作用。综上所述，具有CD44受体靶向作用的MITO@HA纳米颗粒可以有效降低药物系统的毒性，提高胰腺癌肿瘤的治疗效果，为临床靶向治疗胰腺癌提供了可能。

如图1所示，为MITO@HA抗肿瘤作用研究示意图；

如图2所示，为CD44在胰腺癌症细胞中的表达相关实验结果图。其中，A图：流式细胞术显示99％的胰腺癌细胞表达CD44。B图、C图显示胰腺癌细胞和组织中CD44高表达(棕色)。

如图3所示，为MITO@HA纳米药物制备完成的验证实验相关结果图。其中，A图-D图为MITO和MITO@HA的表征。E图为MITO和MITO@HA改变了不同浓度下的细胞存活率。F图为MITO@HA在不同浓度和不同治疗时间下，胰腺癌细胞的存活率和抑制率差异有统计学意义(统计学P值)。

如图4所示，为MITO@HA纳米药物体外研究相关实验结果图；其中A图-D图为细胞周期变化的比较。在显微镜下，对照组、MTIO@HA组和MITO组的PANC-1细胞凋亡增加，细胞迁移和侵袭减少，细胞克隆减少。各组细胞功能差异有统计学意义(P值有统计学意义)。

如图5所示，为MITO@HA纳米药物体内研究相关实验结果图；与对照组相比，A图显示MITO@HA纳米药物组使胰腺癌动物的肿瘤生长曲线减慢。B图显示MITO@HA纳米药物组在肿瘤生长26天后，肿瘤重量较轻。C图中HE染色显示MITO@HA引起肿瘤大量坏死。各组间差异有统计学意义(P值)。

如图6所示，为MITO@HA纳米药物体内毒性评估相关实验结果图。

与对照组相比，MITO@HA组血常规正常，肝肾功能指标正常，心肌酶谱正常。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。