一种第四代CAR-T细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种第四代CAR-T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术。这项技术是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，在白血病治疗领域已取得了巨大突破。

但是，在实体瘤的治疗上，此技术仍然存在诸多问题。科研人员正在努力试图对CAR-T疗法进行改进和优化，通过提高嵌合抗原受体的亲和力、敲除CAR-T细胞的PD-1等方法提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。

CN109153989A构建的CAR-T细胞可以持续分泌IL-7和CCL19，不仅提高了CAR-T细胞的体外扩增能力，而且招募到更多外周血循环T细胞和树突状细胞到肿瘤内，增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，分泌的CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，减少血液循环中的T细胞和树突状细胞的比例，从而降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率。

因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在实体瘤的治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种第四代CAR-T细胞及其应用，通过将IL-7的信号肽优化为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，并将CCL19的持续性分泌优化为NFAT调控性分泌，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，并降低了炎症副反应发生几率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种第四代CAR-T细胞，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；

所述IL-7的信号肽为IL-10信号肽；

所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。

本发明中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，使得CAR-T细胞将外源性IL-7分泌到胞外，IL-7增强了T细胞的体外增殖能力；采用NFAT调控启动子调控T细胞对CCL19的表达，当CAR-T细胞处于静息状态时，CCL19不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子3×NFAT-RE-IL-2启动对CCL19的转录和翻译，CCL19开始表达，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。

优选地，所述IL-10信号肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：MHSSALLCCLVLLTGVRA。

优选地，所述IL-7包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。

优选地，所述CCL19包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。

优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为PSCA。

优选地，所述抗原结合结构域为靶向PSCA的单链抗体。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。

优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域和CD3ζ的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

第二方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括嵌合抗原受体编码基因、IL-10信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控启动子和CCL19编码基因。

优选地，所述嵌合抗原受体编码基因包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

优选地，所述IL-10信号肽编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

SEQ ID NO:6：

atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggcc。

优选地，所述IL-7编码基因包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列；

SEQ ID NO:7：

gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac。

优选地，所述NFAT调控启动子包括SEQ ID NO:8所示的核酸序列；

SEQ ID NO:8：

gctttaaggcaagctttaaggcaagctttaaggcaaagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。

优选地，所述CCL19编码基因包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。

优选地，所述慢病毒载体还包括连接肽编码基因。

优选地，所述连接肽编码基因包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列；

SEQ ID NO:10：

aaaattgtcgctcctgtcaaacaaactcttaactttgatttactcaaactggctggggatgtagaaagcaatccaggtcca。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的第四代CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的慢病毒载体或第三方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的第四代CAR-T细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的第四代CAR-T细胞、第二方面所述的慢病毒载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建分泌IL-7和CCL19的CAR-T细胞，通过将IL-7的原有信号肽改变为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，使得CAR-T细胞能够将IL-7分泌到胞外，促进了CAR-T细胞的增殖；采用NFAT调控型启动子作为CCL19的启动子，使得CAR-T细胞条件性表达CCL19，免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部，提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效率；

(2)本发明的持续性分泌IL-7和条件性表达CCL19的第四代CAR-T细胞相较于第二代、第三代CAR-T细胞具有显著增强的肿瘤杀伤作用，在实体瘤治疗领域具有重要意义。

附图说明

图1为不同CAR-T细胞分泌IL-7和CCL19的结果；

图2为不同CAR-T细胞对T细胞的招募能力。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1表达分泌性IL-7及条件性CCL19的CAR-T细胞的制备

(1)慢病毒载体的制备

通过全基因合成以下核酸分子：

①由GM-CSF信号肽、PSCA scFv、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和2A肽的核酸序列串联形成的CAR分子；

②由IL-7信号肽(SEQ ID NO:11)、IL-7(不含IL-7信号肽)(SEQ ID NO:7)、2A肽(SEQ ID NO:10)和CCL19(SEQ ID NO:9)的核酸序列串联形成的核酸分子；

③由IL-10信号肽(SEQ ID NO:6)和IL-7(不含IL-7信号肽)(SEQ ID NO:7)的核酸序列串联形成的分泌性IL-7分子；

④由3×NFAT-RE-IL2启动子(SEQ ID NO:8)和CCL19(SEQ ID NO:9)串联形成的条件性CCL19分子；

SEQ ID NO:11：

atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatct。

将①克隆至慢病毒表达载体pwpxld-eGFP中；将①和②顺次克隆至慢病毒表达载体pwpxld-tCD19中；将①和③顺次克隆至慢病毒表达载体pwpxld-tCD19中，随后将④反向克隆至pwpxld-tCD19的末端。

(2)重组慢病毒包装

将辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G与慢病毒载体按比例混合后，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293T细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO

慢病毒载体包括表达CAR的慢病毒载体，表达CAR、完整IL-7和CCL的慢病毒载体，或表达CAR、分泌性IL-7、条件性CCL10的慢病毒载体。

(3)T细胞激活和慢病毒转染

通过Ficoll密度梯度法分离血液中的单个核细胞，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞后，通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，采用培养基AIM-V加5％FBS、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素稀释至浓度为2.5×10

去除T细胞中的磁珠，将激活后的T细胞在300g下离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入不同的CAR慢病毒载体、8μg/mL的polybrene和300IU/mL的IL-2，病毒加入量为MOI＝10，37℃、5％CO

将CAR-T细胞密度维持在1×10

本实施例制备的CAR-T细胞分别为PSCA CAR-T、PSCA-7×19CAR-T和PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T。

实施例2 CAR-T细胞对IL-7和CCL19的分泌

取实施例1制备的三种CAR-T细胞各2×10

如图1所示，PSCA CAR-T细胞的培养上清中无IL-7和CCL19，PSCA-7×19 CAR-T细胞的培养上清中只有CCL19、没有IL-7，PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T细胞的培养上清中只有IL-7、没有CCL19，与K562-PSCA共培养后，PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T分泌IL-7和CCL19。

说明PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T细胞可以利用IL-10信号肽顺利将IL-7分泌到胞外，同时CCL19的表达受到肿瘤抗原调控。

实施例3 CAR-T细胞的体外增殖实验

取实施例1制备的三种CAR-T细胞各2×10

结果表1所示，PSCA-7×19CAR-T由于不分泌IL-7，对CAR-T细胞没有促进增殖的作用；经过改造的PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T表达的IL-7可以顺利分泌到胞外，促进CAR-T细胞的增殖。

表1

实施例4 CAR-T细胞的体外迁移实验

取实施例1制备的三种CAR-T细胞各2×10

统计结果如图2所示，PSCA-7×19CAR-T相较于PSCA CAR-T可以招募到更多的T细胞，PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T被肿瘤抗原激活后招募到更多的T细胞，说明PSCA-secIL7×IL2pro-CCL19 CAR-T条件性表达CCL19，只有在识别肿瘤细胞后才会分泌CCL19，发挥招募作用，避免了炎症副反应。

综上所述，本发明的第四代CAR-T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> 一种第四代CAR-T细胞及其应用

<130> 202009

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu

1 5 10 15

Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp

35 40 45

Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg

50 55 60

Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu

65 70 75 80

Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

85 90 95

Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser

100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu

115 120 125

Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys

130 135 140

Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150

<210> 3

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

20 25 30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

35 40 45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

50 55 60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ser

<210> 4

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Val Arg Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

50 55 60

Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

165 170 175

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe

195 200 205

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 5

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

gacattcagc tgacccaatc tccaagctct ttgtccgcct ctgtggggga tagggtcacc 120

atcacctgca gtgccagttc aagtgtaaga ttcattcact ggtaccagca gaaaccagga 180

aaagctccca aaagactcat ctatgacaca tccaaactgg cttctggcgt cccttctagg 240

ttcagtggct ccgggtctgg gacagacttc accctcacca ttagcagtct gcagccggaa 300

gatttcgcca cctattactg tcagcagtgg agtagtagcc cattcacgtt cggacagggg 360

accaaggtgg agataaaagg cagtactagc ggcggtggct ccggaggcgg ctccggaggt 420

ggcggcagct cagaggttca gctggtggag tctgggggtg gccttgtgca gccagggggc 480

tcactccgtt tgtcctgcgc agcttctggc ttcaacatta aagactacta tatacactgg 540

gtgcgtcagg cccctggtaa gggcctggaa tgggttgcat ggattgatcc tgagaatggt 600

gacactgaat ttgtcccgaa gttccagggc cgtgccacta taagcgcaga cacatccaaa 660

aacacagcct acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 720

aaaacggggg ggttctgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcgagcga gcccaaatct 780

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggcc 54

<210> 7

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60

gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120

ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 180

cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta 240

aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa 300

ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 360

gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420

tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacac 456

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctttaaggc aagctttaag gcaagcttta aggcaaagat ctagactcta gagggtatat 60

aatggaagct cgaattccag cttggcattc cggtactgtt ggtaaaaagc ttggcaatcc 120

ggtactgttg gtaaagccac c 141

<210> 9

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact ggctggggat 60

gtagaaagca atccaggtcc a 81

<210> 11

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catct 75