YAP/TAZ在制备治疗ED药物中的应用

技术领域

本发明涉及勃起功能障碍医药技术领域，更具体地说是涉及YAP/TAZ在制备治疗ED药物中的应用。

背景技术

勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)也被称为阳痿，特点是阴茎不能保持足够的勃起硬度以完成性活动。引起勃起功能障碍的因素有很多种，例如心理、肥胖、心血管疾病以及年龄因素。同时一些医疗手段会造成的较为严重的ED并发症，严重影响广大患者的生活质量。如前列腺癌治疗过程中常用的两种治疗手段：根治性前列腺切除术以及前列腺放射疗法都会造成严重的ED并发症。

口服PDE5抑制剂目前被认为是治疗勃起功能障碍的一线药物。这些药物通过抑制PDE5酶促进勃起，PDE5酶特异性降解海绵体平滑肌中的cGMP。这种抑制作用导致cGMP活性延长，从而进一步降低细胞内钙浓度，维持平滑肌松弛，从而导致勃起延长。虽然PDE5抑制剂是一种很好的一线治疗药物，但高达35％的勃起功能障碍患者可能对这种治疗无效，特别是PDE5抑制剂对前列腺癌治疗后引起的ED并发症无明显效果，因此，寻找新的ED治疗靶点成为亟待解决的事情。

当人们接受到性刺激时，非肾上腺能非胆碱能神经纤维中的神经型一氧化氮合酶(nNOS)和血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)合成并释放一氧化氮(NO)。产生的一氧化氮扩散穿过平滑肌细胞膜，激活可溶性鸟苷酸环化酶(GC)，进一步激活平滑肌细胞中的鸟苷酸环化酶(cGMP)，细胞质中cGMP增多并激活蛋白激酶G(PKG)，PKG磷酸化细胞内的一些相关蛋白和离子通道，使细胞超极化，降低胞内Ca

YAP/TAZ最初作为Hippo通路的效应分子并能够控制发育过程中器官的大小而被人们所关注。YAP/TAZ调控通路的研究主要集中在Hippo pathway。当Hippo pathway激活时，LATS1/2激酶能够磷酸化YAP/TAZ；YAP/TAZ因此滞留于细胞质中或者被降解；失去与其转录平台TEAD相结合的机会而失去其转录活性。YAP/TAZ在细胞质与细胞核之间穿梭被广泛的认为是检测YAP/TAZ活性的一个重要指标。YAP/TAZ核积累是其功能的关键决定因素。LATS的磷酸化是YAP/TAZ亚细胞定位的主要控制者，导致YAP/TAZ在细胞质降解。后续的研究发现YAP/TAZ的合理调控以及正常表达对生物体发育以及再生修复有极重要意义。例如：调控组织损伤后修复的稳态、决定细胞命运、感受细胞与细胞之间的接触抑制并调控细胞增殖。

YAP过表达显著提高肠细胞的增殖能力，而不影响整个器官的大小。有趣的是，核内YAP被局限于肠隐窝底部的肠干细胞中，并且在YAP过表达后，该细胞群可以扩展至绒毛顶端。在DSS处理后，缺乏YAP会损害上皮和隐窝的增殖，导致快速死亡，而YAP/TAZ的联合敲除会在体外培养中阻止隐窝生长，最终导致突变隐窝的死亡。此外，YAP和TAZ的联合敲除挽救了APC耗竭后Wnt通路急性激活引起的肠增生。在放射性肠损伤以及GSI诱导的肠炎损伤后，YAP/TAZ参与肠隐窝稳态的恢复过程。

YAP在转基因动物肝脏中的过表达足以诱导由成熟肝细胞增殖引起的肝脏质量增加四倍，这也导致肝细胞获得胆管祖细胞特征，而这种过度生长的表型则依赖于TEAD介导的基因反应。通过使用基因编辑模型删除肝脏中MST1/2或NF2/merlin时也观察到肝脏过度生长。在这些情况下，主要是由于卵圆细胞的增殖增强所导致的，卵圆细胞是肝脏损伤后肝细胞和胆管上皮细胞的祖细胞，尽管最近的谱系追踪数据表明Hippo突变小鼠中额外的卵圆细胞实际上是通过肝细胞的去分化获得的。肝肿大后会发展为混合特征的肿瘤，类似于肝细胞癌和胆管癌，与祖细胞如卵圆细胞的异常移动是相关的。此外，在Sav突变体中，肝损伤后卵圆细胞迅速扩张扩增。Nf2缺失的肝脏也会发生胆管错构瘤，发病远早于肝脏过度生长的迹象。重要的是，由于NF2失活导致的表型可以通过一个YAP等位基因的联合敲除得以挽救，确立了NF2是哺乳动物中YAP真正的上游调节因子。肝脏YAP特异性敲除导致肝细胞增殖减少和凋亡增加，但它也由于胆管细胞的功能障碍而诱导胆管形态发生缺陷，导致小鼠表现出轻度的肝脏肿大、脂肪变性和进行性纤维化。胆管结扎(胆汁淤积性损伤模型)后，YAP肝敲除小鼠显示出导管细胞增殖减少和实质损伤增强，提示YAP在肝再生中的积极作用。和需要YAP相似，NF2敲除的肝脏表型也可以通过AMOT敲除来挽救。这些结果与AMOT对体内YAP/TAZ功能的积极作用一致。胆汁酸稳态严重缺陷的小鼠具有增大的肝脏、祖细胞增殖和YAP激活，并有自发性肝脏肿瘤发生。

YAP/TAZ在维持各个器官的稳态及功能方面具有重要作用，目前已有多篇文献对包括肠、肝、胰腺及心脏等方面功能维持与YAP/TAZ相关的研究，且均展现出了YAP/TAZ的重要性。那么在阴茎勃起功能方面，YAP/TAZ的作用仍未有所探究。

因此，如何将YAP/TAZ蛋白应用于治疗ED的药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明以提高YAP/TAZ蛋白活性为靶点来制备治疗ED的药物，为PDE5抑制剂不敏感的ED患者寻找了新的治疗策略。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以YAP/TAZ为作用靶点在制备治疗ED药物中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护YAP/TAZ激动剂在制备治疗ED药物中的应用，所述YAP/TAZ激动剂包括PY-60。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种治疗ED的药物，所述药物包括：能够抑制YAP/TAZ降解的物质。

作为上述技术方案优选的技术方案，所述能够抑制YAP/TAZ降解的物质为PY-60。

作为上述技术方案优选的技术方案，ED包括对PDE5抑制剂不敏感的ED。

作为上述技术方案优选的技术方案，所述对PDE5抑制剂不敏感的ED包括BNCI导致的ED。

作为上述技术方案优选的技术方案，所述对PDE5抑制剂不敏感的ED包括双侧前列腺X射线辐照导致的ED

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本在现有较为经典的PDE5相关通路外，还发现了ED的新机制，即YAP/TAZ，研究发现YAP/TAZ在临床ED患者及各种ED模型中都表现出低水平，低活性。不仅如此，当阻断YAP/TAZ活性时，小鼠即表现出ED症状。在PDE5抑制剂治疗无效或低效的前列腺根治术后的ED小鼠中，采用诱导YAP/TAZ活性的治疗方法可以有效治疗ED，表明YAP/TAZ确实可能作为ED治疗的一个新靶点，且具有较大的药物靶点研究前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为敲除YAP、敲除TAZ、同时敲除YAP和TAZ后，小鼠勃起功能情况图；

图2附图为敲除YAP、敲除TAZ、同时敲除YAP和TAZ后，小鼠勃起功能情况图；

图3附图为同时敲除YAP和TAZ后，平滑肌细胞收缩能力图；

图4附图为同时敲除YAP和TAZ后，平滑肌细胞收缩能力图；

图5附图为大鼠BCNI后勃起功能的检测图；

图6附图为大鼠BCNI后对应时间点YAP/TAZ免疫荧光检测结果图；

图7附图为大鼠BCNI后对应时间点YAP/TAZ靶基因Ctgf的荧光定量PCR检测结果。*，p<0.05；**，p<0.01；

图8附图为对小鼠进行BCNI的手术导致其勃起功能障碍后，对小鼠进行YAP/TAZ激动剂PY-60处理后小鼠勃起功能的检测结果图；

图9附图为大鼠双侧前列腺局部X射线放射模拟前列腺癌治疗造成ED的模型后其勃起功能的检测图；

图10附图为X射线放射模拟前列腺癌治疗造成ED的模型后对应时间点YAP/TAZ免疫荧光检测结果图；

图11附图为大鼠双侧前列腺局部X射线放射模拟前列腺癌治疗造成ED的模型后对应时间点YAP/TAZ靶基因Ctgf的荧光定量PCR检测结果。*，p<0.05；**，p<0.01；

图12附图为采用YAP/TAZ抑制剂Verteporfin后小鼠勃起功能检测结果图；

图13附图为在小鼠平滑肌细胞中敲除YAP/TAZ后检测小鼠勃起功能的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了YAP/TAZ及相关基因与ED的关系，通过建立不同的ED模型进行验证，实施例中用到的检测方式和方法如下：

免疫荧光：组织冰冻切片4％多聚甲醛固定10分钟。浸入PBS洗3次，每次5分钟，在含有0.5％Triton X-100的PBS中打孔10分钟,浸入PBS洗3次，每次5分钟，在含有10％BSA和0.1％Triton X-100的PBS中封闭1h，一抗4℃孵育过夜，浸入PBS洗3次，每次5分钟。二抗室温孵育1.5h。浸入PBS洗3次，每次5分钟。Phalloidin室温孵育15分钟，最后加入ProLong-DAPI。

大小鼠勃起功能(ICP)检测：通过腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠或小鼠，将阴茎组织暴露，采用与导管相连接的23号针刺穿阴茎海绵体，同时用含有肝素及PBS的聚乙烯管插管右侧颈动脉，以持续监测平均动脉压(MAP)，两者都连接到一个压力传感器(Biopac system Inc,Goleta,CA,USA)。海绵体神经用一个与刺激器相连的双极电极刺激。刺激器设置为5伏1.5毫安，持续1分钟，两次刺激之间的最小间隔为5分钟。所有数据均由MP100数据采集系统记录，并使用Acqknowledge软件(Biopac System Inc.,Goleta,CA,USA)进行分析。所有ICP检测均由一人完成保证组内差异最小。

荧光定量PCR：收集液氮速冻的大小鼠阴茎组织，采用研磨棒将其碾碎，后加入1mlTrizol。冰上静置10min，加入200μl的氯仿，震荡30s，4℃12000r/min离心15min。抽取上层RNA于新的EP管中，加入500μl异丙醇，震荡混匀后室温静置20min，4℃12000r/min 10min，去上清。加入1ml 75％的冰乙醇，震荡混匀，7500r/min 5min，去上清，重复3次。室温干燥10min，加入适量DEPC水。55-60℃孵育10-15min。检测浓度，样品放置于-70℃保存。取RNA 1μg，逆转录的反应条件为：37℃15min，85℃5s。根据SYBR Green试剂盒配置反应体系：SYBRGreen 7.5μl，cDNA 5μl，上下游引物分别为0.4μl，DEPC水1.7μl。反应条件为：95℃10min，95℃10s，60℃20s，72℃30s，40个循环。实验结果采用相对定量法ΔΔCT进行分析，计算2

实施例1

基因编辑小鼠繁育：Myh11Cre

由图1和图2可知，单纯敲除YAP或TAZ均可以降低小鼠的勃起功能，当完全敲除YAP/TAZ时，小鼠的勃起功能基本消失，说明，可以将YAP/TAZ作为相关靶点，对勃起功能障碍进行治疗。

实施例2

基因编辑小鼠繁育及平滑肌细胞提取：Myh11Cre

将此两组细胞进行收缩舒张试验，具体如下：将各组细胞消化为细胞悬液，加入鼠尾胶原蛋白进行混合，将混合液加入平板中，待混合液凝固后，加入相应培养基，24小时后将胶从平板底部释放。再过24小时进行拍照，检测各组胶收缩舒张面积。

结果如图3和图4所示，与对照组相比，Y/T KO显著提高平滑肌细胞的收缩能力。提示YAP/TAZ敲除可以导致平滑肌细胞收缩能力的增强，平滑肌细胞收缩，导致阴茎勃起过程中充血不充分，勃起功能减弱或无法勃起，导致ED。

实施例3建立BCNI导致的大鼠ED模型

约250g雄性SD大鼠(通过苏州大学动物中心订购)用40mg/kg戊巴比妥钠麻醉。将动物放置于无菌布构造的一个无菌环境中，所有器械经高温高压灭菌消毒以保证无菌。沿动物腹部中线开一个1-2厘米的小口，采用无菌棉签寻找到位于前列腺后外侧的海绵体神经，尽量将海绵体神经分离出来，用止血钳夹海绵体神经，每侧每次4分钟。钳夹完后将伤口缝合，消毒。假手术组不钳夹海绵体神经，确认前列腺和海绵体神经后将伤口缝合，消毒。所有的BCNI和假手术均由一人完成保证组内差异最小，BCNI手术后的大鼠勃起功能检测见图5，由图5可知，大鼠在BCNI后勃起功能出现障碍，建模成功。

然后挑取建模成功后的小鼠，进行YAP/TAZ的免疫荧光检测，并对YAP/TAZ靶基因Ctgf进行荧光定量PCR检测，明确YAP/TAZ在勃起功能障碍中的作用。结果见图6～图7。说明，勃起功能障碍的小鼠，YAP/TAZ蛋白的表达水平和靶基因Ctgf的表达均降低，说明，YAP/TAZ蛋白、Ctgf与ED相关。

实施例4

在实施例1已经建立的BCNI小鼠模型中，采用YAP/TAZ激动剂PY-60对小鼠进行处理，PY-60浓度为2.5mg/kg，溶剂为DMSO。

PY-60在MCE公司订购，货号为HY-141644每两天打一次，共20天，后检测小鼠勃起功能，见图8。

实施例5双侧前列腺X射线辐照致大鼠ED模型

约250g雄性SD大鼠用40mg/kg戊巴比妥钠麻醉，采用俯卧位将大鼠放置于X射线小动物治疗仪X-RAD SmART上(Precision X-Ray Inc.,USA)。对大鼠整体进行CT扫描以获得3D图像，接着进一步详细的对腹腔及盆腔进行CT扫描以获得详细3D图像。通过膀胱位置判断前列腺所在位置，选择前列腺后外侧部分为照射部分，采用20Gy X射线单次照射所选位置。所有辐照位置选定均由一人完成保证组内差异最小。通过勃起功能检测、免疫荧光及YAP/TAZ靶基因Ctgf的(Ctgf只是用来显示YAP/TAZ发挥作用的检测手段，由于YAP/TAZ需要进入到细胞核内参与转录调控发挥作用，而在细胞质内不发挥作用，同时YAP的蛋白水平较为稳定，所以直接检测YAP的蛋白水平及RNA水平不能反映其活性，通过检测YAP/TAZ的转录活性，即其调控下游靶基因Ctgf，来确定YAP/TAZ活性。)荧光定量PCR检测明确YAP/TAZ在勃起功能障碍中的作用，见图9～图11，说明，YAP/TAZ与ED相关。

实施例6小鼠YAP/TAZ抑制剂模型

对小鼠进行避光腹腔注射Verteporfin 100mg/kg，注射体积为0.2ml/10g，注射后旋转拔针，压迫两分钟防止药液外流，一周三次，共两周。对小鼠前列腺后外侧神经节电刺激，检测ICP值以评估小鼠勃起功能，见图12。

实施例7

基因编辑小鼠繁育：Myh11Cre

由图13可知，抑制YAP/TAZ表达或者敲除YAP/TAZ，均可以引起小鼠的勃起功能障碍，说明，可以将YAP/TAZ作为相关靶点，对勃起功能障碍进行治疗。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。