双相组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及双相组织工程支架及其制备方法。

背景技术

髋关节发育不良(development dysplasia of the hip，DDH)是一种由于髋臼先天发育缺陷，造成髋臼对股骨头区域覆盖不良，使髋关节负重面的应力显著增大，继而引发关节退行性变，关节周围骨赘形成等病变。髋关节发育不良是导致骨性关节炎的显著危险因素，如果不能及时通过治疗纠正，晚期将导致严重的骨性关节炎，显著增加关节置换的发生率。

目前，可以采用关节镜下自体髂骨髋臼“加盖术”来治疗髋关节发育不良，通过在髋臼缘加装自体移植物，以增加髋臼覆盖面积。

然而，该种方式存在覆盖范围不足、缺少软骨区、髂骨取材部位并发症、解剖形态不匹配等问题。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种双相组织工程支架及其制备方法，能够解决上述技术问题。

具体而言，包括以下的技术方案：

一方面，提供了一种双相组织工程支架，所述双相组织工程支架包括：成骨支架、连接于所述成骨支架一端的成软骨支架；

其中，所述成骨支架采用3D打印工艺制备得到；

所述成软骨支架通过模具灌注工艺制备得到。

在一些可能的实现方式中，所述成骨支架的材质为聚己内酯。

在一些可能的实现方式中，所述成软骨支架包括：丝素蛋白支架主体和掺杂于所述丝素蛋白支架主体的BMP-2重组蛋白。

另一方面，提供了一种双相组织工程支架的制备方法，所述双相组织工程支架如上述任一所示，所述双相组织工程支架的制备方法包括：

利用3D打印工艺打印成骨支架；

在所述成骨支架的表面交联多巴胺，并对交联有多巴胺的成骨支架进行矿化处理，得到矿化的成骨支架；

提供具有成骨支架型腔和成软骨支架型腔的模具，将所述矿化的成骨支架放入所述模具的成骨支架型腔，然后将成软骨支架原料液置入所述模具中，使所述成软骨支架原料液充满所述成软骨支架型腔并浸润所述矿化的成骨支架；

对所述模具进行冷冻处理，解冻后，从所述模具中取出所述双相组织工程支架。

在一些可能的实现方式中，所述成骨支架的材质为聚己内酯；

所述成软骨支架包括：丝素蛋白支架主体和掺杂于所述丝素蛋白支架主体的BMP-2重组蛋白。

在一些可能的实现方式中，所述利用3D打印工艺打印成骨支架，包括：

利用3D打印机对液化的聚己内酯进行打印，以0.5MPa～1MPa的压力、5mm/s～10mm/s的打印速率、直径为250μm～350μm的喷嘴挤出聚己内酯型材，制备得到所述成骨支架。

在一些可能的实现方式中，所述在所述成骨支架的表面交联多巴胺，并对交联有多巴胺的成骨支架进行矿化处理，得到矿化的成骨支架，包括：

将所述成骨支架浸泡于多巴胺溶液中3小时～5小时，待所述多巴胺溶液变黑，得到所述交联有多巴胺的成骨支架；

将所述交联有多巴胺的成骨支架浸泡于SBF模拟体液中，在35℃～38℃下静置7天-14天，取出并清洗，得到所述矿化的成骨支架。

在一些可能的实现方式中，所述制备方法还包括制备混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液，包括：

将丝素蛋白固体溶解于去离子水中，然后进行离心处理，取清澈的液体层进行紫外杀菌，得到丝素蛋白水溶液；

将BMP-2重组蛋白溶解于所述丝素蛋白水溶液，得到所述混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液。

在一些可能的实现方式中，通过滴加的方式，将所述成软骨支架原料液置入所述模具中。

在一些可能的实现方式中，所述对所述模具进行冷冻处理，包括：

将所述模具置于-90℃～-70℃环境中进行一次冷冻，然后在置于-8℃～-5℃的乙醇中二次冷冻。

本发明实施例提供的技术方案的有益效果至少包括：

本发明实施例提供的双相组织工程支架，包括成骨支架和成软骨支架，其中，成骨支架采用3D打印工艺制备得到，基于3D打印工艺能够实现符合解剖形态的复杂支架设计，使得成骨支架的形态能够符合解剖形态，进而在应用时获得足够的覆盖范围。成软骨支架通过模具灌注工艺制备得到，使其能够一体成型并连接于成骨支架的一端，使得该双相组织工程支架具有软骨面，利用成软骨支架来诱导成骨成软骨，这有效提高该双相组织工程支架的生物活性，从而避免自体取骨，减少手术创伤，适应于对DDH患者的个性化及微创治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的由第一视角获取的双相组织工程支架的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的由第二视角获取的双相组织工程支架的结构示意图；

图3为实施例1制备得到的双相组织工程支架在不同视角下的照片。

附图标记分别表示：

1-成骨支架；

2-成软骨支架。

通过上述附图，已示出本申请明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本申请构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本申请的概念。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本申请实施例所用的所有技术术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下面对本申请实施例中出现的一些技术术语进行说明。为使本申请的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。

目前，针对髋关节发育不良(development dysplasia of the hip，DDH)，可以采用关节镜下自体髂骨髋臼“加盖术”来治疗髋关节发育不良，通过在髋臼缘加装自体移植物，以增加髋臼覆盖面积。

然而，该种方式存在覆盖范围不足、缺少软骨区、髂骨取材部位并发症、解剖形态不匹配等问题。

针对现有技术存在的技术问题，本发明实施例提供了一种双相组织工程支架，如附图1和附图2所示，该双相组织工程支架包括：成骨支架1、连接于成骨支架1一端的成软骨支架2；其中，成骨支架1采用3D打印工艺制备得到；成软骨支架2通过模具灌注工艺制备得到。

本发明实施例提供的双相组织工程支架，包括成骨支架1和成软骨支架2，其中，成骨支架1采用3D打印工艺制备得到，基于3D打印工艺能够实现符合解剖形态的复杂支架设计，使得成骨支架1的形态能够符合解剖形态，进而在应用时获得足够的覆盖范围。成软骨支架2通过模具灌注工艺制备得到，使其能够一体成型并连接于成骨支架1的一端，使得该双相组织工程支架具有软骨面，利用成软骨支架2来诱导成骨成软骨，增加髋臼面积，增加软骨区域，这有效提高该双相组织工程支架的生物活性，从而避免自体取骨，减少手术创伤，适应于对DDH患者的个性化及微创治疗。

对于双相组织工程支架的结构可以参见以下示例性描述：

成骨支架1作为双相组织工程支架的主体部分，其结构决定了双相组织工程支架在患者的骨缺损区的覆盖范围和效果。在一些示例中，成骨支架1的体积大于成软骨支架2的体积，例如，成骨支架1的体积为成软骨支架2的体积的至少5倍，进一步地，至少10倍等。

成软骨支架2连接于成骨支架1的末端即可，根据患者的骨缺损区域的尺寸和结构来适应性地确定双相组织工程支架的结构即可。

作为一种示例，双相组织工程支架可以设计成弧面梯形块状结构，其包括上弧面、下弧面、第一角形侧面、第二角形侧面和端弧面。

参见图1和图2，上弧面和下弧面均向上凸起，例如，两者的弧度可以一致。上弧面的第一端和下弧面的第一端相重合，上弧面的第二端位于上方，下弧面的第二端位于下方，上弧面的第二端与下弧面的第二端之间形成端弧面。第一角形侧面形成于上弧面的第一侧和下弧面的第一侧，第二角形侧面形成于上弧面的第二侧和下弧面的第二侧。在一些示例中，第一角形侧面和第二角形侧面均为直角三角形。

对于上述弧面梯形块状结构的双相组织工程支架，成软骨支架形成于该双相组织工程支架的第一端处，可以理解的，此处涉及的双相组织工程支架的第一端与上述的上弧面和下弧面的第一端是相同的。

在一些示例中，成骨支架的宽度为成软骨支架的宽度的1.5～3倍，例如，为1.6倍、1.7倍等，其中，此处涉及的长度为双相组织工程支架的自其第一端至其第二端的方向上的尺寸。举例来说，成骨支架的宽度例如为2.5mm，成骨支架的宽度可以为1.5mm。

在一些示例中，成骨支架和成软骨支架的沿弧形方向的弧形长度相同，举例来说，成骨支架和成软骨支架的弧形长度均可以为6mm～8mm。

在一些示例中，成骨支架的高度为成软骨支架的高度的1～5倍，其中，该高度指的是上弧面和下弧面在相应位置处的间距。可以理解地，自双相组织工程支架的第一端至其第二端，双相组织工程支架的高度逐渐增大。举例来说，成骨支架的最大高度为3mm，成软骨支架的最大高度为1mm，可以理解的，成软骨支架的最小高度可以认为是0.001mm，因为在第一端，上弧面和下弧面重合。

在一些可能的实现方式中，成骨支架的材质为聚己内酯，以及，成软骨支架包括丝素蛋白支架主体和掺杂于丝素蛋白支架主体的BMP-2重组蛋白。也就是说，BMP-2重组蛋白至少能够掺杂于丝素蛋白支架主体的内部。

在一些示例中，每1mg的丝素蛋白支架主体中，BMP-2重组蛋白的掺杂量为0.000003mg～0.000008mg，例如，这包括但不限于：0.000003mg、0.000004mg、0.000005mg、0.000006mg、0.000007mg、0.000008mg等。

聚已内酯(PCL)引起具备良好的生物相容性及力学性质，能够用作3D打印生物支架。丝素蛋白(SF)是蚕丝中提取的天然高分子材料，其安全且无免疫原性，通过丝素蛋白携带并释放BMP-2能够局部诱导成骨及成软骨。

可见，本发明实施例通过将聚已内酯和丝素蛋白作为支架材料，具有材料安全环保、力学性质稳定、生物相容性好，且可降解等优点。

另一方面，本发明实施例还提供了一种双相组织工程支架的制备方法，该双相组织工程支架如上述任一所示，该双相组织工程支架的制备方法包括：

步骤1、利用3D打印工艺打印成骨支架。

步骤2、在成骨支架的表面交联多巴胺，并对交联有多巴胺的成骨支架进行矿化处理，得到矿化的成骨支架。提供具有成骨支架型腔和成软骨支架型腔的模具，将矿化的成骨支架放入模具的成骨支架型腔，然后将成软骨支架原料液置入模具中，使成软骨支架原料液充满成软骨支架型腔并浸润矿化的成骨支架。

步骤3、对模具进行冷冻处理，解冻后，从模具中取出双相组织工程支架。

本发明实施例提供的双相组织工程支架的制备方法，通过3D打印工艺打印成骨支架，通过在成骨支架的表面交联多巴胺，以增加成骨支架的表面活性，增加亲水性，提高后续表面矿化效果。通过交联有多巴胺的成骨支架进行矿化处理，在成骨支架的表面形成钙磷沉积，以促进成骨。然后，利用具有成骨支架型腔和成软骨支架型腔的模具在成骨支架上成型成软骨支架，在制备成软骨支架的过程中，通过对模具进行冷冻处理，确保成软骨支架的有效成型。

在一些示例中，成骨支架的材质为聚己内酯；成软骨支架包括丝素蛋白支架主体和掺杂于丝素蛋白支架主体的BMP-2重组蛋白。

聚已内酯(PCL)引起具备良好的生物相容性及力学性质，能够用作3D打印生物支架。丝素蛋白(SF)是蚕丝中提取的天然高分子材料，其安全且无免疫原性，通过丝素蛋白携带并释放BMP-2能够局部诱导成骨及成软骨。

在一些示例中，利用3D打印工艺打印成骨支架，包括：

利用3D打印机对液化的聚己内酯进行打印，以0.5MPa～1MPa的压力、5mm/s～10mm/s的打印速率、直径为250μm～350μm的喷嘴挤出聚己内酯型材，制备得到成骨支架。

在一些示例中，利用180℃～250℃的温度溶解聚己内酯固体原料，例如，溶解时间为30分钟～40分钟，其中，聚己内酯固体原料的分子量可以为50000-60000。然后，按照预先定义的成骨支架内部仿生微观结构，以0.5MPa～1MPa的压力、5mm/s～10mm/s的打印速率、直径为250μm～350μm的喷嘴挤出聚己内酯型材，制备得到成骨支架。

其中，上述涉及的成骨支架内部仿生微观结构，指的是，打印过程中所形成的PCL纤维的间距，也就是说，在打印时，PCL纤维之间的间距要符合仿生成骨的需求。

在一些示例中，在成骨支架的表面交联多巴胺，并对交联有多巴胺的成骨支架进行矿化处理，得到矿化的成骨支架，包括：

将成骨支架浸泡于多巴胺溶液中3小时～5小时，待多巴胺溶液变黑，得到交联有多巴胺的成骨支架。其中，多巴胺溶液所使用的溶剂为pH8.5的Tris缓冲液，多巴胺浓度为2mg/mL。

将交联有多巴胺的成骨支架浸泡于SBF模拟体液中，在35℃～38℃下静置7天-14天，取出并清洗，得到矿化的成骨支架。

举例来说，将成骨支架浸泡于多巴胺溶液中3小时～5小时，待多巴胺溶液变黑，用PBS溶液冲洗，得到交联有多巴胺的成骨支架。

将交联有多巴胺的成骨支架浸泡于SBF模拟体液中，在35℃～38℃下静置7天-14天以进行钙磷沉积矿化，取出并利用PBS溶液清洗，得到矿化的成骨支架。其中，SBF模拟体液可以采用上海源叶生物生产并销售的产品，其PH为7.3。

在一些示例中，本发明实施例涉及的制备方法还包括：制备混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液，这包括：

将丝素蛋白固体溶解于去离子水中，然后进行离心处理，取清澈的液体层进行紫外杀菌(以将离心后未溶解的丝素蛋白直接去除)，得到丝素蛋白水溶液。其中，丝素蛋白固体的去离子水溶液的质量浓度为5％～10％。

将BMP-2重组蛋白溶解于丝素蛋白水溶液，得到混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液。

举例来说，混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液的制备操作包括：

按照需要的质量浓度，用去离子水溶解未被挤压受力过的丝素蛋白固体，手摇数分钟使其溶解，然后在3500rpm～4000rpm下离心一定时间，例如离心3min～5min，然后，取出中间清澈的液体，利用超净台的紫外灯进行紫外杀菌30min～50min即可。

其中，选用未被挤压受力的丝素蛋白固体作为原料，以防止其结构发生变化，确保丝素蛋白固体的结构良好。

根据BMP-2重组蛋白的掺杂量来确定混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液的质量浓度。

举例来说，BMP-2重组蛋白在该丝素蛋白溶液中的浓度为400ng/ml～700ng/ml，例如，这包括但不限于：400ng/ml、450ng/ml、500ng/ml、550ng/ml、600ng/ml、650ng/ml、700ng/ml等。

其中，丝素蛋白固体采用如下方法制备得到：

取蚕茧(例如15g左右)，剪碎(碎片尺寸为1cm*0.3cm左右即可)。取一定量的无水碳酸钠，溶解在去离子水中，加热煮沸，例如，取4.24g无水碳酸钠，溶解在2L的去离子水中，加热煮沸。

将蚕茧倒入碳酸钠溶液中，煮沸，例如，蒸煮时间为20min～30min，脱去丝胶。将残留的白色海绵取出，用去离子水冲洗多次，之后37℃过夜充分烘干。按丝素蛋白：溴化锂＝1:4的质量比，计算需要的溴化锂质量，按9.3mol/L的比例计算配备相应溴化锂溶液需要的总体积(约62.5ml)。取70％总体积的去离子水，边搅拌边缓慢添加溴化锂粉末，完全溶解后倒入量筒，并补齐还缺的体积量。

将丝素蛋白海绵充分挤压至100mL烧杯中，将溴化锂溶液缓慢倒入烧杯，将丝素蛋白海绵完全浸没，密封后在50℃～60℃中加热搅拌，例如，搅拌时间为3h～4h，令其完全溶解，得到黄色粘稠溶液。

将该黄色粘稠溶液倒入透析袋中进行透析处理(装25％左右的体积即可)，一天换1-2次水，累计换5次水即可(析出溴化锂)，得到蛋白溶液。

将蛋白溶液倒入大烧杯中，分装到离心管中，并在4℃以及9000rpm条件下离心20min，取出上清液之后再次离心20min。将所得到的离心溶液分装到不同的离心管中，-20℃冷冻之后冻干脱水，得到丝素蛋白固体，室温保存。

在一些示例中，通过滴加的方式，将成软骨支架原料液置入模具中。例如，将混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液滴加进模具中，待其充分浸润后，析出多余的溶液，无菌环境下密封。

在一些示例中，对模具进行冷冻处理，包括：将模具置于-90℃～-70℃环境中进行一次冷冻，然后在置于-8℃～-5℃的乙醇中二次冷冻。

例如，将模具置于-80℃进行一次冷冻，然后在置于-6℃的乙醇中二次冷冻2天，待解冻后，从模具中取出该双相组织工程支架。

通过一次冷冻，以便于快速冷冻成型，通过二次冷冻，以形成期望的丝素蛋白支架主体结构。

综上可知，本发明实施例提供的双相组织工程支架及其制备方法至少具有以下优点：

采用3D打印工艺和模具灌注工艺来制备得到成骨-成软骨的双相组织工程支架，即可充分发挥3D打印优势，制备出符合解剖形态的支架主体，并且，又能够实现可降解并可诱导成骨成软骨，增加髋臼面积，增加软骨区域，赋予该双相组织工程支架高效生物性，从而避免自体取骨，减少手术创伤。

另外，聚已内酯和丝素蛋白制备的支架，安全环保、力学性质稳定、生物相容性好，且可降解。

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例1

本实施例1提供了一种双相组织工程支架，该双相组织工程支架包括：成骨支架、连接于成骨支架一端的成软骨支架。该双相组织工程支架为弧面梯形块状结构，其包括上弧面、下弧面、第一角形侧面、第二角形侧面和端弧面。

成骨支架的材质为聚己内酯，以及，成软骨支架包括丝素蛋白支架主体和掺杂于丝素蛋白支架主体的BMP-2重组蛋白。

该双相组织工程支架通过以下制备方法制备得到：

在200℃的温度下融解聚己内酯固体原料，溶解时间为30分钟，其中，聚己内酯固体原料的分子量为50000-60000。然后，按照预先定义的成骨支架内部仿生微观结构，以0.7MPa的压力、7mm/s的打印速率、直径为300μm的喷嘴挤出聚己内酯型材，制备得到成骨支架。

将成骨支架浸泡于多巴胺溶液中4小时，待多巴胺溶液变黑，用PBS溶液冲洗，得到交联有多巴胺的成骨支架。

将交联有多巴胺的成骨支架浸泡于SBF模拟体液中，在37℃下静置14天取出并利用PBS溶液清洗，得到矿化的成骨支架。其中，SBF模拟体液采用上海源叶生物生产并销售的产品，其PH为7.3。

用去离子水溶解未被挤压受力过的丝素蛋白固体(质量浓度为10％)，手摇数分钟使其溶解，然后在4000rpm下离心3min，然后，取出中间清澈的液体，利用超净台的紫外灯进行紫外杀菌30min即可。

将BMP-2重组蛋白溶解于丝素蛋白水溶液，得到混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液。将混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液滴加进模具中，待其充分浸润后，析出多余的溶液，无菌环境下密封。

将模具置于-80℃进行一次冷冻，然后在置于-6℃的乙醇中二次冷冻2天，待解冻后，从模具中取出该双相组织工程支架。

制备得到的双相组织工程支架可参见图3，其中不同视角展示了该双相组织工程支架的结构，其中，成骨支架外观显示为深色的不透明状，成软骨支架外观显示为浅色的较透明状，成骨支架和成软骨支架之间具有明显的移行区，这表明，在模具中灌注混合有BMP-2重组蛋白的丝素蛋白溶液时，存在部分丝素蛋白侵入至PCL成骨支架，使得成骨支架和成软骨支架能够稳定连接。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。