与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记SIsv0523

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记。还涉及扩增该分子标记的引物，该分子标记和引物在谷子叶夹角基因定位或谷子遗传育种中的用途。

背景技术

谷子是起源于我国的重要粮食作物，也是特色抗旱作物，种子萌发只需要占其重量26％的水分，而高粱、小麦和玉米的种子萌发分别需要其重量的40％、45％和48％的水分，同时谷子对低土壤肥力的忍耐力较高。谷子是环境友好型C4作物，也是二倍体自花授粉作物，基因组约470M，非常适合作为基因组研究对象。

许多作物如小麦、水稻和玉米等作物通过培育理想株型新品种使其抗倒性、光能利用效率和产量水平得到显著提高。目前生产上应用的谷子品种大多是披散株型，对光照资源利用率低的品种，对光能利用效率不到1％。但谷子是C4植物，具有超高产的遗传生理。因此，培育具有理想株型的高光效谷子新品种对提高谷子单产水平具有重要意义。以作物叶片的着生角度及其在植株上的垂直分布为表征的叶群结构是决定作物株形的主要因素。它对群体内部的光分布和光合生产起重要作用。

叶夹角是高产和稳产的重要农艺性状，直接关系到谷子光能利用效率和抗倒性。针对谷子叶夹角分子标记及相关研究还需要进一步改进。

发明内容

谷子叶夹角作为高产和稳产的重要农艺性状，直接关系到谷子光能利用效率和抗倒。在谷子抽穗时，植株倒三叶叶片叶夹角小于25度，挺拔上冲，中下部叶片随叶位的降低适当增大与茎的夹角，属于叶夹角紧凑株型，从而使各叶层的入射光分布均匀，减少遮蔽，可以最大限度地利用光能。在谷子抽穗时，植株倒三叶叶片叶夹角大于25度为叶夹角非紧凑株型。借助分子生物学的手段，辨别紧凑型叶夹角以及非紧凑型叶夹角，应用于谷子作物的育种中，可以做到早甄别，早诊断。本发明的发明人通过研究发现与谷子叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记SIsv0523，借助该分子标记运用谷子全基因组分子辅助育种技术培育具有理想株型的谷子高产新品种。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有SEQ ID NO:1所示序列，优选地，所述分子标记为SEQ ID NO:1所示序列。SEQ ID NO:1序列如下所示：

TATCATTGGCACAAGGGACTAGTGCAATTATGTTATGATCCAAGGATAAATAGTTCTTCAATCTTTTTTGTCTGCTTCCTCTCCATCTGGATTGCCTAATCTTTTAGGATTCCAGATGGAATCATTAAGGTTCCTTTAACATTCCTTTAGGCCTCGTTCGTTTCACCAGGATTGGATTCCAGCTAGGATTACTTCCAGGTTCGGTTTGAGTGATTCCACCCGTATCACTCAATCCGGTCAGGATTCATTCCAAGGGTGAGGAGGTATGGTTTCAATCCGGGCCATCTAATGTAGAAGGATTCCAATCCAGGCCGGTTTTCGTTCCAGGCCAGACTAAAACGAACAACACTTTCAATGCAAGTCTGGTTTCAAATCGGGTCACTTCAAACCATCCGGAATGGACCTCATTCCGGGCCAATCCGGTGAAAACGAACGAGGTCTTAACAGGGTCTTGGTTGTGTTTCGTTTCTGTCCAACTTTTGTGTTTTCCGGATGACCTTAAATTGGTCTGAATCTGGCAACTCGGGTTGAATCGCTGCAAGTGCTCGCATCGTTGGGGCACTCAGTCTGGTGTCTAGATTCCAGGAGTGCGTAGATTGTTGCTGC(SEQ ID NO:1)。

本发明的发明人根据谷子全基因组序列，结合大量的数据分析和实验，发现了与谷子(Setaria italica L.Beauv.)叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记，记为SIsv0523。该分子标记能够将谷子基因组DNA与谷子叶夹角紧凑型基因联系起来，可以应用于谷子全基因组分子辅助育种中，缩短紧凑型谷子的育种年限。而且有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立。所述的分子标记与叶夹角紧凑型基因的遗传紧密连锁距离不超过2.3cM。应用该分子标记可以对谷子叶夹角紧凑型基因进行良好分型，为实现谷子叶夹角紧凑型的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持，可以简便、快速、高通量地应用于谷子辅助育种，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

在本发明的第二方面，本发明还提供了一种扩增与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3能够以叶夹角紧凑型谷子的基因组DNA为模板，特异性扩增含有SEQ ID NO:1所示的序列，特异性好。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列如下所示：SIsv0523F：5’-TATCATTGGCACAAGGGACT-3’(SEQ ID NO:2)；SIsv0523R：5’-GCAGCAACAATCTACGCACT-3’(SEQID NO:3)。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记是以叶夹角紧凑型谷子的基因组DNA为模板，通过使用本发明第二方面所述的引物对进行PCR扩增获得的。

根据本发明的实施例，所述叶夹角紧凑型谷子为包括选自安12-L262谷子、安12-L262与谷子A2不育系杂交后代、安12-L262与谷子A2不育系杂交后代自交产生的F2代中的至少一种。

对本领域技术人员而言，可以理解的是，可以借助于引物扩增的方式合成该分子标记，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。可以将该分子标记插入到表达载体上，进一步应用于育种领域。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种载体，含有本发明第一方面或者本发明第三方面所述的分子标记。所述载体可以为插入有上述分子标记的表达载体或者克隆载体。所述载体包括但不限于质粒、噬菌体等。

本领域技术人员根据需要，还可以将上述载体转化到合适的细胞中，获得含有上述载体的重组细胞，为此，在本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞，含有本发明第四方面所述的载体。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有检测本发明第一方面或第三方面所述的分子标记的试剂。进一步地，所述试剂包括本发明第二方面所述的引物对。利用含有上述引物的试剂盒，可以实现谷子中分子标记的检测，从而可以对谷子叶夹角紧凑型基因进行分型，为实现叶夹角紧凑型谷子的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持。根据本发明的实施例，所提供的试剂盒除了上述提到的引物，还可以含有PCR扩增常用试剂，例如dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、ddH

在本发明的第七方面，本发明提供了一种检测分子标记的方法，包括：根据分子标记设计引物，所述分子标记为本发明第一方面所述的分子标记；以被检测谷子基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，确定所述被测谷子中的所述分子标记。

根据本发明的实施例，所设计的引物包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列。

在本发明的第八方面，本发明提供了一种确定叶夹角紧凑型谷子的方法，包括：基于所述被测谷子中的分子标记，确定所述谷子是否为叶夹角紧凑型谷子，所述分子标记为本发明第一方面所述的分子标记。

根据本发明的实施例，所述确定叶夹角紧凑型谷子的方法进一步包括：获得所述被测谷子的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述引物包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；基于所述扩增产物，确定所述谷子是否为叶夹角紧凑型谷子。

应用包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物可以实现分子标记的特异性扩增，可用于今后的分子标记辅助育种中，比如通过检测被测谷子样本中是否只存在所提到的分子标记来筛选谷子叶夹角是否为紧凑型。根据本发明的实施例，基于所述扩增产物中仅存在本发明第一方面所述的分子标记，确定所述谷子为叶夹角紧凑型谷子。由于叶夹角紧凑型谷子的表型遗传为隐性遗传，因此，利用本发明的一对引物进行扩增，扩增产物仅存在本发明的分子标记的谷子叶夹角为紧凑型，不存在该分子标记的谷子叶夹角为非紧凑型，而存在两种分子标记，其中一种为本发明的分子标记的谷子，其叶夹角为非紧凑型。在利用所述引物进行检测时，可以采用PCR扩增的方法，具体地，可以使用上述提供的引物。当然还可以结合测序的方法进行。通过该方法确定叶夹角紧凑型谷子，可以应用于谷子的辅助育种中。该方法具有快速、简便、高通量的优点。

根据本发明的实施例，该方法可以应用于多种谷子样本中，包括但不限于安12-L262、A2不易系、安12-L262与A2不育系杂交后代、安12-L262与A2不育系杂交后代自交产生的F2代中的至少一种。其中，A2不育系、安12-L262与A2不育系杂交后代、安12-L262与A2不育系杂交后代自交产生的部分F2代为叶夹角非紧凑型；安12-L262、或安12-L262与A2不育系杂交后代自交产生的部分F2代为叶夹角紧凑型。

在本发明的第九方面，本发明提供了一种谷子叶夹角基因定位的方法，包括：使用本发明第一方面所述的分子标记、或本发明第二方面所述的引物对、或本发明第六方面所述的试剂盒对谷子叶夹角基因进行定位。

在本发明的第十方面，本发明提供一种谷子辅助育种方法，包括：使用本发明第一方面所述的分子标记、或本发明第二方面所述的引物对、或本发明第六方面所述的试剂盒对对谷子进行检测。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的通过引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对F2代400个单株扩增的部分结果。其中：

泳道4、6、8、17、19、20、21、22为F2代中8株叶夹角紧凑型的单株PCR扩增产物。泳道1、2、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、18、23、24为F2代中16株叶夹角非紧凑型的单株PCR扩增产物。泳道M为marker，其为D2000，其分子量包括2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，无论是“叶夹角紧凑型谷子”还是“谷子叶夹角紧凑型”都用来表达谷子的叶夹角呈现为紧凑型，用来表达谷子的叶夹角呈现出的一种状态，与之对应的是谷子的也夹角呈现出非紧凑型的状态。正如文中所提到的，在谷子抽穗时，植株倒三叶叶片叶夹角小于25度，挺拔上冲，中下部叶片随叶位的降低适当增大与茎的夹角，属于叶夹角紧凑株型，从而使各叶层的入射光分布均匀，减少遮蔽，可以最大限度地利用光能。在谷子抽穗时，植株倒三叶叶片叶夹角大于25度为叶夹角非紧凑株型。这种谷子叶夹角所呈现出的状态通常可以待谷子生长到一定阶段，结合经验直接通过观察确定，这种方法通常要待到谷子抽穗时，才能做出判断，是育种的一种浪费，还会影响作物产量。

本发明的发明人通过测序技术获得谷子基因组序列，根据大量的数据分析和实验，开发了一种与谷子(Setaria italica L.Beauv.)叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记(记为SIsv0523)，可应用于谷子全基因组分子辅助育种，缩短株型紧凑型谷子的育种年限。

在本文中，术语“与谷子叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子叶夹角紧凑型基因的遗传连锁距离小于3cM，优选小于2cM；或者在谷子的大于400个样本中，利用引物对SEQID NO:2和SEQ ID NO:3进行扩增，叶夹角紧凑型样本的扩增结果中只含有该分子标记。

所提供的分子标记包括SEQ ID NO:1所示序列。根据本发明的优选实施例，所提供的分子标记为SEQ ID NO:1所示序列。所提供的分子标记还可以为含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA片段，即包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，例如可以为谷子基因组中SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测谷子基因组DNA中的该分子标记，必然只能够检测或扩增得到含有SEQ ID NO：1所示的序列。该DNA片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10000bp、小于5000bp、小于2000bp、小于1500bp、小于1200bp、小于1000bp、或者小于800bp。

本发明还提供了一种扩增上述分子标记的引物对，该引物对包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列。

本发明还提供了上述分子标记或者上述引物对在谷子叶夹角紧凑型基因定位或检测中的用途。

本发明还提供了上述分子标记或者上述引物在谷子辅助育种中的用途。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：谷子遗传群体的构建

实施例1通过下述方法构建用于研究的谷子遗传群体，所用到的父本和母本样本信息分别如下所示：

所用到的父本为安12-L262，该父本样本为安阳农科院培育的谷子品种，叶片绿色，具有良好的株型性状，抽穗期倒三叶上冲，叶夹角紧凑，下部叶片叶夹角逐渐变大，刚毛短，纺锤型穗，穗小，可育。

所用到的母本为A2不育系，该母本样本为张家口市农科院培育的谷子不育系，目前在杂交谷子上应用较广泛的不育系，叶片黄色，整株叶片平展，抽穗期倒三叶叶夹角非紧凑，刚毛长，棍棒型穗，穗大，部分不育。

父本和母本杂交得到F

实施例2：父母本以及F

实施例2利用CTAB法分别提取父母本、F

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗，再转入离心管中，混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：15g的CTAB、75mL的1mol/L Tris.HCl(pH为8.0)、30mL的0.5mol/L EDTA、61.4g的NaCl，加去离子水定容至1L，使用前加入2ml的巯基乙醇，使巯基乙醇的终浓度为0.2ml/100ml。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。

(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

(6)将得到的父母本、F

实施例3：分子标记扩增引物的初步筛选

对父本进行de novo测序(60X contig N50:22K，scaffold N50:320K；Totalsize:400Mb)，母本进行重测序(10X)。

根据父母本测序数据，利用SOAP软件(例如SOAP2.20，可以从http://soap.genomics.org.cn/下载，也可以使用其它的序列比对软件)比较父母本之间的序列差异，然后基于差异的序列，在父本5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右长度的序列，用primer premier软件随机设计引物，一共1105对引物，下面的表1中列出了其中的部分引物的序列(SEQ ID NO:2-41)。

表1:1105对随机引物中的部分引物

分别以实施例2中提取的父母本及F

a.PCR反应体系：25μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL模板DNA、0.5μL引物(如SEQ ID NO:2所示)、0.5μL引物(如SEQ ID NO:3所示)、0.15μL dNTPs(10mM)、0.15μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)、2.5μL 10×PCR Buffer、ddH

b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，PCR扩增产物可以在4℃保存。

将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测，以检测引物的有效性和多态性。在此有效性是指是否具有扩增产物；多态性是指父母本间扩增产物的片段大小有差异。

按照如下的筛选标准进行引物的筛选：父母本及F

筛选结果：从随机设计的1105对引物中筛选出608对引物。

实施例4：谷子F

(1)遗传图谱构建

利用实施例3中筛选出的608对分子标记引物对F

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中以其中的一对引物为例，示出了相应的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。即引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对400个个体扩增的部分结果如图1所示。

图1中泳道4、6、8、17、19、20、21、22为F2代中8株叶夹角紧凑型的单株PCR扩增产物。泳道1、2、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、18、23、24为F2代中16株叶夹角非紧凑型的单株PCR扩增产物。泳道M为marker，其为D2000，其分子量包括2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。结果显示：叶夹角紧凑型的植株中条带大小为606bp一条带，叶夹角非紧凑型的植株中条带大小为312bp一条带或者606bp和312bp两条带。

将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将F

用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，SLincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。遗传连锁图上标明了608对引物的位置及与叶夹角紧凑型基因的遗传距离。

(2)基因定位

根据400个个体的叶夹角表型，与父本型性状相似的记为a(叶夹角紧凑型)，与母本型性状相似的记为b(叶夹角非紧凑型)，性状居于父本和母本之间的记为h，得到400个个体的表型数据，将400个个体的表型数据与之前得到的400个个体的基因型数据进行比较，相似高则代表该标记与叶夹角紧凑型性状紧密连锁。

根据上述结果将叶夹角紧凑型基因定位在遗传连锁图谱上。

实施例5：与谷子叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记的验证

1.在实施例4制得的遗传连锁图谱的基础上，根据与谷子叶夹角紧凑型基因的遗传连锁距离，在与谷子叶夹角紧凑型基因的遗传紧密连锁距离为2.3cM的位置确定了引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)，并找到对应的父本序列位置，上下游引物之间的序列即为分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.在实施例4中的对F

由此确定，SEQ ID NO:1所示序列可以作为与谷子叶夹角紧凑型基因紧密连锁的分子标记。

实施例6

实施例6以不同的谷子的基因组DNA模板，利用引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对这些不同的基因组DNA进行了扩增，并验证了能够获得如SEQ ID NO:1所示的分子标记。

具体以实施例2中提取的父本、或F

a.PCR反应体系：25μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL模板DNA、0.5μL引物F、0.5μL引物R、0.15μL dNTPs(10mM)、0.15μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2.5μL 10×PCRBuffer、ddH

b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，PCR扩增产物可以在4℃保存。

c.将扩增产物纯化，得到分子标记。经测序验证该分子标记如SEQ ID NO:1所示。

实施例7

实施例7提供了一种试剂盒，该试剂盒含有引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，以及PCR扩增的常用试剂，例如dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR buffer、ddH

利用该试剂盒以实施例2中提取的父本、或F

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市华大农业应用研究院

<120> 与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记SIsv0523

<130> PIDC3196514

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分子标记

<400> 1

tatcattggc acaagggact agtgcaatta tgttatgatc caaggataaa tagttcttca 60

atcttttttg tctgcttcct ctccatctgg attgcctaat cttttaggat tccagatgga 120

atcattaagg ttcctttaac attcctttag gcctcgttcg tttcaccagg attggattcc 180

agctaggatt acttccaggt tcggtttgag tgattccacc cgtatcactc aatccggtca 240

ggattcattc caagggtgag gaggtatggt ttcaatccgg gccatctaat gtagaaggat 300

tccaatccag gccggttttc gttccaggcc agactaaaac gaacaacact ttcaatgcaa 360

gtctggtttc aaatcgggtc acttcaaacc atccggaatg gacctcattc cgggccaatc 420

cggtgaaaac gaacgaggtc ttaacagggt cttggttgtg tttcgtttct gtccaacttt 480

tgtgttttcc ggatgacctt aaattggtct gaatctggca actcgggttg aatcgctgca 540

agtgctcgca tcgttggggc actcagtctg gtgtctagat tccaggagtg cgtagattgt 600

tgctgc 606

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

tatcattggc acaagggact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

gcagcaacaa tctacgcact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

gccatgccat ctgcgttctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

actctgatcg caacaaggac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

cttcacactt cccacttcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

aagtttgcga gcaagcacaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

cctttgcagc atctgtacgt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

ggtgtcacgc tcgatcgac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

ctccattgtg gtttgtccac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

ctcttgctat tgcgcatcct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

agccagctgg agaagagaat 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

cccaagtcca actgaaggc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 14

ctggaatagc cgtagctaat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 15

ccaacttgca acacgcaaat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 16

ggactgggtc atgaatactg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 17

atggactatt ggactgtatg t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 18

tcgtctccaa gccgtccagt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 19

ccaatgtatt ggccctaagc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 20

gctaaggttc cgatctgtct 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 21

cggatacgag tcgtgtttgt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 22

ccttcaacct gactttgcac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 23

catgacaagg atcgtcacag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 24

ccaagtgtgt atgcgacaag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 25

ccagcttgct taaggtatca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 26

gcagtgtgtt tctttcatgg 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 27

gcaatggttg atagatacga t 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 28

ttcgttggct gtagcgttga 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 29

gaagaaatca ccaacataac c 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 30

caggacatcg ccatggtact 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 31

atgaagcgag caagtgaact 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 32

tggattatgt ggagccatgt 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcattggtct tcttccaagg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 34

gtttctgcgc taatctgatc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 35

ccgaaatggt ggcaattgct 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 36

gagtatgtcg accgtagtac t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 37

gtgatggatt tgcttgtcac t 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 38

caggagcttt tgacagtgag 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 39

aggtacgctt cccttgtcat 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 40

cctacacacc gctataaacc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 41

atcgtgtacc cagctccgtt 20