一种用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变的引物、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变的引物、探针、试剂盒及检测方法，属于ASXL1基因突变检测技术领域。

背景技术

ASXL1基因编码一个染色质结合蛋白，这是正常确定发育中胚胎的片段特性所必需的。该蛋白是多梳蛋白组的一员，是维持稳态和其他基因座稳定抑制所必需的。这种蛋白质被认为会破坏局部区域的染色质，增强某些基因的转录，同时抑制其他基因的转录，在染色质重组和基因转录调控中起着重要作用。

ASXL1基因突变在多种血液肿瘤中都有发生，在多种髓系肿瘤患者的造血细胞中都发现了ASXL1突变，包括慢性粒单核细胞白血病(43％)、骨髓增生异常综合征(14％)、骨髓增殖性肿瘤(10％)和急性髓系白血病(20％)等。ASXL1突变主要以移码突变和无义突变为主，ASXL1突变的广泛性表明它可能在髓系肿瘤的发病机制和恶性转化中发挥着重要作用。ASXL1大多数突变都发生在12号外显子上，移码突变和无义突变导致了C端的截短，最终影响到了蛋白的功能。

ASXL1最常见的一个突变是ASXL1 NM_015338.5:c.1934dup；p.Gly646Trpfs*12(ASXL1 c.1934dupG)，由8个G的重复突变成了9个G重复，几乎占了体细胞截短突变的一半。这种重复序列的突变可能是由于在复制过程中复制滑移导致的。在2010年Abdel-Wahab,O.等报道ASXL1 c.1934dupG并不是一个真正的体细胞突变，他们采用Sanger测序的方法，分析认为是假阳性结果造成的。而在2017年Yannakou,C.K.等采用了荧光定量的方法，确定了ASXL1 c.1934dupG是一个真正的体细胞突变，然而其检测灵敏度为3％。分析认为用Sanger测序方法时，为了减少假阳性必须使用高保真酶。另外，也有用二代测序来检测这个突变的文献报道(Alberti,M.O.等2018，Montes-Moreno,S.等2018)，不过其灵敏度通常都是5％。因此ASXL1 c.1934dupG这个突变的检测不但受到复制酶影响，而且其检测灵敏度还是比较低，满足不了目前临床需求。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术准确性及灵敏度低等缺陷，本发明提供了一种用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变的引物、探针、试剂盒及检测方法，本发明针对目的位点设计了引物及特定的探针，能够简便准确高灵敏的对ASXL1基因c.1934dupG突变进行定性定量检测。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一对检测ASXL1基因c.1934dupG突变的PCR扩增引物，其扩增片段中包含有c.1934这个位点。

上游引物为：5’-CGAGAGGTCACCACTGCCATAG-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物为：5’-ACAGGCCTCACCACCATCAC-3’(SEQ ID NO:2)。

一对能分别和ASXL1基因c.1934位点8G和9G重复序列特异性结合的taqman探针：

能够和野生型8G结合的探针：5’-VIC-CCACCCCCCCCTCCGATGG-BHQ1-3’(SEQ IDNO:3)，

能够和突变型9G结合的探针：5’-FAM-CACCCCCCCCCTCCGATGG-BHQ1-3’(SEQ IDNO:4)。

上述探针5’端分别用FAM和VIC荧光基团修饰，3’端用BHQ1淬灭基团修饰。

一种用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变的试剂盒，包括所述的引物和所述的探针。

所述的引物、所述的探针、或所述的试剂盒在检测ASXL1基因c.1934dupG突变中的应用。

一种基于数字PCR技术检测ASXL1基因c.1934dupG突变的方法，包括以下步骤：

(1)将PCR预混液与待测的DNA模板、上述引物、上述探针混合，制备得到数字PCR混合液。

(2)将数字PCR混合液利用微滴生成仪制备成微滴，然后进行PCR扩增反应；

(3)利用微滴读取仪对PCR反应后的产物进行信号分析，在分析软件中根据不同的荧光信号来判断待测样本的突变情况，并计算突变模板的含量。

优选，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的条件为：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s；98℃，10min；4℃，终止；其中，94℃和60℃进行40个循环，升降温速度为2℃/s。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，利用微流控或微滴化方法，将核酸分子分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。经过PCR扩增后，有一个核酸分子模板的反应器就会产生荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。这样根据反应器的数量和含有荧光信号的反应器比例，就可以推算出原始溶液的核酸含量。数字PCR作为第三代PCR技术，具有定量快速准确等优势，广泛用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

Taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如BHQ、MGB等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一对特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。由于两个特异性探针的5’端荧光基团不同，这样就可以检测到不同的模板DNA。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1)本发明方法操作简便，结果不但可以定性还可以定量。

2)本发明方法对扩增酶没有特殊要求，准确性高，排除了现有方法假阳性高的问题。可以作为现有方法的一种验证方法。

3)本发明方法灵敏度高，可以有效检测ASXL1基因c.1934dupG突变。

附图说明

图1为使用本发明的方法检测ASXL1基因c.1934dupG突变的阴性结果图。

图2为使用本发明的方法检测ASXL1基因c.1934dupG突变的阳性结果图。

图3为使用本发明的方法检测ASXL1基因c.1934dupG突变的灵敏度结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物和探针设计

1.材料

所用数字PCR仪为Bio-Rad QX-200仪，所用ddPCR Supermix for Probes(nodUTP)及相关耗材均购自Bio-Rad公司。

2.血液基因组DNA提取

采集白血病患者全血2ml。取全血200ul，用天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取血液的基因组DNA，并用Thermo Fisher公司的Qubit3.0对DNA进行定量。

3.引物及探针序列设计

ASXL1-F上游引物：5’-CGAGAGGTCACCACTGCCATAG-3’(SEQ ID NO:1)

ASXL1-R下游引物：5’-ACAGGCCTCACCACCATCAC-3’(SEQ ID NO:2)

ASXL1-wt野生型探针5’-VIC-CCACCCCCCCCTCCGATGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)

ASXL1-mt突变型探针5’-FAM-CACCCCCCCCCTCCGATGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:4)

引物探针合成购自上海生工公司。

实施例2利用本方法检测ASXL1基因c.1934dupG突变

操作具体流程为：

1.按表1配置PCR反应体系：

表1

2.将配制好的20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG Oil)，盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将微滴发生卡底座放置到微滴生成仪中，进行微滴生成。生成的微滴在上面一行的反应孔内，从发生卡上层孔内吸取微滴转移至96孔板的内，然后使用PX1热封仪将96孔板封膜。

3.将封好膜的96孔板放入PCR仪中，运行如下反应程序：

注：升降温速度为2℃/s

4.结果分析：PCR反应程序结束后，将96孔板放入QX200微滴读取仪中进行微滴读取，在软件QuantaSoft上查看和分析结果。坐标轴channel1为FAM信号，channel2为VIC信号。将不同荧光信号的微滴分成4种类型，黑色无模板微滴(左下方)/绿色含野生型微滴(右下方)/蓝色含突变型微滴(左上方)/红色含野生型+突变型微滴(左上与右下之间)。当蓝色含突变型微滴数≥3个时判定为突变型，并计算突变率＝Fractional Abundance(a/a+b)。图1中只有黑色无模板微滴和绿色含野生型微滴，因此没有检测到突变。图2中含有4种类型的微滴，因此检测到突变，突变率为43％。

实施例3本方法检测ASXL1基因c.1934dupG突变的灵敏度

1.准备待测DNA样本：含有野生型DNA和突变型DNA的混合物，其中野生型DNA为40ng，突变型DNA按10倍梯度稀释。野生型DNA来源于健康人的血液DNA，突变型DNA来源于合成的突变型质粒。

2.检测方法按照实施例2流程进行。

3.结果分析：在梯度稀释的突变型样本中，检测到的突变率依次是6.0％、0.47％和0.042％。野生型样本没有检测到突变。见图3。因此使用本发明方法，可以检测到40ng基因组DNA中0.05％的突变。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 江苏吉诺思美精准医学科技有限公司

<120> 一种用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变的引物、探针、试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(上游序列Artificial Sequence)

<400> 1

cgagaggtca ccactgccat ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(下游序列Artificial Sequence)

<400> 2

acaggcctca ccaccatcac 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(野生型探针Artificial Sequence)

<400> 3

ccaccccccc ctccgatgg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(突变型探针Artificial Sequence)

<400> 4

cacccccccc ctccgatgg 19